专利名称：一种光敏剂药靶的筛选方法
技术领域：
本发明属于生物医学和光动力学治疗技术领域，具体涉及一种光敏剂药靶的筛选 方法，该方法是以光敏剂为探针，利用人CDNA噬菌体展示库表面展示人不同种类蛋白的作 用，从噬菌体展示库中筛选光敏剂药靶的方法，以及利用光敏剂在一定波长受光激发从基 态跃迁到激发态的特性，作为光敏剂药靶存在的检测手段。
背景技术：
癌症的光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)是近年来颇受各国学者重视的 一种癌症新疗法。这种疗法是利用某些染料类光敏物质在癌组织中积聚的浓度高于周围的 正常组织，在激光等照射下可产生对细胞有破坏作用的单线态氧及自由基的特性，从而干 扰肿瘤细胞的生长并导致死亡[An Yen, et al , 1993] 0光动力学治疗(PDT)主要应用于 实体肿瘤的治疗，对某些晚期肿瘤、复发肿瘤和一些不适合手术的肿瘤，已在临床上得到了 较广泛的应用，一些光敏剂已被某些国家批准作为PDT药物，成千上万的癌症患者接受了 PDT，并取得了很好的疗效。目前国内外临床批准使用的光敏剂中效果较好的也是应用较为 广泛的如BPD-MA，m-THPC, 5-ALA在肿瘤组织中富集量比正常组织中倍数限于10-15倍左 右。因此，探索光敏剂富集于肿瘤细胞的机制，从而高效增强光敏剂与肿瘤细胞的特异亲和 力，是提高光动力学治疗效果的关键。本发明通过建立一种光敏剂药靶的筛选方法，并通过光敏剂的光学特性检测其与 光敏剂药靶的结合，且这种结合可被相应的抗体阻断，为寻找潜在的光敏剂药靶，及其在 PDT中介导光敏剂与肿瘤细胞的亲和奠定基础。这对于探索为何光敏剂富集于肿瘤细胞，以 及提高光动力学治疗效果意义重大。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种筛选光敏剂药靶的方法，该方法是从噬菌体展示 库中筛选与光敏剂结合的噬菌体，通过噬菌体载体外源基因的测定，进而确定该噬菌体表 面展示的蛋白为何种蛋白。本发明的一方面提供光敏剂PpIX在PBS (pH7. 4)溶液中的全波长扫描图谱，主要 确定其最大激发波长400nm的发射波峰为620nm，图谱见图1。本发明还提供一种光敏剂固相建立与评估的方法。本发明还提供一种检测噬菌体与光敏剂结合的方法。本发明还提供阻断光敏剂结合噬菌体与光敏剂结合的方法，具体是利用抗体封闭 光敏剂结合噬菌体表面蛋白，从而使光敏剂与之结合消失。本发明提供的光敏剂药靶的筛选方法，首先使光敏剂形成固相，然后以固相光敏 剂为探针，通过人类多肽噬菌体展示库与固相光敏剂的亲和淘洗作用，多轮富集筛选出与 光敏剂结合的噬菌体；采用PCR技术扩增噬菌体外源基因，并经基因测序与Blast比对分 析，确定该噬菌体表面展示蛋白，即确定一种或多种光敏剂结合蛋白；然后经抗体封闭噬菌体表面蛋白表位，检测其与光敏剂结合与否，该噬菌体丧失与光敏剂结合的特性。本发明中，所述的光敏剂是指，临床光动力学治疗领域所用的所有光敏剂，如吓啉 类光敏剂，吓吩类光敏剂等。本发明中，所述的卟啉类光敏剂PpIX在PBS (PH7. 4)溶液中的光波长扫描图谱如 图ι所示，其最大激发波长400nm，最大发射波长620nm。所述的固相光敏剂建立与评估方法，是将光敏剂吸附于聚苯乙烯或葡聚糖材质孔 板的特性，利用光敏剂受特定波长激光激发发出特定发射波长的特性，建立并评估光敏剂 固相效果。本发明中，所述的从噬菌体展示库中筛选出与光敏剂结合噬菌体，具体步骤如 下1)光敏剂包被于聚苯乙烯或葡聚糖材质孔板；2)噬菌体展示库加入孔板中与固相光敏剂37°C孵育；3)洗去未结合的光敏剂，加入培养至0D600约为0.6的噬菌体宿主菌；4)37°C轻摇培养后，噬菌体已进入其宿主菌内；5)将孔板中菌液转入新鲜LB液体培养基中培养，以扩增噬菌体；6)离心获得上述5)噬菌体后，再加入光敏剂固相中，如此循环筛选四轮，富集与光敏剂 结合的噬菌体。本发明中，所述筛选出与光敏剂结合的噬菌体，其中，确定光敏剂结合噬菌体的检 测方法为，利用噬菌体侵染宿主菌的特性，使光敏剂结合噬菌体侵染宿主菌形成部分溶原 性噬菌体，然后通过检测宿主菌与光敏剂的结合，检测噬菌体的存在。本发明中，所述的检测光敏剂结合噬菌体与光敏剂结合的方法，具体步骤如下1)将经过四轮筛选的光敏剂结合噬菌体与其宿主菌成噬菌斑效应；2)噬菌斑原位转移到醋酸纤维素NC膜上；3)NC膜经洗去其表面的噬菌体宿主菌后，与光敏剂孵育半小时；4)洗去未结合于噬菌斑的光敏剂；5)荧光显微镜下RFP通道激发NC膜；6)与光敏剂结合的噬菌斑会发红光；7)原位挑取与光敏剂结合的噬菌斑单克隆，于培养至0D600约为0.6的宿主菌中扩增培养；8)取上述宿主菌与噬菌体的混合液，涂玻片固定细菌后，加入光敏剂，孵育一段时候 后，洗去未结合的光敏剂；9)荧光显微镜下RFP通道下进一步验证与PpIX结合的噬菌斑发红光。本发明中，所述的抗体封闭噬菌体表面蛋白后，检测其与光敏剂结合与否的方法， 具体步骤如下1)上述步骤8)中宿主菌与噬菌体的混合液，涂玻片后，加入噬菌体表面展示蛋白的抗 体封闭，再加入光敏剂孵育一段时间，洗去未结合的光敏剂；2)荧光显微镜下RFP通道下观察，与PpIX结合的噬菌斑结果不发红光。
图1光敏剂PpIX随着浓度增加，其受400nm激发所产生的光强度图。图2光敏剂包被效果检测图。图3为利用多功能酶标仪M5全波长扫描功能检测光敏剂PpIX在PBS (pH7. 4)溶 液中的激发光为400nm的发射波谱全波长扫描图谱。图4为光敏剂结合噬菌体与光敏剂PpIX结合检测的荧光图。A. PBS ；B.空白对照；C. Pl ；D.抗体封闭后噬菌体荧光。
具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法 进行。如 Sambrook 等分子克隆实验手册(New York: Cold Spring Harbor Labortary Press, 1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。实施例1光敏剂PpIX全波长扫描。1)光敏剂 PpIX 溶于 PBS(pH7. 4)中，PpIX浓度为 200ng/ml，分别取 200μ 1 于 96 孔板中测定。2)多功能酶标仪Μ5利用全波长荧光扫描，固定激发波长，测发射波谱，固定发射 波谱，测定激发波谱。3)从以上波谱中读出PpIX的最大激发波长为400nm和最大发射波长620nm。实施例2光敏剂固相。1) PpIX在PBS溶液中，随着浓度的增加，其400nm激发光下，光强度的变化曲线测定。2)黑色荧光底透板(96孔)包被光敏剂量分别为10叫，50叫，100叫，200叫，每个浓度重复三孔，4°C过夜。3)洗去包被于96孔板的光敏剂，拍干孔内水分后，利用M5 400nm激发光测定 PpIX光强度。4)结果表明包被200ng光敏剂于200 μ 1孔板内，光敏剂受400nm光激发光强度最强。实施例3光敏剂结合噬菌体的筛选。1) 200ng光敏剂PpIX包被于孔板。2)人肝cDNA T7 Select 10_3b噬菌体展示库(滴度为10_9)加入孔板中与固相光 敏剂37°C孵育。3)洗去未结合的光敏剂，加入培养至0D600约为0. 6的噬菌体宿主菌BLT5403。4) 370C 50rpm轻摇培养后，通过竞争结合，噬菌体进入其宿主菌内。5)将孔板中菌液转入新鲜LB液体(羧卞抗性)培养基中培养，以扩增噬菌体。6)离心获得上述5)噬菌体后，再加入光敏剂固相中，如此循环筛选四轮，富集与 光敏剂结合的噬菌体。实施例4光敏剂结合噬菌体的荧光检测。1)将经过四轮筛选的光敏剂结合噬菌体与其宿主菌成噬菌斑效应。
2)噬菌斑原位转移到醋酸纤维素NC膜上。3) NC膜经洗去其表面的噬菌体宿主菌后，与光敏剂孵育半小时。4)洗去未结合于噬菌斑的光敏剂。5)荧光显微镜下RFP通道激发NC膜。6)与光敏剂结合的噬菌斑会发红光。7)原位挑取与光敏剂结合的噬菌斑单克隆，于培养至0D600约为0. 6的宿主菌中扩增培养。8)取上述宿主菌与噬菌体的混合液，涂玻片固定细菌后，加入光敏剂，孵育一段 时候后，洗去未结合的光敏剂。9)荧光显微镜下RFP通道下进一步验证与PpIX结合的噬菌斑发红光。实施例5抗体阻断实验。1)利用T7 Select噬菌体载体T7正反向引物，PCR扩增T7噬菌体外源基因，经 测序后NCBI Blast，确定其外源基因序列及其表达的蛋白质序列。2)上述6. 8)中宿主菌与噬菌体的混合液，涂玻片后，加入噬菌体表面展示蛋白的 抗体封闭，再加入光敏剂孵育一段时间，洗去未结合的光敏剂，3)荧光显微镜下RFP通道下观察，与PpIX结合的噬菌斑结果不发红光。表1
权利要求
1.一种光敏剂药靶的筛选方法，其特征在于，首先使光敏剂形成固相，然后以固相光敏 剂为探针，通过人类多肽噬菌体展示库与固相光敏剂的亲和淘洗作用，多轮富集筛选出与 光敏剂结合的噬菌体；采用PCR技术扩增噬菌体外源基因，并经基因测序与Blast比对分 析，确定该噬菌体表面展示蛋白，即确定一种或多种光敏剂结合蛋白；经抗体封闭噬菌体表 面蛋白表位，检测其与光敏剂结合与否，该噬菌体丧失与光敏剂结合的特性。
2.根据如权利要求1所述的光敏剂药靶的筛选方法，其特征在于所述的光敏剂为卟啉 类光敏剂或卟吩类光敏剂。
3.根据如权利要求2所述的光敏剂药靶的筛选方法，其特征在于所述的卟啉类光敏剂 为PpIX，PpIX在PBS溶液中的光波长扫描图谱中，其最大激发波长为400nm，最大发射波长 为 620nmo
4.根据如权利要求1所述的光敏剂药靶的筛选方法，其特征在于所述的使光敏剂形成 固相，其固相的建立与评估方法为，将光敏剂吸附于聚苯乙烯或葡聚糖材质孔板，利用光敏 剂受特定波长激光激发发出特定发射波长的特性，建立并评估光敏剂固相效果。
5.根据如权利要求1所述的光敏剂药靶的筛选方法，其特征在于所述的从噬菌体展示 库中筛选出与光敏剂结合的噬菌体，具体步骤如下1)、将光敏剂包被于聚苯乙烯或葡聚糖材质孔板；2)、噬菌体展示库加入孔板中与固相光敏剂37°C条件下孵育；3)、洗去未结合的光敏剂，加入培养至0D_^ 0. 6的噬菌体宿主菌；4)、37°C条件下轻摇培养，使噬菌体进入其宿主菌内；5)、将孔板中菌液转入新鲜LB液体培养基中培养，以扩增噬菌体；6)、离心获得上述步骤5)噬菌体后，再加入光敏剂固相中，如此循环筛选四轮，富集与 光敏剂结合的噬菌体。
6.根据如权利要求5所述的光敏剂药靶的筛选方法，其特征在于所述筛选出与光敏 剂结合的噬菌体，其中，确定光敏剂结合噬菌体的检测方法为，利用噬菌体侵染宿主菌的特 性，使光敏剂结合噬菌体侵染宿主菌形成部分溶原性噬菌体，然后通过检测宿主菌与光敏 剂的结合，检测噬菌体的存在。
7.根据权利要求6所述的光敏剂药靶的筛选方法，其特征在于所述检测光敏剂结合噬 菌体与光敏剂结合的方法的具体步骤如下1)将经过四轮筛选的光敏剂结合噬菌体与其宿主菌成噬菌斑效应；2)噬菌斑原位转移到醋酸纤维素NC膜上；3)NC膜经洗去其表面的噬菌体宿主菌后，与光敏剂孵育半小时；4)洗去未结合于噬菌斑的光敏剂；5)荧光显微镜下RFP通道激发NC膜；6)与光敏剂结合的噬菌斑发红光；7)原位挑取与光敏剂结合的噬菌斑单克隆，于培养至0D_^ 0. 6的宿主菌中扩增培养；8)取上述宿主菌与噬菌体的混合液，涂玻片固定细菌后，加入光敏剂，孵育一段时候 后，洗去未结合的光敏剂；9)荧光显微镜下RFP通道下进一步验证与PpIX结合的噬菌斑发红光。
8.根据权利要求7所述的光敏剂药靶的筛选方法，其特征在于所述抗体封闭噬菌体表 面蛋白后，检测其与光敏剂结合与否，具体步骤如下1)将上述步骤8)中宿主菌与噬菌体的混合液，涂玻片后，加入噬菌体表面展示蛋白的 抗体封闭，再加入光敏剂孵育一段时间，洗去未结合的光敏剂；2)荧光显微镜下RFP通道下观察，与PpIX结合的噬菌斑结果不发红光。
全文摘要
本发明属于生物医学和光动力学治疗技术领域，具体为一种光敏剂药靶的筛选方。该方法以光敏剂为探针，利用人cDNA噬菌体展示库表面展示人不同种类蛋白的作用，从噬菌体展示库中筛选光敏剂药靶。本发明包含从噬菌体展示库中筛选光敏剂药靶的技术路线，以及利用光敏剂在一定波长受光激发从基态跃迁到激发态的特性，作为检测光敏剂药靶存在的检测手段。本发明所获光敏剂结合噬菌体，经采用抗体封闭该噬菌体表面蛋白后，其失去结合光敏剂的特性。为寻找潜在的光敏剂药靶，及其在PDT中介导光敏剂与肿瘤细胞的亲和奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK102051414SQ201010553309
公开日2011年5月11日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者朱乃硕, 郭艳荣, 魏勋斌 申请人:复旦大学