专利名称：利用枳转录因子基因PtrABF提高植物抗旱能力的制作方法
技术领域：
本专利属于植物基因工程领域。具体涉及从枳中分离、克隆得到ABA响应的转录因子(PtrABF)，然后将该基因导入到模式植物烟草中进行功能验证，获得的转基因植株抗非生物逆境能力明显提高。
背景技术：
干旱影响植物的生长发育、地理分布和生产能力，是农业生产面临的严峻挑战，也是许多地区农业发展的瓶颈。据统计，世界干旱和半干旱地区占地球陆地面积的33%，全世界每年由于水分胁迫造成作物生产的损失几乎等于其它所有环境因子所造成的损失的总和。由此可见，培育抗旱的农作物新品种是应对季节性干旱、扩大农作物种植区、实现节水农业的重要途径。植物遗传转化是利用生物、物理或化学等手段将外源基因导入受体细胞以得到转基因植物的技术，该技术是在不大规模改变植物自身性状的同时，可以插入特定性状从而培育新种质，在作物遗传改良中具有十分重要的作用和应用前景。自1983年首例转基因植物问世以来，植物转基因研究取得了长足的进展。一些转基因作物进行商业化种植，面积不断增加，截止2009年，全球共有25个国家有商业化的转基因植物，种植面积共1. 35亿ha， 比2008年增长了 7%。在果树上，美国利用转基因技术获得抗I3RSV的番木瓜并商业化生产，使美国夏威夷的番木瓜产业得到大的发展。勿用置疑，开展转基因工作以培育抗旱转基因材料的关键是克隆在干旱应答中起重要作用的基因。在长期进化过程中，高等植物形成了相应的逆境应答机制，大量研究表明，植物在转录水平上发生改良是应答逆境胁迫的一个重要机制。根据基因产物的作用，植物非生物逆境胁迫应答基因可以分为功能蛋白和调节蛋白两类，前者在植物应答逆境中起直接作用，后者则是重要的调节因子。ABA响应元件(ABA responsive element，ABREs)调控ABA和逆境响应的基因已经被大量的研究所证实，在这些顺式元件中普遍拥有(C/T)ACGTGGC这一共同序列。与ABRE 元件结合的转录因子称为 ABF (ABREbinding factors)或 AREB(ABRE binding elements), 属于bZIP蛋白家族。迄今为止，ABF基因已在番茄(Y0fiezet al.，2009)、水稻(Hossain et al.，2010)、莴苣(Vanjildorj等，2005)、拟南芥(Fujita等，2005)等植物上克隆，在克隆ABF的cDNA的基础上，开展了基因转化研究，Choi等Q000)结果证明，转ABF基因后， 在某些逆境胁迫下，转化子表现出较强的抗性。Kang等000 和Fujita等^00 研究表明AREB1/ABF2，、ABF3或ABF4在拟南芥中超表达能够增加抗旱性。更一定研究者感兴趣的是，Kim等Q004)研究发现在拟南芥中超表达ABF2能够增加对干旱、高盐、高热和氧化胁迫的抗性。上述研究表明，ABF转录因子在植物的抗旱性中起到重要的作用，将ABF基因用于遗传转化是获得抗旱新种质的重要途径。虽然有较多的研究表明ABF基因已经在一些植物中克隆，但在枳中尚未见该基因克隆及功能验证的报道，更未见应用枳ABF基因转化植物提高抗旱的文献报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的缺陷，从克隆枳(Poncirus trifoliate)分离克隆出ABF类转录因子，申请人将这个转录因子命名为PtrABF，通过农杆菌介导遗传转化方法获得抗旱转基因植株，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。本发明是这样实现的申请人:基于植物基因克隆技术从枳中克隆得到一个新基因PtrABF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在SEQ ID NO 1所示序列的36_1382b处为该基因的编码区； 其编码的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO 2所示，它包含1347bp的开放阅读框，编码448个氨基酸，等电点为9. 66，预测的分子量为48kD。申请人:设计了克隆上述的基因PtrABF的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示正向引物PtABFForward, 5，-ATTGGAGCAAGCTGTTGCCACCGC-3，；反向引物PtABFReverse, 5' -CGCAGCTGCCTACACTCCATGG-3，。利用农杆菌介导的遗传转化方法转化模式植物(烟草)，使该基因在烟草中超表达，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrABF基因具有调控烟草的抗旱性的功能。在本发明的实施例部分，我们阐述了枳PtrABF转录因子的分离、功能验证和应用。
序列表SEQ ID NO 1是本发明分离自枳的具有抗旱功能的基因PtrABF的核苷酸序列，其中36-1382b处为该基因的编码区。序列表SEQ ID NO 2是本发明分离自枳的具有抗旱功能的基因PtrABF的编码的氨基酸序列，它包含1347bp的开放阅读框，编码448个氨基酸。图1是本发明的技术流程图。图2A和图2B是本发明的PtrABF基因在脱水㈧和ABA处理⑶下的表达。其中图2A是本发明的基因在枳的田间苗(未转基因)室温下不同时间点的时空表达模式；， 图2B是本发明的基因在枳的田间苗(未转基因)在ΙΟΟμΜ ABA处理下，相应时间点取样， 采用实时定量PCR分析本发明的基因相对表达量。图3是本发明的PtrABF基因亚细胞定位。图中图3Α :GFP基因在明场(图左)、紫外线(UV)光(中)下的成像，图右为二者叠加后的成像；图;3B、PtrABF基因在明场(左)、 UV光(中)下的成像，右为二者叠加后的成像。图4是本发明的PtrABF基因转录激活鉴定。图4A是空载体在不同培养基上的生长情况；图4B是融合载体PtrABF基因在不同培养基上的生长情况。图5是本发明的其中一个实施例的载体构建流程。图5A是载体构建框图；图5B 是载体的物理图谱。图6是本发明的PtrABF基因转烟草PCR鉴定结果；图6A和图6B分别是PtrABF特异引物及NPTII引物的扩增结果(箭头指的是PCR扩增预期片段)。P为质粒(阳性对照)，0为水(空白对照)，其余数字则为不同转基因系。C是对其中两个转基因系G号和 19号)外源基因表达的分析结果，WT为未转化植株，Tubulin为内参基因。图7A和图7B是本发明中实施例转PtrABF基因株系#4和#19及非转基因植株 (WT)生长30天后室温脱水90分钟后失水率(图7A)、电导率(图7B)和植株表型(图7C)。 *和**表示转基因株系的数值与未转化植株(WT)有显著性差异(*为P < 0. 05，**为P < 0. 01)。图8A和图8B是实施例6转PtrABF基因株系#4和#19及非转基因植株(WT)移栽土壤中生长60天后进行控水干旱处理7天(图8A)和21天(图8B)的表型及控水21d 后的电导率(图8C)和叶绿素含量(图8D)。*和**表示转基因株系的数值与未转化植株 (WT)有显著性差异(*为P < 0. 05，#为P < 0. 01)。图9是实施例7转PtrABF基因株系#4和#19及非转基因植株(WT)生长30天后室温脱水90分钟后或移栽土壤中生长60天控水21天的活性氧染色结果。图9A和图9B分别是脱水0分钟和90分钟的NBT和DAB染色。C为控水21天后的NBT(上图)和DAB(下图)染色。图10是实施例7转PtrABF基因烟草#4和#19和非转基因植株(WT)控水前及控水7天后SOD(图10A) ,POD(图10B)和CAT(图10C)三种酶活性测定。图中**表示转基因株系的数值与未转化植株(WT)有显著性差异(P < 0. 01)。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例， 本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1，PtrABF基因分离克隆及表达分析以ABF为关键词搜索柑桔EST数据库(HarvEST =Citrus ver. 0. 51)，得到18个相近序列，这些由DNAstar (公用软件)组成一个unigene，利用该序列用I^rimer Premier 5.0设计引物(见表1)，用RT-PCR方法扩出全长。25°C脱水下从枳壳叶片抽提RNA及反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PtrABF基因全长。RNA抽提使用Trizol试剂盒(购自hvitrogen公司，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)，利用抽提的3 μ g总RNA样品经IU的DNaseI (Amplification Grade,购自hvitrogen公司)室温处理15分钟后，力口入1 μ 1 EDTA(25mM)，于65°C温育10分钟。第一链cDNA的合成用MBI反转录试剂盒(货号K1621，购自i^rmentas公司，按照试剂盒说明书操作)。扩增基因PtrABF引物对为正向引物PtABF Forward，5，-ATTGGAGCAAGCTGTTGCCACCGC-3’ ；反向引物PtABF Reverse, 5‘ -CGCAGCTGCCTACACTCCATGG-3‘。25 μ 1 的反应体系中包括 IOOng cDNA, 1 X 缓冲液，2. 5mM MgCl2,0. 25mM dNTP,0. 5U Taq聚合酶(前述缓冲液和Taq聚合酶购自Fermentas公司， Lithuania)加 0. 5μ M上述引物。PCR 反应在 ABI 9700 (Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成94°C，5分钟，94°C变性30秒，60°C退火50秒，72°C延伸90秒，35个循环；循环完成后72°C延伸15分钟。产生一条单一 PCR条带产物，经的琼脂糖凝胶电泳后，用 E.Z.N.广DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带，提取步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa公司) 进行连接反应，按说明书操作，连接反应体系中插入PtrABF基因与pMDlS-T载体的摩尔比为3 1连接反应总体积是10μ1，其中包括5μ1的2X缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，4. 5μ1纯化的PCR产物，0. 5μ1Τ载体。16°C过夜连接。取10 μ 1连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，200 转化大肠杆菌DH5ci，在含有 50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(由上海联合基因公司完成)，测序结果表明，本发明克隆PtrABF基因全长为1511bp(见SEQ ID N0:1所示)，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，将这个基因命名为PtrABF，它包括1347bp的编码阅读框，编码448个氨基酸，等电点为9. 66，预测的分子量为48kD。BLASTX分析该序列与已知的(所有已发表的文献和数据库)的植物序列高度同源。推导的PtrABF基因的氨基酸序列与报道的杨树(ABF29696. 1)、拟南芥(AtABFl，NP_564551. 1 ；AtABF3, NP_567949. 1)、 长春花(CrABFl，AF3^450_l)的序列高度同源。多序列比对结果显示PtrABF基因包括四个保守的氨基酸结构域ABF家族三段七肽亮氨酸重复和两个重要的碱性亮氨酸拉链(bZIP) 特征，ExPASy分析表明编码的氨基酸PtrABF有一个核定位信号。SMART预测氨基酸PtrABF 有两个转录激活区域。为分析PtrABF基因是否对脱水和脱落酸(ABA)处理响应，采用实时定量PCR分析该基因在脱水条件和ABA处理下的表达。结果表明，脱水处理(见图2A)和ABA处理(见图2B)均能诱导该基因表达，表明它是一个逆境应答候选基因。实施例2，PtrABF基因亚细胞定位和转录激活分析由于PtrABF基因有一个核定位信号，本实施例利用洋葱表皮研究PtrABF基因的亚细胞定位。利用RT-PCR扩增出PtrABF基因整个0RF，并在其扩增引物两端加上BamHI和 Xhol两个酶切位点。首先将扩增产物装在PMD18-T载体上，从而得到一个PMD18-TB/x_PtrABF 重组载体。同样将GFP编码整个ORF阅读框装在pMD18-T载体上，并在其两端加上BamHI和 KpnI两个酶切位点，从而构建了一个pMD18-TB/K_GFP。同时用BamHI和KpnI去切pMD18_TB/ x-PtrABF和pMD18-TB/K_GFP，回收产物并连接，从而构建了一个重组载体，最后将这个重组载体和pMV载体同时用Biol和KpnI酶切，回收并连接产物，从而得到pBI 121-PtrABF-GFP重组载体。在确认序列无误后，将pBI121-PtrABF-GFP重组载体及对照载体(pBI121_GFP)用热击法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)分别转入农杆菌EHA105。农杆菌侵染洋葱表皮按如下方法进行(1).划平板，挑单克隆(含有重组质粒的农杆菌)于:3ml YEB培养基(含卡那霉素(Km)40yg/ml，利福平(Rif) 25mg/ 0，观1震荡培养对小时，至00_约0.6。2.用手术刀将洋葱内表皮划成Icm2大小，撕下置于报道的MS基本培养基(含3%蔗糖，0.75%琼脂，不含激素)上暗培养对小时。3.按体积比为1 1000比例，接种50 μ 1农杆菌菌液于50ml YEB (含Km 40μ g/ml,Rif 25 μ g/ ml)中，28°C振荡培养12-24小时。4. 4000rpm，4°C离心10分钟，弃上清。5.加入50mlYEB 培养基(含有IOmM MgCl2)。将洋葱表皮放入菌液中浸泡30分钟。6.吸干表面菌液，置于 MS基本培养基(含3%蔗糖，0.75%琼脂，不含激素)上上培养两天。用01ympusBX61 型显微镜观察报告基因定位情况。亚细胞定位结果表明含对照载体的农杆菌转化的洋葱表皮细胞中GFP荧光充满整个细胞(附图3A)，而含PtrABF基因载体的农杆菌浸染的洋葱表皮中GFP荧光只在细胞核中(附图;3B)，证明PtrABF是核定位基因。
本实施例利用酵母体系验证本发明基因PtrABF是否具有转录激活活性。方法是 首先将PtrABF基因构建到pGBKT7的GAL4-DB (购自CL0NTECH公司)上，得到融合表达载体上，将融合表达载体及空载体(PGBKT7)分别转化酵母菌株AH109(购自CL0NTECH公司)， 然后在不同缺失培养基上培养。同时，还进行了半乳糖苷酶(galactosidase)酶活性实验， 看酵母是否显蓝色确定报告基因LacZ的表达，从而确定本发明的基因是否具有激活功能。 实验结果表明，对照载体转化的酵母细胞在含有3-AT(3-氨基三唑)的培养基上生长完全受到抑制，在半乳糖苷酶(Χ-α-Gal)的培养基上不能显蓝色，表明不能激活标记基因(附图4A)。而当融合载体(有PtrABF基因)转化酵母细胞后，在所在培养基上均能正常生长， 而且在添加有X-α-Gal的培养基上显现蓝色，表明PtrABF确实具有转录激活功能(见图 4Β)。实施例3，植物转化载体构建根据pMV载体(切除⑶S基因的植物二元转化载体pBI121中，由华中农业大学园艺林学学院叶志彪教授惠赠)的多克隆位点和PtrABF基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用I^imer Premier 5. 0软件设计出扩增PtrABF基因整个编码区的上、下游PCR 引物(该引物对就是扩增本发明PtrABF基因cDNA序列的引物对)。其序列如下所示Forward primer :5，-ATTGGAGCAAGCTGTTGCCACCGC-3，Reverse primer :5，-CGCAGCTGCCTACACTCCATGG-3，以PtrABF基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为60°C。PCR 反应体系及扩增程序同实施例1。双酶切体系反应总体积为20μ 1，其中含有PCR的纯化产物10μ 1，IOXG缓冲液(购自MBI公司)2μ 1，Kpn I及Mil各1μ 1，双蒸水6μ 1。在 37°C酶切过夜后纯化回收。pMV载体的双酶切体系反应总体积为20μ1，其中含有经过质粒提取获得的PMV载体DNA 8μ 1,10XG缓冲液(购自MBI公司)2 μ 1，Kpn I及Xho I 各1μ 1，加双蒸水8μ 1。于37°C酶切过夜后纯化回收。连接反应体系中插入PtrABF基因与载体pMV的摩尔比为3 1，反应总体积为10 μ 1，其中含有IOXBuffer lyl，T4DNA连接酶1μ 1，PtrABF基因的双酶切回收产物4 μ 1，pMV载体的双酶切回收产物2 μ 1，双蒸水 2μ L·在16°C反应14-16小时。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5a，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有读码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为PMV-PtrABF重组载体，应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体 pMV-PtrABF导入到农杆菌EHA105中。真核表达载体pMV-PtrABF构建流程见图5所示。实施例4，烟草的遗传转化应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体pMV-PtrABF导入到根癌农杆菌EHA105中，根癌农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下1.根癌农杆菌培养取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素 50mg/L的LB平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中，28°C 180转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到0D_ = 0. 3 0. 8时作浸染。2.浸染取未转基因的烟草叶片，切成0.5cmX0.5cm大小，然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡8 10分钟，期间不断振荡。
3.共培养取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上(叶背面向下)，25°C暗培养3天。4.筛选培养经共培养3天后的烟草叶片，用500mg/L浓度的头孢霉素溶液洗一遍，然后无菌水冲洗3 5次，再转移入添加了 100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的筛
选培养基中。5.生根培养待筛选培养基上的不定芽长到Icm左右时，切下并转入添加了 100mg/L Km和500mg/LCef的生根培养基上。6.烟草苗转入土培待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。烟草转化苗所用培养基见表1。表1烟草转化苗所用培养基配方
权利要求
1.一种分离枳的具有抗旱功能的基因PtrABF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.一种分离枳的具有抗旱功能的基因PtrABF，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 2所示，它包含1347bp的开放阅读框，编码448个氨基酸，等电点为9. 66，预测的分子量为 ^kD。
3.一种克隆权利要求1或2所述基因的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示 正向引物PtABF Forward，5，-ATTGGAGCAAGCTGTTGCCACCGC-3’ ；反向引物PtABF Reverse, 5' -CGCAGCTGCCTACACTCCATGG-3，。
4.权利要求1或2所述的基因在植物抗旱中的应用。
5.权利要求4所述的应用，其中包括在柑橘抗旱中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从枳中分离、克隆得到枳ABF基因(PtrABF)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示；其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示，它包含1347bp的开放阅读框，编码448个氨基酸，等电点为9.66，预测的分子量为48kD。本发明将该基因PtrABF导入到烟草进行功能验证，获得的转基因植株抗旱能力明显提高，并且转基因植株抗性提高的机理可能是与活性氧清除有关。本发明为植物抗非生物逆境分子设计育种提供了新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
文档编号C12N15/29GK102477435SQ20101055798
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者刘继红, 黄小三 申请人:华中农业大学