专利名称：野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及了一个野生茄子耐盐基因StBADH 抗除草剂植物表达载体。
背景技术：
近年来，由于受全球气候变暖、工业污染加剧和农民不合理耕作方式等因素影响， 我国土壤盐渍化的程度有逐年加重的趋势。由土壤盐渍化而导致的盐胁迫是抑制植物生 长、降低农作物产量和影响农作物品质的主要环境因素，严重制约着我国现代农业的发展。 研究植物耐盐分子机理和培育耐盐新品种，对开发利用盐碱地具有重要意义。利用转基因 技术将耐盐相关基因克隆并转化农作物，使其在农作物中过量表达，将会大幅提高农作物 的耐盐能力，也是解决我国土壤盐渍化问题的有效途径之一。在盐等渗透胁迫条件下，许多植物如甜菜、菠菜，都积累甜菜碱(Betaine)。甜 菜碱被认为是植物抗渗透胁迫最有效的渗透调节剂(参考文献Tarczynski MC, Jensen RG. Stress protection of transgenic tobacco by production of the osmolyte mannitol. Science. 1993,259 =508-510)。作为渗透调节物质，甜菜碱在植物体内由胆 碱经两步不可逆的氧化合成，催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(Choline Monooxyge-nase, CM0)禾口甜菜碱酸脱S酶(Betaine Aldehyde Dehydrogenase, BADH)； 其中BADH是合成甜菜碱的关键酶，催化甜菜碱醛氧化为甜菜碱(参考文献Rhodes D， Hanson AD. Quarternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1993,44 357-384)。由于植物体内甜菜碱的合成途径相对简单，进行遗传操作方便，在诸多耐盐基 因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有应用价值的耐盐基因之一(参考文献Nakamura T， Nomura Μ, Mori H, Jagendorf AT, Ueda A, Takabe Τ. An isozyme of betaine aldehyde dehydrogenase in barley. Plant Cell Physiology. 2001,42(10) : 1088-1092)。植物中导 入耐盐基因BADH，其耐盐性得到明显提高已有诸多报道Jia等(2002)构建了含山菠菜甜 菜碱醛脱氢酶BADH基因的重组双元植物表达载体pBin438，由农杆菌介导对番茄进行遗传 转化，120mmol · L^1NaCl培养条件下，获得转基因番茄中的甜菜碱脱氢酶活性和BADH mRNA 积累量显著高于野生型品种，转基因番茄对于高浓度盐胁迫表现出较强的耐受性(参考文 献:Jia GX, Zhu ZQ, Chang FQ, Li YX. Transformation of tomato with the BADH gene from Atriplex improves salt tolerance. Plant Cell Reports. 2002, 21 :141-146)。Guo 等(2000)以双元植物表达载体pABH9 (含BADH基因)为供体DNA，由农杆菌介导对小麦进 行遗传转化，盐胁迫条件下，转基因植株叶片的BADH活性比受体亲本提高1-3倍，植株相对 电导率比亲本明显低，表明转基因植株的细胞膜在胁迫时受伤害程度较轻(参考文献Guo BH,Zhang YM,Li HJ,Du LQ,Li YX，Zhang JS,Chen SY,Zhu ZQ. Transformation of wheat with a gene encoding for the betaine aldehyde dehydrogenase (BADH). Acta Botanica Sinica. 2000,42(3) :279_283)。
StBADH 基因是从野生茄子(Solanum torvum Swartz) iTorvum Vigor，中克隆出 来的一种新的耐盐基因，目前尚无该基因抗除草剂植物表达载体的相关报道。
发明内容
本发明目的是为解决提高农作物耐盐性和抗除草剂特性的问题，提供一种新的野 生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体及其构建方法。所构建的野生茄子耐盐基 因StBADH抗除草剂植物表达载体可直接用于农杆菌介导的盐敏感农作物遗传转化，创制 耐盐和抗除草剂新种质，提高盐敏感农作物的耐盐性和抗除草剂特性，可用于农作物品种 改良。本发明的技术问题可通过如下技术方案解决野生茄子耐盐基因StBADH，该基因的序列为SEQ ID NO. 1。野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体，由本发明所述的野生茄子耐 盐基因StBADH与抗除草剂植物表达载体构成。其中，所述的植物表达载体优选中间载体PCAMBIA3301-T800，该载体是通过分别 用EcoR I/Hind III双酶切全序列合成的pT800DNA片段和植物表达载体pCAMBIA3301，回 收PT800中843bp的片段与pCAMBIA3301中11273bp的大片段，连接所述两个片段得到的。野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体的构建方法，包括如下步骤1) 野生茄子耐盐基因StBADH的克隆选用野生茄子作为试验材料，取幼嫩叶片，提取总RNA，取其2μ g反转录cDNA，用 RNase消化cDNA产物，根据NCBI上公布的番茄(Solanum lycopersicum) amadh2序列信息 设计特异引物，进行高保真聚合酶链式PCR反应，在合成的野生茄子叶片cDNA中扩增含Sma I和Xba I两个酶切位点的StBADH，PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化；2) StBADH加多聚腺苷酸‘PolyA’尾反应按照DNA Α-Tailing试剂盒说明，以步骤1)得到的PCR纯化产物为反应底物， 在StBADH基因3’端加上多聚腺苷酸‘PolyA’尾；StBADH加‘PolyA，尾反应的产物连入 PMD19-T载体中，转化T0P10感受态细胞，测序验证，得到pMD_StBADH ；3)中间载体 pCAMBIA3301-T800 的构建全序列合成含有CaMV35S启动子、pUC18Polylinker多克隆位点、Nos终止子的 PT800DNA片段(见SEQ ID N0. 2)，其中，CaMV35S启动子的上游和Nos终止子的下游分别引 入了 EcoRI和HindIII酶切位点；所述的pT800 DNA片段与植物表达载体pCAMBIA3301 (含 bar 基因)分别 EcoRI (Promega) /Hind III (Promega)双酶切，回收 pT800 中 843bp 的片段 与pCAMBIA3301中11273bp的大片段(含bar基因)，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化 T0P10感受态细胞，质粒用AxyPr印质粒DNA小量试剂盒提取纯化，EcoR I (Promega) /Hind III (Promega)双酶切验证，得到构建成功的中间载体pCAMBIA3301_T800 (含bar基因)；4) StBADH抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH_T800的构建含Sma I和Xba I两个酶切位点的pMD-StBADH与中间载体pCAMBIA3301_T800 (含 bar 基因)分别 Sma I (Promega) /Xba I (Promega)双酶切，回收 pMD-StBADH 中 1522bp 的小片段与PCAMBIA3301-T800中12107bp的大片段(含bar基因)，用T4DNA连接酶 连接，连接产物转化T0P10感受态细胞，质粒用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取纯化，
4Sma I (Promega)/Xba I (Promega)双酶切验证，得到构建成功的抗除草剂植物表达载体 pCAMBIA3301-StBADH-T800 (含 bar 基因)。有益效果1.本发明将野生茄子耐盐基因StBADH克隆至含有抗除草剂基因(bar基因)的中 间载体pCAMBIA3301-T800中，StBADH基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成 甜菜碱生物合成关键酶，植物体内积累甜菜碱，显著提高植物耐盐性。同时，bar基因的表 达产物膦丝菌素N-乙酰转移酶，能使植物抵抗以L-Phosphinothricin(膦丝菌素，PPT)为 活性成分的除草剂。2.本发明构建的野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体为野生茄子中 首次报道，可直接用于农杆菌介导的盐敏感农作物遗传转化，提高盐敏感农作物的耐盐性 和抗除草剂特性，创制耐盐和抗除草剂新种质，可进行农作物品种改良。
图1中间载体pCAMBIA3301-T800质粒EcoR Ι/HindIII双酶切检测琼脂糖凝胶电 泳分析；1:DL2000DNAMarker(TaKaRa)(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)，2 :pCAMBIA3301-T800/EcoR I/HindIII,3 :pCAMBIA3301-T800 质粒。图2质粒pMD-StBADH及其pCAMBIA3301-T800 Sma I/Xba I双酶切检测琼脂糖凝 胶电泳分析；1:DL2000DNAMarker(TaKaRa)(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)，2 :pMD-StBADH/Sma I/Xba I，3 :pMD-StBADH/Sma I/Xba I，4:pMD-StBADH/Sma I/Xba I，5 :pMD-StBADH/Sma I/Xba I，6 :pMD-StBADH 质粒，7 =IKbp DNAMarker(TaKaRa)(10Kb/9Kb/8Kb/7Kb/6Kb/5Kb/4Kb/3Kb/2Kb/lKb)，8 :pCAMBIA3301-T800/Sma I/Xba I，9 :pCAMBIA3301-T800/Sma I/Xba I，10 :pCAMBIA3301-T800 质粒。图3抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH-T800质粒图谱。
具体实施例方式实施例1.野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体的构建1)野生茄子耐盐基因StBADH的克隆选用野生茄子(Solanum torvum Swartz) iTorvum Vigor，(为日本砧木品种，购自 日本Takii种苗株式会社)作为试验材料，幼苗长至4-5片真叶时，进行IOOmmol · L^1NaCl 胁迫处理，连续处理5天，取幼嫩叶片，按照Total RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明提取总 RNA，按照东洋纺(上海)生物技术有限公司cDNA合成试剂盒ReverTra Ace-a- 说明取2 μ g总RNA反转录成cDNA，用RNase (TaKaRa)消化cDNA产物。根据NCBI上公布的番茄 amadh2的序列信息(GenBank登录号:FJ228482. 1)，经Primer PREMIER 5软件(加拿大 Premier公司)分析设计特异引物，上游引物Ml序列为SEQ ID NO. 3，下游引物M2序列为 SEQ ID NO. 4，进行高保真PCR反应，在野生茄子叶片cDNA中扩增含Sma I和Xba I两个酶 切位点的StBADH。高保真PCR 扩增体系cDNA 模板 1. 0 μ L(60ng)，5XPrime STAR Buffer 4· 0μ L(Mg2+plus，5XMg2+浓度为 5mmol · L-1)，dNTP Mixture 1· 6μ L(各 2. 5mmol · L-1)， Ml (SEQ ID NO. 3) 1. 0 μ L (10 μ mol ‘ L-1), Μ2 (SEQ ID Ν0· 4) 1· 0 μ L (10 μ mol · L-1)，Prime STAR HS EnzymeO. 4 μ L，ddH20 11 μ L ；高保真PCR扩增程序95°C预变性5min，98°C变性10s，55. 0°C退火15s，72°C延伸 Imin 40s，30个循环后，72°C总延伸5min ；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化；2) StBADH加多聚腺苷酸‘PolyA’尾反应按照DNA A-Tai 1 ing试剂盒(TaKaRa)说明，以步骤1)回收纯化得到的PCR产物 为反应底物，在StBADH基因3’端加上多聚腺苷酸‘PolyA’尾；反应体 % =IOXA-Tailing Buffer 2 μ L, dNTP Mixture 1.6yL(各 2. 5mmol · I71)，Α-Tailing Enzyme 0. 2 μ L, StBADH10 μ L(2 μ g)，Ckffl2O 6. 2 μ L ；反应程序为72°C反应20min，冰中静置2min ；StBADH基因3，端加上多聚腺苷酸‘PolyA，尾反应的产物连入pMD19_T载体 (TaKaRa)中，连接反应体系(10 μ L) :pMD19_T载体1 μ L，StBADH加‘PolyA，尾反应的产物 4 μ L, Solution I 5 μ L ;16°C过夜反应，取10 μ L连接产物转化T0P10感受态细胞(南京天 为生物技术有限公司)，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-硫代半乳糖苷(X-Gal)、异丙 基_硫代_ β -D-半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板培养基(南京基天生 物技术有限责任公司)上37°C过夜培养，挑取阳性单克隆(白色菌落)，在含有氨苄青霉素 (Amp)的LB液体培养基(南京基天生物技术有限责任公司)中37°C过夜扩大培养后，质粒 用AxyPr印质粒DNA小量试剂盒(AXYGEN)提取纯化，测序验证，得到pMD_StBADH ；3)中间载体 pCAMBIA3301-T800 的构建。全序列合成含有CaMV35S启动子、PUC18 Polylinker多克隆位点、Nos终止子的 PT800DNA片段(见SEQ ID N0. 2)，其中，CaMV35S启动子的上游和Nos终止子的下游分别 引入了 EcoRI (Promega)和HindIII (Promega)酶切位点(北京鼎国昌盛生物科技有限公 司)；pT800DNA片段(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)与pCAMBIA3301 (澳大利亚 国际农业分子生物学应用中心)分别EcoR I (Promega)/Hind III(Promega)双酶切，回收 PT800中843bp的片段与pCAMBIA3301中11273bp的大片段，按4 1的比例用T4DNA连接 酶(TaKaRa)连接，连接产物转化T0P10感受态细胞(南京天为生物技术有限公司)，质粒用 AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(AXYGEN)提取纯化，进行双酶切验证①取pT800DNA 片段与植物载体 pCAMBIA3301 各 15 μ L，分别用 EcoR I (Promega) 和 HindIII(Promega)双酶切，50yL 酶切反应体系10XE Buffer 5 μ L, 100 X BSA
0.5yL，质粒 pT800DNA 片.段或 pCAMBIA330115 μ L(彡 1 μ g)，EcoR I 1. 25 μ L, HindIII
1.25μ L，补ddH20至50μ L，37°C反应3h ；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收 试剂盒(AXYGEN)回收pT800中843bp的片段与pCAMBIA3301中11273bp的大片段；
②用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收pT800中843bp的片段与pCAMBIA3301中 11273bp的大片段，按4 1的比例用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接，连接反应体系(25 μ L) IOXT4 IigaseBuffer 2. 5 μ L, ρΤ800 片段 8 μ L，pCAMBIA3301 大片段 2 μ L，T4DNA 连接酶 1 μ L，ddH20 11. 5 μ L ; 16°C过夜连接反应，取10 μ L连接产物转化Τ0Ρ10感受态细胞(南京 天为生物技术有限公司)，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-硫代半乳糖苷(X-Gal)、异丙 基_硫代_ β -D-半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板培养基(南京基天生 物技术有限责任公司)上37°C过夜培养，挑取阳性单克隆(白色菌落)，在含有氨苄青霉素 (Amp)的LB液体培养基(南京基天生物技术有限责任公司)中37°C过夜扩大培养后，质粒 用 AxyPr印质粒DNA小量试剂盒(AXYGEN)提取纯化，EcoR I (Promega) /Hind III(Promega) 双酶切验证，结果见图1，得到构建成功的中间载体PCAMBIA3301-T800 ；4)抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH-T800的构建含Sma I和Xba I两个酶切位点的pMD_StBADH与中间载体pCAMBIA3301_T800 分别 Sma I (Promega)/Xba I (Promega)双酶切，回收 pMD_StBADH 中 1522bp 的小片段与 PCAMBIA3301-T800中12107bp的大片段，按4 1的比例用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接， 连接产物转化TOPlO感受态细胞(南京天为生物技术有限公司)，质粒用AxyPr印质粒DNA 小量试剂盒(AXYGEN)提取纯化，进行双酶切验证①取质粒pMD-StBADH 与 pCAMBIA3301_T800 各 15 μ L，分别用 Sma I (Promega) / XbaI (Promega)双酶切，50 μ L 酶切反应体系Multi_Core Buffer 5 μ L, 100 XBSA 0· 5 μ L，质粒 pMD-StBADH 或 pCAMBIA3301_T80015 μ L (彡 1 μ g)，Sma I 1. 25 μ L，补 ddH20 至50μ L，25°C反应3h ；65°C保温lOmin，待冷却后再加入XbaI 1. 25μ L，37°C反应3h ；酶 切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析(图2)，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收pMD-StBADH中 1522bp的小片段与pCAMBIA3301-T800中12107bp的大片段；②用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收pMD-StBADH中1522bp的小片段与 PCAMBIA3301-T800中12107bp的大片段，按4 1的比例用T4DNA连接酶(TaKaRa)连 接，连接反应体系(25μ L) :10XT4 ligase Buffer 2· 5 μ L，pMD-StBADH 小片段 8 μ L， PCAMBIA3301-T800 大片段 2μ L，T4DNA 连接酶 1 μ L，ddH20 11. 5 μ L ; 16 °C 过夜连接反 应，取10 μ L连接产物转化TOPlO感受态细胞(南京天为生物技术有限公司)，在含有 5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷(X-Gal)、异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、 氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板培养基(南京基天生物技术有限责任公司)上37°C过夜 培养，挑取阳性单克隆(白色菌落)，在含有氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(南京基 天生物技术有限责任公司)中37°C过夜扩大培养后，质粒用AxyPr印质粒DNA小量试剂盒 (AXYGEN)提取纯化，Sma I (Promega) /Xba I (Promega)双酶切验证，得到构建成功的抗除草 剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH-T800，图谱见图3。综上所述，本发明构建的野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体 pCAMBIA3301-StBADH-T800为野生茄子中首次报道，可直接用于农杆菌介导的盐敏感农作 物遗传转化，提高盐敏感农作物耐盐性和抗除草剂特性，消除盐碱地逆境对盐敏感农作物 的危害，可进行农作物品种改良。
权利要求
野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体，其特征在于由野生茄子耐盐基因StBADH与抗除草剂植物表达载体构成。
2.根据权利要求1所述的野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体，其特征在 于所述的抗除草剂植物表达载体为分别用EcoR I/Hind III双酶切全序列合成的pTSOODNA 片段和抗除草剂植物表达载体PCAMBIA3301，回收pT800中843bp的片段与pCAMBIA3301中 11273bp的大片段，连接所述两个片段得到的中间载体pCAMBIA3301-T800。
3.权利要求2所述的野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体的构建方法，其 特征在于包括如下步骤1)野生茄子耐盐基因StBADH的克隆选用野生茄子作为试验材料，取幼嫩叶片，提取总RNA，取其2 μ g反转录cDNA，用RNase 消化cDNA产物，根据NCBI上公布的番茄(Solanum lycopersicum) amadh2序列信息设计特 异引物，进行高保真聚合酶链式PCR反应，在合成的野生茄子叶片cDNA中扩增含Sma I和 Xba I两个酶切位点的StBADH基因，PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化；2)StBADH加多聚腺苷酸‘PolyA’尾反应按照DNA Α-Tailing试剂盒说明，以步骤1)得到的PCR纯化产物为反应底物，在 StBADH基因3’端加上多聚腺苷酸‘PolyA，尾；StBADH加‘PolyA’尾反应的产物连入 PMD19-T载体中，转化TOPlO感受态细胞，测序验证，得到pMD_StBADH ；3)中间载体pCAMBIA3301-T800的构建全序列合成含有CaMV35S启动子、PUC18 Polylinker多克隆位点、Nos终止子的 PT800DNA片段SEQ ID NO. 2，其中，CaMV35S启动子的上游和Nos终止子的下游分别引入了 EcoRI和HindIII酶切位点；所述的pT800片段与pCAMBIA3301分别EcoR I/Hind III双 酶切，回收PT800中843bp的片段与pCAMBIA3301中11273bp的大片段，用T4DNA连接酶连 接，连接产物转化TOPlO感受态细胞，质粒用AxyPr印质粒DNA小量试剂盒提取纯化，EcoR I/Hind III双酶切验证，得到构建成功的中间载体pCAMBIA3301-T800 ；4)StBADH抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH-T800的构建含Sma I和Xba I两个酶切位点的pMD_StBADH与中间载体pCAMBIA3301_T800分别 Smal/Xba I 双酶切，回收 pMD-StBADH 中 1522bp 的小片段与 pCAMBIA3301_T800 中 12107bp 的大片段，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化TOPlO感受态细胞，质粒用AxyPr印质粒DNA 小量试剂盒提取纯化，Sma I/Xba I双酶切验证，得到构建成功的抗除草剂植物表达载体 pCAMBIA3301-StBADH-T800。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及了野生茄子耐盐基因StBADH抗除草剂植物表达载体。本发明所述的野生茄子耐盐基因StBADH序列为SEQ ID NO.1，该基因的抗除草剂植物表达载体是将该StBADH基因插入到中间载体pCAMBIA3301-T800的Sma I/Xba I酶切位点间得到的。将该抗除草剂植物表达载体用于农作物遗传转化，大量合成甜菜碱生物合成的关键酶，将会提高其耐盐碱能力。同时，该抗除草剂植物表达载体中含有的bar基因的表达产物膦丝菌素N-乙酰转移酶，能使植物抵抗以L-Phosphinothricin(膦丝菌素，PPT)为活性成分的除草剂。
文档编号C12N15/82GK101979604SQ20101054155
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者朱月林, 杨立飞, 盖钧镒, 陈罡 申请人:南京农业大学