专利名称：与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
盐胁迫破坏植物体内的离子平衡，造成渗透胁迫，进而引起植物体内发生一系列的生理和代谢反应，影响植物的生长发育。今天全世界20%的农田受到高盐胁迫的影响， 高盐胁迫使作物产量降低，极大地影响了农业生产。由于植物的耐盐的复杂性，由多基因控制，利用传统育种的方法来提高作物的抗盐能力十分困难。利用基因工程手段改良作物的耐高盐能力，是我国以及世界农业急需解决的重大课题，也是当前生物和现代农业技术领域的研究热点。近些年来，人们在生理、生化、分子和遗传等层面上对植物耐盐机理做了大量工作。当前的研究认为，要达到离子平衡，植物必须要进行三方面的相互联系的调节。首先必须防止植物受到毒害，其次植物在逆境下要重建一个平衡的体内环境，最后生长必须可以恢复。因此，挖掘与这三方面相关的基因资源，筛选出有显著作用的基因，通过转基因来提高作物的抗盐能力，成为我们工作的重点。由于植物的抗盐能力是由多基因控制，单个功能基因的作用是十分有限的。转录因子能够调控下游一系列基因的表达，通过导入转录因子可以使作物的综合性状得到改
良ο
发明内容
本发明的一个目的是提供与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与植物抗盐性相关的蛋白，名称为LcDREB21，来源于羊草(Leymus chinensis)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)序列表中序列2自5’末端起第47位到第883位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列2由949个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第47 位-第880位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。含有所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体是在P3301-121载体的多克隆位点间插入所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体；所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段；(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含⑶S基因的片段；(3)将步骤⑴中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含⑶S基因的片段连接，得到重组载体P3301-121。所述pCAMBIA3301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。所述重组菌为重组酵母菌。扩增所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗盐性增强的转基因植物。所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥。可用现有的植物表达载体构建含有LcDREB21基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1302、pBinl9、 pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的与植物抗盐性相关蛋白的编码基因LcDREB21的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是小麦、水稻、玉米、短柄草等单子叶植物，也可以是拟南芥、烟草、 大豆、黄瓜、番茄、棉花、杨树、苜宿等双子叶植物。本发明所提供的与植物抗盐性相关蛋白的编码基因LcDREB21受高盐诱导，具有激活下游基因的能力，可作为植物抗盐基因工程的候选基因，用来改良植物的抗盐能力，对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值，在农业、畜牧业领域具有广阔的应用前景。
图1为经400mM NaCl处理的羊草幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图2为5' RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图3为LcDREB21基因的组织特异性表达分析结果。图4为LcDREB21基因在400mM NaCl处理不同时间下的表达结果。图 5 为 pBridge-BD_LcDREB21 的 PCR 鉴定结果。
图6为pBridge-BD_LcDREB21的双酶切鉴定结果。图7为转LcDREB21基因的酵母菌株及转空载体对照酵母菌株在不含His和Trp 的SD培养基上的生长情况。图8重组表达载体p3301-121_LcDREB21的构建过程图。图9为盐胁迫处理条件下转LcDREB21基因拟南芥抗盐性分析。图10为p3301-121载体的构建过程。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因的获得和功能验证一、与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因的获得1、植物材料处理及总RNA的提取以羊草(吉生一号，购自吉林省吉生羊草良种站)幼苗为材料，400mMNaCl处理10 小时后提取其总RNA，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。结果表明，所提取的 RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为^S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。2、利用妨4技术对羊草转录组进行测序首先利用MACS mRNA分离试剂盒(购自美天旎公司)处理上述步骤1提取的 RNA得到mRNA，然后反转录得到cDNA，将得到的cDNA插入λ -FLC-III载体然后包装，得到 1. IX 106个噬菌斑。噬菌体经过离体处理得到的质体转化大肠杆菌感受态细胞DHlOB (购自杰美公司)，然后用包装机器(Genetix公司)包装。包装完毕后转移到384微孔板，DNA 测序模板用RCA方法，使用TempliWii DNA扩增试剂盒(通用生物公司)得到。最后测序用BigDye Terminator v3. ICycle Sequencing Kit，在 ABI 3700 (应用生物系统公司) 测序仪上完成。得到的序列经拼接后用BLAST程序分析，发现经拼接后的DNA片段所在基因可能属于DREB转录因子。3、LcDREB21基因5'端序列的克隆根据步骤2中4M测序得到的序列设计引物，具体的引物序列如下LcDREB21R 5' -TGAAGTTATCCCTATTGCTCCGCATGAC-3‘。以步骤1提取的经400mM NaCl处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech 公司的5RACE试剂盒并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。反应体系为 1 μ L RNA, 1 μ L 5 ‘ -CDS primerA, 1 μ L SMART II A oligo, 1 μ L DTT(20mM)，1 μ L dNTPMix(10mM),luL MMLV ReverseTranscriptase, 2 μ L 5X First-Strand Buffer,2y L SterileH2O0 反应条件为70°C 2min，冰上 2min，42°C 1. 5h，72°C 7min。以获得的第一链cDNA为模板，引物LcDREB21R与引物UPM(Clontech公司，序列 5 ‘ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 ‘)配对进行 PCR 扩增；PCR 反应体系为5' -Race-Ready cDNA 0. 5 μ L, 10XUPM 1 μ L，10 μ M 的 LcDREB21R 0. 2μ 1, Master Mix 8. 3 μ L· 反应条件为先 94 °C 30s、72 °C 3min，5 个循环；然后 94 °C 30s、 70°C 30s,72°C 3min，5 个循环；最后 94°C 30s,68°C 30s,72°C 3min，25 个循环。
反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M ^i*DL2000Plus DNA Marker (北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为5' RACE PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为IOOObp的目的片段。回收并纯化5' RACE产物，将其连接到PMD-18T载体(购自TaKaRa公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。结果表明，该片段的长度为949bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。3、LcDREB21基因全长cDNA序列的获得及PCR检测利用DNAMAN和OMIGA软件对步骤2获得的DNA片段进行生物信息学分析，该片段序列全长949bp，自5'末端第47位到第880位为0RF，编码序列如序列表中序列1所示的蛋白质，该蛋白质由278个氨基酸残基组成，将该蛋白命名为LcDREB21。二、LcDREB21基因的组织特异性表达分析分别提取步骤一中经400mM NaCl处理的羊草(吉生一号，吉林省吉生羊草良种站)幼苗的叶鞘、茎、叶、根、根茎芽、穗和根茎七种组织的总RNA。设计了 LcDREB21的 RT-PCR 一对引物 LcDREB21RTl 和 LcDREB21RT2，序列如下LcDREB21RT 1:5' -GTCCAGAGAATTCAAACTGC-3‘禾口
LcDREB21RT2 5‘ -TGAGAAAAGACTAAACCCGT-3‘。利用LcDREB21RTl和LcDREB21RT2进行RT-PCR分析，同时以Actin基因作为内标。反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。电泳结果表明LcDREB21在叶中表达最强，在根茎和穗中表达较弱。三、LcDREB21在高盐胁迫条件下的表达模式分析将正常生长8周的羊草(吉生一号，吉林省吉生羊草良种站)幼苗浸泡在高盐 (400mM NaCl)溶液中，分别在0、1、3、8、12和M小时取材。分别提取上述不同处理时间的羊草幼苗的总RNA，并进行RT-PCR分析，结果如图4所示。结果表明，400mMNaCl处理后， LcDREB21基因在1、3和8小时的转录水平明显得到提高，说明LcDREB21表达受到高盐诱导。四、LcDREB21转录激活功能验证根据上述实施例1扩增得到的LcDREB21基因设计引物，加入Mil和I3StI酶切位点，引物序列如下引物 1 GTCGACTGATGGAGACCGGGGGTAGCAA(下划线部分为 SalI 酶切位点)，引物2 CTGCAGCTAATATGAGAAAAGACTAA(下划线部分为 PstI 酶切位点)，以人工合成的序列表中序列2所示的LcDREB21基因为模板，进行PCR扩增，将扩增产物经Mil和I3StI酶切，回收酶切后的LCDREB21基因片段；同时，用Mil和I3StI 酶切酵母表达载体PBridge(购自CAMBIA公司)，回收载体大片段；将回收的载体大片段与回收的酶切后的LcDREB21基因片段连接，得到目的质粒。用引物LcDREB21RTl和 LcDREB21RT2对目的质粒进行PCR鉴定，结果如图5所示，泳道2为DL2000DNA分子量标准 (北京全式金生物技术有限公司)。泳道1为PCR产物，长度约为830bp的扩增片段。用 SalI和I^stI对目的质粒进行双酶切鉴定，结果如图6所示，其中，泳道1为15K DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)，泳道2为酶切产物的PCR扩增结果，获得了长度分别为6500bp和834bp的酶切产物。表明重组载体构建正确，将得到的重组载体命名为 pBridge-BD-LcDREB21。将重组载体 pBridge-BD_LcDREB21 导入到含有 His3 和 LacZ 报道子的酵母AH109株系(购自美国Clontech公司，商品目录号K1612-1)中，同时将酵母表达载体pBridge转入酵母AH109株系作为空载体对照，将pGAL4(购自美国Clontech公司)转入酵母AH109株系作为正对照。将三种转基因酵母菌在不含His和Trp的SD培养基(SD/-His-Trp)上进行培养，结果分别如图7中a和b所示。图7中a表示上述三种转基因酵母在SD培养基(SD/-His-Trp)上的生长情况，图7中b为将图7中a的酵母用含有 X-gal的Z-buffer显色后的情况。在图7中a和图7中b中，1为转LcDREB21基因的酵母菌株，2为转入pGAL4作为正对照的酵母菌株，3为转空载体对照酵母菌株。结果表明，转空载体对照酵母菌株在不含His和Trp的SD培养基上不能生长，而转LcDREB21基因的酵母菌株和转入PGAL4作为正对照的酵母菌株能够在不含His和Trp的SD培养基上生长并显蓝色。结果表明，LcDREB21基因具有转录激活活性。实施例2、转LcDREB21基因拟南芥植株的抗逆性分析一、获得转LcDREB21基因拟南芥植株根据上述实施例1扩增得到的LcDREB21基因设计引物，加入BamHI和)(baI酶切位点，引物序列如下引物 3 :ATGGATCCATGGAGACCGGGGGTAGCAAGC (下划线部分为 BamHI 位点)(序列表中序列3)，引物 4 :GTCTAGACTAATATGAGAAAAGACTAAACCCG (下划线部分为 XbaI 位点)(序列表中序列4)，以人工合成的序列表中序列2所示的LcDREB21基因为模板，用引物3和引物4进行PCR扩增，将扩增得到的含BamHI和)(bal酶切位点PCR产物克隆入pMD18Simple_T载体(TaKaRa 公司)，命名为 pMD18_LcDREB21。将 pMD18_LcDREB21 利用 BamHI 和 XbaI 进行双酶切，回收约840bp的LcDREB21基因片段，同时用BamHI和XbaI双酶切p3301_121载体，回收约14200bp的载体大片段，将回收的载体大片段与回收的约840bp的LcDREB21基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体P3301-121的 BamHI和)(bal酶切位点间插入了序列表中序列2第47bp到883bp所示的LcDREB21基因片段，证明质粒构建正确。将获得含有LcDREB21完整阅读框的植物双元表达载体命名为 p3301-121-LcDREB21，构建过程如图8所示。构建好的植物表达载体p3301-121_LcDREB21 通过冻融法转入农杆菌EHA105 (购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，进行除草剂抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，用阳性克隆菌液浸染拟南芥花序的方法进行拟南芥转化，转化后暗培养2天，进行第二次浸染，然后正常培养到收获种子。收获的种子在含除草剂抗性的平板(l/2MS+10mg/L草胺磷)上进行抗性筛选，筛选为阳性的苗，收获种子(Tl)，收获的种子在含除草剂的平板(l/2MS+10mg/L草胺磷)上种植，筛选后代分离比为 3 1的株系，收获其种子(T2)，用其小苗(T3)来做抗逆实验。按照获得转LcDREB21基因拟南芥的方法，将空载体P3301-121转化拟南芥植株，得到转空载体对照拟南芥植株。所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的(1)将 pCAMBIA3301 载体(购自 CAMBIA 公司)经过 Hind III 和 EcoR I 双酶切，回收llM6bp的载体大片段；(2)将pBI121载体(购自Clontech公司)(含35S启动子，GUS报告基因，Tnos) 也经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含⑶S基因的^42bp的片段；(3)将步骤⑴中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含⑶S基因的片段经 T4DNA酶连接，得到重组载体p3301-121 (图10)。二、转LcDREB21基因拟南芥植株的抗逆性分析将上述步骤一获得的转LcDREB21基因拟南芥植株的种子、转空载体对照拟南芥植株的种子和野生型拟南芥种子分别种于含除草剂培养基(l/2MS+10mg/L草胺磷)上，萌发生长(萌发生长条件为温度为22-24°C，16小时光照-8小时黑暗的光周期，空气湿度为 60% -80% ) 一周后，移栽到土中，在培养室培养(培养室培养的条件温度为22-24°C，16 小时光照8小时黑暗的光周期，空气湿度为50-60% ) 一周后进行400mM的NaCl胁迫处理 (将拟南芥苗浸入400mM的NaCl溶液中)。。胁迫处理12小时观察表型，观察到胁迫处理第7天。结果显示，转LcDREB21基因拟南芥苗在胁迫处理第7天有96%的植株没有明显的表型变化，而转空载体对照拟南芥苗全都出现了萎蔫变黄的盐害症状(图9，图中A为转空载体对照拟南芥苗，B为转LcDREB21基因拟南芥苗)。野生型拟南芥苗的表型与转空载体对照拟南芥苗表型一致。该实验结果表明本发明的LcDREB21基因可以增强转基因植物的抗盐能力。
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐性相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)-4) 中任一所述的基因.1)序列表中序列2自5’末端起第47位到第883位核苷酸所示的DNA分子；.2)序列表中序列2所示的DNA分子；.3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；.4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是在 P3301-121载体的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；所述P3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的.(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段；.(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含⑶S基因的片段；.(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段连接，得到重组载体P3301-121。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为重组酵母菌。
7.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中， 得到抗盐性高于所述目的植物的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入目的植物中。
10.根据权利要求8或9中所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物抗盐性相关的蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐性相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的与植物抗盐性相关蛋白的编码基因LcDREB21受高盐诱导，具有激活下游基因的能力，可作为植物抗盐基因工程的候选基因，用来改良植物的抗盐能力，对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义。
文档编号C12N15/63GK102464709SQ20101054866
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者刘公社, 彭献军, 李晓峰, 程丽琴, 马兴勇, 齐冬梅 申请人:中国科学院植物研究所