专利名称：一种表达icp47基因的腺病毒载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术基因治疗领域，特别是一种表达ICP47基因的腺病毒载体及 其构建方法。
背景技术：
基因治疗的基本原理在于通过目的基因的转移，目的基因是否准确地定向导人靶 细胞，并能有效地表达，将直接影响基因治疗的安全性和治疗效率。但目前，临床基因治疗 处于一种保守的阶段，仍存在很多障碍，其中受者对载体及表达基因产物的排斥反应是最 为突出的问题，而传统的免疫抑制剂几乎都能抑制人体的免疫系统，增加病人催患感染和 肿瘤的危险性。因此，基因治疗的研究越来越重视诱导特异性免疫耐受，而不再过分地关注 有效的免疫抑制剂。诱导特异性免疫耐受只涉及移植排斥的淋巴细胞，而不影响其它淋巴细胞的功 能，是解决排斥的最理想方法。迄今已发展出许多诱导耐受的方案，主要包括降低MHC I类 分子表达，抑制DC细胞成熟、阻断共刺激因子通路等方法。
广泛分布于机体组织细胞上主要组织相容性复合体(MHC)不仅与移植排斥有关，而且 广泛参与免疫应答的诱导和调节，所以具有很重要的免疫学意义。MHC能与细胞加工处理的 抗原肽结合，特异性与TCR结合后成为使相应的T淋巴细胞活化的信号之一。MHC-类分子 则与细胞加工处理的内源性抗原肽结合进行抗原的递呈，引起CD8+T细胞的活化。MHC- II 类分子能与细胞加工处理的外源性抗原肽结合进行抗原的递呈，引起CD4+T细胞的活化。过去曾一度认为MHC- I类分子仅能递呈内源性抗原肽，即引起⑶8+T细胞活化 ^ APCs (Antigen Presenting Cells)只是能产生内源性抗原的靶细胞，然而，越来越多 的证据表明，MHC-I类分子也能够递呈外源性抗原诱导反应，具有吞噬功能的APC在激活 CTL的应答过程中发挥着关键性作用。研究发现许多病毒在其生活周期的不同阶段可以 干扰MHC I类抗原呈递，从而产生病毒逃逸，减少机体对病毒的清除。腺病毒E3-gpl9k蛋 白能与MHC-I结合，使其固定在内质网膜上，而不是分泌到病毒感染细胞表面，大大降低病 毒入侵细胞的MHC-I表达，从而抑制了体内特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对病毒感染细 胞的杀伤作用，逃避机体的免疫清除，增加被感染细胞的在体内存活时间，人为的将腺病 毒E3-gpl9k蛋白基因导入移植的供体细胞，可以延长供体细胞在受体中存活时间，以利 于目的基因的长期表达。而不需要免疫抑制剂。此外，艾伦·Ρ·埃舍尔等构建了可以编 码E3-gpWk基因的质粒，用于预防、延迟或治疗包括I型糖尿病在内的多种自身免疫性疾 病，其研究发现，给NOD小鼠预防接种含有E3-GP19k质粒后，糖尿病的发病延迟，并降低糖 尿病的发病率，YinYL等研究发现EBV能翻译一个它复制所需，但不能被MHCI抗原呈递的 EBNA-I，从而有效避免针对病毒蛋白CTL的产生和病毒特异性效应CTL识别感染细胞。目前，临床基因治疗处于一种保守的阶段，仍存在很多障碍，其中受者对载体及表 达基因产物的排斥反应是最为突出的问题，而传统的免疫抑制剂几乎都能抑制人体的免疫 系统，增加病人催患感染和肿瘤的危险性。因此，基因治疗的研究越来越重视诱导特异性免疫耐受，而不再过分地关注有效的免疫抑制剂。HSV-I立即早期基因产物-ICP47( infected cell protein 47)，它所针对的是MHC-I抗原呈递过程中决定抗原呈递效率的重要蛋白之 一-TAP。ICP47通过与免疫性肽段竞争结合TAP肽结合位点，抑制病毒抗原肽被有效地转运 到ER腔内与新合成的MHC I分子结合，削弱了 TAP的肽转运功能，导致不稳定的空载MHCI 分子出现，在APC细胞表面MHCI的表达量显著下降，直接干扰了 MHCI途径对CTL的激活， 使感染的细胞逃脱了宿主的免疫清除。因此，ICP47是HSV 1逃避宿主免疫反应的重要手 段。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供的一种表达ICP47基因的腺病 毒载体及其构建方法，本发明在腺病毒载体上连接ICP47基因片段，构建可介导免疫耐受 的腺病毒载体，期待其能降低机体对载体及表达基因产物的排斥反应，以利于基因的长期 表达，为基因治疗、器官组织移植或细胞移植等提供一种新的探索方向。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一种表达ICP47基因的腺病毒载体，该载体包含编码单纯疱疹病毒1型ICP47基因的 表达区，能够在真核细胞中表达单纯疱疹病毒1型ICP47蛋白。本发明所述的重组腺病毒载体，在ICP47基因的5’端连有6XHis片段，可表达融 合基因6His-ICP47，能够在真核细胞中表达OTis-ICP47融合蛋白，便于蛋白的纯化，用于 抗体研制和生产。本发明的腺病毒载体的构建方法，如下
单纯疱疹病毒1型ICP47基因双酶切构建于腺病毒穿梭质粒PAdTrack-CMV后，将 6XHis片段连接于ICP47基因的5，端，PmeI单酶切后与腺病毒包装质粒pAdEasy-Ι进行 同源重组，构建pAdEasy-6His-ICP47，Pac I单酶切后转染细胞进行病毒包装，构建重 组腺病毒载体r6His-ICP47。本发明所述的重组腺病毒载体能够在真核细胞中表达6His_ICP47融合蛋白，降 低机体对载体及表达基因产物的排斥反应，以利于基因的长期表达，可用于基因治疗、器官 组织移植或细胞移植等方面。
图1为PCR扩增图像
图2为腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV图谱 图3为腺病毒包装质粒pAdEasy-Ι图谱
图4重组质粒pTrack-ICP47 Hind III和EcoR V双酶切鉴定图像 图5重组质粒Kpn I和EcoR V双酶切鉴定图像 图6 pA(Trrack-6His-ICP47的反向测序结果 图7同源重组结果分析图像
图8重组质粒pAdEasy-6His_ICP47 Pac I酶切鉴定 图9重组腺病毒载体转染细胞 图 10 Western-blot 图像。
具体实施例方式实施例1扩增ICP47目的基因
NCBI网站查找HSV-I型ICP47的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设 计，设计的引物为
sense A 5' - GGO^TTATGTCGTGGGCCCTGGAAATG - 3' anti-sense B 5' - GGCCfi^TA7TTCAACGGGTTACCGGATTACG - 3' 上游引物和下游引物中加黑斜体序列分别为Hind III和EcoR V识别位点。引物由上海 赛百盛生物工程公司合成。临床采集的HSV-I型DNA阳性脑脊液标本进行病毒提取DNA提取，操作依照试剂 盒说明书进行，将提取所得HSV-I DNA置于-20°C保存，以供PCR扩增。依照说明书要求，依次加入模板HSV-I DNA，上下游引物，Pfu DNA Polymerase, dNTPs,5XPCR Buffer及适量的ddH20，建立50μ 1 PCR反应体系，设置PCR仪反应程序 95°C预变性anin后，95°C 20s, 60°C 20s, 72°C 15s，进行；35个循环，循环结束后72°C延伸 5min。PCR结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。结果发现标本2号和标本4号 在 6bp左右处出现一清晰的特异性条带，与预期片段大小相同，见图1。实施例2 pTrack_ICP47 的构建
腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV和包装质粒pAdEasy-Ι图谱见图2，图3。PCR扩增产 物和腺病毒穿梭质粒PAdtrack-CMV进行EcoR V和Hind III分步双酶切反应，酶切成功后胶 回收PCR片段和pAdtrack-CMV载体片段，T4 DNA Ligase酶16°C过夜连接后，转化感受态 E. coli DH5 α，对生长出的菌落进行菌落PCR鉴定和酶切鉴定，筛选阳性克隆。限制性核酸内切酶Hind III和EcoR V分别对重组质粒pTrack_ICP47和空质粒 pTrack-CMV进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线下观察，重组质粒pTrack-ICP47酶 切后可见约的插入片段，结果与ICP47预期片段大小相符合，而空质粒pTrack-CMV 酶切后没有出现对应的片段，见图4。实施例3 pAdTrack-6His-ICP47 载体的构建
6XHis的正、反义链中分别含有限制性核酸内切酶Kpn I和Hind III的酶切粘性末端。Sense HI: 5' -CATGCATCATCATCATCATCATA-3‘ Anti-sense H2: 5， -AGCTTATGATGATGATGATGATGCATGGTAC-3，
取上海赛百盛生物工程公司合成的6XHis tag正，反义链进行退火反应，退火结束后， 乙醇沉淀纯化，与KpnI和Hind III双酶切后的pAdTrack-CMV-ICP47进行连接反应，转化感 受态E. coli DH5 α，筛选重组克隆，PCR和酶切鉴定。限制性核酸内切酶Kpn I和EcoR V分别对重组质粒pTrack-6His_ICP47和空 质粒pTrack-CMV进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，重组质粒pTraCk-6His-ICP47酶切后 可见约^Obp的插入片段，结果与6His-ICP47融合基因预期片段大小相符合，而空质粒 pTrack-CMV酶切后没有出现对应的片段，见图5。PCR和酶切鉴定阳性后测序鉴定，测序正确后命名pAdTraCk-6His-ICP47。反向测 序结果见图6。实施例4 重组质粒pTrack-6His_ICP47与pAdEasy-Ι在感受态BJ5183中同源重组
构建成功的重组质粒pAdTrack-6His-ICP47载体和空载体pAdTrack_CMV分别测定 0D260,计算DNA浓度后分别进行Riie I酶切，37°C酶切池后，琼脂糖凝胶电泳观察酶切结 果，酶切成功后进行去磷酸化反应，胶回收后进行共转化试验。(1)将约WgPme I单酶切线性化的穿梭质粒及约lOOng/μΙ的病毒骨架质粒加入 感受态BJ5183细菌中，混勻，冰浴保存30min。42°C水浴中90sec。冰浴5min。加入400 μ 1 液体LB培养基，混勻后置于37°C摇床缓慢振摇60min。(2) 5000rpm离心lmin，弃上清400 μ 1左右，剩余上清将菌体沉淀吹打混勻，涂于 Kana+LB培养板，37 °C培养过夜。次日挑取平板上长出的菌落，37°C摇菌，提取质粒，0. 8%琼脂糖凝胶电泳筛选，验 证质粒的大小，阳性重组质粒大小约401ib，pAdtrak-CMV质粒对照大小约为9220bp。电泳结 果中大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定，见图7。以I^cI单酶切，0. 8%琼脂糖凝胶电 泳如显示出一条大片段(约301Λ)，及一条小片段(约3. 0或4. 51Λ)，基本确定为阳性克隆。 结果见图8。构建成功的腺病毒载体命名为pAd Easy-6His-ICP47和pAdEasy-Track。实施例5腺病毒载体的包装
Pac I线性化的同源重组质粒4 μ g采用脂质体转染法转染生长至70%汇合的细 胞，5% C02，37°C培养过夜，次日换液。每日观察细胞是否出现细胞病变效应(cytopathic effects, CPE)和荧光表达。转染后第5-6天，各培养瓶开始出现少量CPE细胞，之后CPE细胞数量逐渐增加， 约转染后7天，细胞出现片状脱壁漂浮，荧光表达也达到80%以上，10天左右细胞全部漂浮 且荧光表达几乎全部阳性，见图9。图9a为正常细胞；b为重组腺病毒转染细胞 48h ；c为重组腺病毒转染细胞第4d ；d为重组腺病毒转染细胞第5d ；e为重组腺 病毒转染细胞第6d ；f为重组腺病毒转染细胞第7d，g为重组腺病毒转染 细胞第8d，h为重组腺病毒转染细胞第10d。收集细胞。-80°C与37°C反复冻融3个次，4°C 12000g离心5分钟，取上清即得到 原始病毒液，取5μ 1病毒上清进行PCR鉴定重组腺病毒产生。鉴定正确的重组病毒命名为 r-6His-ICP47,空载病毒命名为rlrack。重组病毒扩增，经CsCl连续梯度离心纯化，滴度测定后，病毒上清分装成500 μ 1/ 管，-80°C保存。实验例6 Western-blot 试验
生长至70%汇合的细胞，加入病毒上清液感染细胞，当所有细胞变圆漂浮且荧光 表达接近100%时，收集细胞，加入预冷的PBS洗涤细胞3次后，每瓶细胞加200 μ 1含PMSF 的RIPA裂解液，吹打混勻，冰上裂解30min。12000rpm离心5分钟，离心后80 μ 1上清加入 20 μ 1还原型5 X SDS上样缓冲液，变性5分钟，30 μ 1样品上样，电泳，浓缩胶时用80-100V， 到分离胶以后用150-200V，电泳至溴酚兰刚跑出即终止电泳，进行转膜，丽春红染色，观察 到膜上的蛋白条带后，将膜晾干，依次进行奶粉封闭，TBST漂洗，一抗孵育，TBST漂洗，二抗 孵育，TBST漂洗，最后进行化学发光反应，显影、定影后，室温下晾干，拍照。结果见图10。实施例7 CTL杀伤试验
生长至70%汇合的细胞，加入病毒上清液感染细胞，当所有细胞变圆漂浮且荧光表达接近100%时，收集细胞，PBS调整细胞浓度为1 X 106/ml。反复冻融5次，离心后将上 清经0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存。采集健康人肝素抗凝外周血，生理盐水与抗凝血1:1稀释后，以2 :1比例加入淋巴 细胞分离液面上，2000rpm离心20min，吸取白色云雾状狭带细胞，PBS洗涤2次后，含10% FBS的RPMI-1640重悬细胞，接种于6孔培养板，37°C，5%C02培养3小时。贴壁生长者为单 核细胞，未贴壁细胞富含大量的T淋巴细胞。未贴壁细胞离心后用含10% FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞，加入终浓度为 5ng/ml 的 rhIL-2，37°C，5%C02 培养。贴壁细胞每孔中加入含10% FCS的RPM11640培养液，加入终浓度为IOOng/ 111161^5 和11^-4，371，5%0)2培养，第3(1，贴壁细胞即为0(细胞。换液后，加入40 μ 1/孔 的抗原肽，第8d收集各组悬浮的DC，1:50的比例与T淋巴细胞混合培养3d。收集各组靶细胞和DC刺激后的T淋巴细胞，加入96孔板，调节效靶比为20:1，每 组设3个复孔，370C，5%C02培养28h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20 μ L，孵育4h，离心弃 上清，加入150 μ 1/孔DMS0，振荡IOmin后，酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔光吸收 度，记录结果。T淋巴细胞杀伤活性=靶细胞对照组OD值-(实验组OD值一效应对照组OD值)/ 靶细胞对照组OD值X 100%
结果显示，致敏T淋巴细胞对未转染组的杀伤率为(33. 97士6. 19)%，明显低于其 对r-Track转染的杀伤率(57. 33士7. 77) %和对r_6His_ICP47转染的杀伤率 (45. 15士6. 20) %，并且致敏T淋巴细胞对r-6His-ICP47转染的杀伤率低于r-Track 转染的杀伤率(P<0. 05)，表达ICP47基因的重组腺病毒载体具有降低CTL杀伤活性的 作用，有利于重组基因在体内的长期表达，在基因治疗、器官组织移植或细胞移植等方面具 有很大的应用潜力。
权利要求
1.一种表达ICP47基因的腺病毒载体，其特征在于该载体包含编码单纯疱疹病毒1 型ICP47基因的表达区，能够在真核细胞中表达单纯疱疹病毒1型ICP47蛋白。
2.根据权利要求1所述的表达ICP47基因的腺病毒载体，其特征在于在ICP47基因 的5，端连有6XHis片段，可表达融合基因6His-ICP47。
3.根据权利要求1所述的表达ICP47基因的腺病毒载体，其特征在于该载体能够在 真核细胞中表达6His-ICP47融合蛋白，便于蛋白的纯化，用于抗体研制和生产。
4.一种权利要求1中所述表达ICP47基因的腺病毒载体的构建方法，其特征在于单 纯疱疹病毒1型ICP47基因双酶切构建于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后，将6XHis片 段连接于ICP47基因的5’端，RiieI单酶切后与腺病毒包装质粒pAdEasy-Ι进行同源重组， 构建重组腺病毒载体pAdEaSy-6HiS-ICP47，Pac I单酶切后转染细胞进行病毒包装， 构建重组腺病毒r6His-ICP47。
全文摘要
一种表达ICP47基因的腺病毒载体及其构建方法，其特征是该载体包含编码单纯疱疹病毒1型ICP47基因的表达区，能够在真核细胞中表达单纯疱疹病毒1型ICP47蛋白。此外在ICP47基因的5’端连有6×His片段，可表达融合基因6His-ICP47，能够在真核细胞中表达6His-ICP47融合蛋白。表达ICP47基因的腺病毒载体，可降低机体对载体及表达基因产物的排斥反应，以利于基因的长期表达，用于基因治疗、器官组织移植或细胞移植等方面。
文档编号C12N15/861GK102061312SQ201010561369
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月27日 优先权日2010年11月27日
发明者余祖江, 潘雪, 王鹏, 翟广玉, 阚全程 申请人:郑州大学