专利名称：一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法
技术领域：
本发明属于疫苗稳定剂技术领域，特别是涉及一种一种可用于疫苗稳定剂的类 人胶原蛋白及其生产方法，利用基因工程技术改造酵母菌生产类人胶原蛋白。
背景技术：
胶原蛋白又称胶原，是由三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质，这类蛋白是人 体内含量最多的蛋白质。胶原蛋白的氨基酸组成有如下特征①、甘氨酸(glycine)约 25 30%，每隔两个其他氨基酸残基(X，Y)即有一个甘氨酸，其肽链可用(甘-X-Y) η表示。②、胶原中脯氨酸(Proline)约12 %，羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)约 10%, 一般动物性蛋白质中羟脯氨酸含量极少，另外丙氨酸(alanine)有11%，羟赖氨酸 (hydroxylysine)约0.5%。③、胶原中缺乏色氨酸，所以它在营养上为不完全蛋白质。由于胶原蛋白具有非抗原性、可生物降解、易吸收、无毒和生物相容等特性， 因此在医学材料领域备受青睐，被广泛用于手术缝合线、止血海绵、人工皮肤、人工血 管、人工角膜、药物载体，疫苗稳定剂等方面。很多疫苗对制备和保存过程的条件非常敏感，尤其是减毒活疫苗。为了保护生 物成分的完整性，在疫苗制备过程中通常加入稳定剂以确保免疫接种功效。一直以来， 能够作为疫苗稳定剂的物质包括糖，碱金属磷酸盐，谷氨酸盐，牛或人血清白蛋白，酪 蛋白水解物等，最主要的还有明胶。明胶(Gelatin)是胶原的水解产物，是一种无脂肪的 高蛋白，不含胆固醇，是保护疫苗稳定的优良选择，但其主要从动物皮提取获得。由于动物来源的胶原蛋白存在病毒隐患和易引发人体排异反应，因此采用分子 生物学技术制备重组人胶原蛋白有着各种传统提取方法不可比拟的优势。目前，国内外 报道的利用基因工程技术表达胶原蛋白的宿主有，微生物(大肠杆菌和酵母)，昆虫，哺 乳动物细胞等。由于大肠杆菌易培养，繁殖快，已有很多转基因药物成功表达的实例， 现已成为人们首选基因表达的载体。然而对于类人胶原蛋白来说，大肠杆菌存在致命的 缺陷，即大肠杆菌表达系统无法进行蛋白翻译后修饰，所以无法形成高级结构的胶原蛋 白。昆虫和哺乳动物细胞目前均处在实验室水平，虽然两者表达的重组胶原蛋白在结构 功能上更接近于人体胶原蛋白，但其成本高，生产周期较长等缺陷均又阻碍了它们的发 展。酵母是真核生物，具备分子伴侣蛋白和糖基化、羟基化、乙酰基化的酶，可以对一 些具有高级结构的蛋白在合成后进行一定的修饰，并且酵母细胞的培养条件，成本也较 哺乳动物细胞低得多，非常适合工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法， 一株新的酵母工程菌株，其可以利用人工合成类人胶原蛋白基因表达小分子量的类人胶 原蛋白。该酵母工程菌命名为毕赤酵母(Pichia sP.)，编号CGMCC No.4187。该菌种已
4经在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4187，保藏时间2010年9月20日。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为1. 一种人工合成类人胶原蛋白基因Cd，其碱基序列如下GAAGCTGGTTTGCCTGGTGCTAAGGGTCTGACTGGTTCTCCTGGTTCTCCCG GACCCGATGGTAAGACTGGACC CCCAGGACCAGCTGGTCAAGATGGACGTCCTGGACCTCCAGGCCCTCCAGG GGCCCGAGGCCAAGCAGGTGTTATGGGGTTTCCTGGACCAAAGGGAGCAGCCGGCGAGCCAGGTAAAGCCGGC GAAAGGGGTGTCCCAGGACCACCAGGTGCTGTGGGACCAGCCGGCAAAGACGGTGAGGCAGGTGCTCAGGGTCC ACCAGGACCTGCTGGTCCTGCTGGAGAAAGATAA其核酸长度为306bp。2.所述类人胶原蛋白的生产方法如下(1)所述酵母工程菌的构建方法①根据已知胶原蛋白氨基酸序列人工合成其基因序列，然后进行酵母密码子偏 好性的修饰，最终获得人工合成类人胶原蛋白基因Cd。②再将人工合成类人胶原蛋白基因col克隆至酵母表达载体pPICZa，命名为 pPICZ α /col ；。③利用电击转化方法将重组质粒pPICZ α /col转化至酵母细胞X_33。④最后利用PCR和测序的方法筛选正确的酵母转化子。(2)所述酵母工程菌的摇瓶诱导培养①固体培养基(YEPD)的成分及其每升含量为蛋白胨20克，酵母粉10克，葡 萄糖20克，琼脂粉15克。②固体培养条件将酵母工程菌接种到上述固体培养基的培养皿中，于 200C -50°C培养 3-5 天。③种子培养基的成分及其每升含量为蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母胆碱 YNB13.4克，甘油10毫升，磷酸钾缓冲液0.1摩尔，生物素0.4毫克。④种子液培养条件用无菌接种环从上述培养皿中取适量菌体，接种到已灭菌 的上述种子培养基中，20°C-50°C，220rpm摇床培养12-24小时。⑤摇瓶发酵培养基的成分及其每升含量为蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母胆 碱YNB13.4克，甲醇10毫升，磷酸钾缓冲液0.1摩尔，生物素0.4毫克。⑥摇瓶发酵培养条件收获酵母工程菌的种子液后，离心收集菌体，经发酵培 养基洗剂，按照体积比-30%接种量将酵母工程菌接种到上述摇瓶发酵培养基中， 200C -50°C, 100rpm-300rpm,期间需定期补充甲醇诱导维持体积比为0.5% -5%的浓 度，摇床培养1-10天。(3)所述类人胶原蛋白的粗提及验证酵母工程菌发酵结束，离心收集发酵上清液，然后加入质量百分比为60%-100%的硫酸铵或硫酸钠或氯化钠进行沉淀浓缩，最后离心收集沉淀，获得类人胶 原蛋白粗品；再经质量百分比为5%浓缩胶和10%-20%分离胶的SDS-PAGE凝胶检测。本发明的创新点在于获得了一条适用于酵母表达体系的人工合成类人胶原蛋白 基因，一株可表达小分子量类人胶原蛋白的酵母工程菌，表达的小分子量的类人胶原蛋 白可替代明胶用于疫苗稳定剂。本发明的优点在于，利用酵母基因工程菌生产的类人胶原蛋白不仅具有良好的 生物学特性，而且与动物来源的产品相比具有无病毒隐患、低排异反应等优良特性，故 经纯化后可替代动物来源的胶原蛋白应用于疫苗稳定剂。菌种保藏信息名称毕赤酵母(PichiasP.)，编号 CGMCC No.4187 ；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号CGMCCNo.4187 ；保藏时间2010年9月20日。
具体实施例方式实施例1表达载体的构建合成的外源片段以连接在质粒pUC57上的形式获得，将此质粒和真核表达载体 pPICZ α同时用EcoRI和XbaI两种酶进行双酶切，然后回收300bp大小的人工合成类人 胶原蛋白基因(参见
图1)和线性化的载体pPICZa。利用T4DNA连接酶将上述两片段进行连接，即构建成为表达载体pPICZ α / col。然后将连接体系转化至大肠杆菌感受态细胞，利用Sac I单酶切方法进行验证14个克 隆所提质粒，因正确质粒上仅含有1个Sac I酶切位点，所以酶切完毕出现质粒线性化的 为阳性结果，参见图2。并将筛选获得的11#，12#，14#三个质粒送去进一步测序验证， 最终比对结果显示12#和14#质粒含有正确、完整的人工合成类人胶原蛋白基因。实施例2酵母工程菌的构建1.质粒的线性化表达载体pPICZ α /col需线性化后转化毕赤酵母X_33感受态，此目的是为了得 到更高的转化效率。在本实验中，线性化后的表达载体由Sac I消化后回收所得。2.酵母细胞电转感受态的制备(1)在含5mlYPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，30°C过夜。(2)取0.5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2L摇瓶，过夜生长至 0D6001.5。(3)在4°C，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。(4)如上离心，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞。(5)如上离心，用20ml预冷的IM山梨醇悬浮细胞。(6)如上离心，用Iml预冷的IM山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。3.转化:(1)取80ul上述细胞与15ug线性化的表达载体pPICZ α /col (溶于5ulTE)混合，
转入预冷的0.2cm电转杯中。
(2)在冰上放置lOmin。(3)调整电穿孔仪参数电压1.5KV ；电容25 μ F ；电阻200 Ω。电击样品，电 击时间为4.6msec。(4)立即加入Iml预冷的IM山梨醇至杯中，将内容物转移至1.5ml的离心管中。 30°C培养箱放置2小时。(5)分成200ul等份，涂于含博莱霉素的YEPD固体培养基平板上。(6)在30°C孵育平板至克隆产生。实施例3重组酵母工程菌的筛选1.菌落PCR验证待转化的YEPD平板上长出单克隆，经菌落PCR方法初筛阳性克隆，再以酵母 基因组为模板扩增目的片段并送去测序。最终从200多个转化子中最终得到了 9个酵母 工程菌的阳性克隆，参见图3。2.摇瓶发酵验证上述酵母工程菌的阳性克隆还需通过摇瓶发酵实验进一步验证类人胶原蛋白的 表达情况。毕赤酵母X-33是增体积发酵，先利用种子培养基培养种子，然后离心收集菌 体转接至以甲醇为碳源的摇瓶发酵培养基中继续培养，每隔12小时补加体积比为0.5%的 甲醇进行诱导，发酵至96小时结束，收集上清液，经质量百分比为60%的硫酸铵盐析沉 淀获得最终样品。最后用质量百分比为5%浓缩胶和15%分离胶的SDS-PAGE凝胶电泳 检测类人胶原蛋白，参见图4。与对照(含有空白表达载体pPICZa的酵母X-33菌株) 相比，3#菌株在预期蛋白大小处(约12.8KD)有表达条带。质量百分比为5%浓缩胶和 15%分离胶的配方如表1所示表1 SDS-PAGE 凝胶配方
权利要求
1.一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白，其特征在于，由酵母工程菌发酵获得， 该酵母工程菌命名为毕赤酵母(Pichia Pastoris) X-33/col CGMCCNo.4187。
2.权利要求1所述酵母工程菌，其特征在于，其染色体上整合一种人工合成的类人胶 原蛋白基因col，其碱基序列如下GAAGCTGGTTTGCCTGGTGCTAAGGGTCTGACTGGTTCTCCTGGTTCTCCCGGA CCCGATGGTAAGACTGGACCCCCAGGACCAGCTGGTCAAGATGGACGTCCTGGACCTCCAGGCCCTCCA GGGGCCCGAGGCCAAGCAGGTGTTATGGGGTTTCCTGGACCAAAGGGAGCAGCCGGCGAGCCAGGTAA AGCCGGCGAAAGGGGTGTCCCAGGACCACCAGGTGCTGTGGGACCAGCCGGCAAAGACGGTGAGGCAGG TGCTCAGGGTCCACCAGGACCTGCTGGTCCTGCTGGAGAAAGATAA 其核酸长度为306bp。
3.一种权利要求1或2所述类人胶原蛋白的生产方法，其特征在于，(1)酵母工程菌的构建根据已知胶原蛋白氨基酸序列，经酵母密码子偏好性的修饰，最终获得人工合成类 人胶原蛋白基因col;再将人工合成类人胶原蛋白基因col克隆至酵母表达载体pPICZ α，命名为pPICZa/col ；利用电击转化方法将重组质粒pPICZ α /col转化至酵母细胞X-33 ； 最后利用PCR和测序的方法筛选正确的酵母工程菌；(2)酵母工程菌的摇瓶诱导培养固体培养基YEPD的成分及其每升含量为蛋白胨20克，酵母粉10克，葡萄糖20 克，琼脂粉15克；固体培养条件将酵母工程菌接种到上述固体培养基的培养皿中，于20°C-5(TC培 养3-5天；种子培养基的成分及其每升含量为蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母胆碱YNB13.4 克，甘油10毫升，磷酸钾缓冲液0.1摩尔，生物素0.4毫克；种子液培养条件用无菌接种环从上述培养皿中取适量菌体，接种到已灭菌的上述 种子培养基中，20°C-50°C，220rpm摇床培养12-24小时；摇瓶发酵培养基的成分及其每升含量为蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母胆碱 YNB13.4克，甲醇10毫升，磷酸钾缓冲液0.1摩尔，生物素0.4毫克；摇瓶发酵培养条件收获酵母工程菌的种子液后，离心收集菌体，经发酵培养 基洗剂，按照体积比-30%接种量将酵母工程菌接种到上述摇瓶发酵培养基中， 20 0C -50 °C, 100rpm-300rpm,期间需定期补充甲醇诱导维持体积比的0.5 % -5%的浓 度，摇床培养1-10天；(3)类人胶原蛋白的粗提及验证酵母工程菌发酵结束，离心收集发酵上清液，然后加入质量百分比为60%-100%的硫酸铵或硫酸钠或氯化钠进行沉淀浓缩，最后离心收集沉淀，获得类 人胶原蛋白粗品； 再经质量百分比为5%浓缩胶和10% -20%分离胶的SDS-PAGE凝胶检测。
全文摘要
一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法，属于疫苗稳定剂技术领域。由酵母工程菌发酵获得，该酵母工程菌命名为毕赤酵母(Pichia Pastoris)X-33/col CGMCC No.4187。生产方法包括人工合成类人胶原蛋白基因；含类人胶原蛋白基因酵母工程菌的构建及筛选；工程菌的摇瓶诱导培养；SDS-PAGE凝胶检测目的类人胶原蛋白。优点在于，利用酵母基因工程菌生产的类人胶原蛋白不仅具有良好的生物学特性，而且与动物来源的产品相比具有无病毒隐患、低排异反应等优良特性，故经纯化后可替代动物来源的胶原蛋白应用于疫苗稳定剂。
文档编号C12R1/84GK102020712SQ20101053968
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者党磊, 印红, 庞欣, 王小雪, 王玮, 齐文武 申请人:北京东方红航天生物技术股份有限公司