专利名称：甘薯病毒病害spvd的多重rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及甘薯病毒的RT-PCR检测，属于生物工程技术领域，特别是涉及一种危 险性甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法。
背景技术：
甘暮病毒病害(Sweet potato virus diseases, SPVD)是由甘暮極绿矮化病毒 potato chlorotic stunt virus, SPCSV)禾口甘薯羽状斑驳病毒(51 腳 potato feathery mottle 狀，SPFMV)协生共侵染甘薯引起的病毒病害。SPVD是上世纪70年代首先在非洲 发现，目前主要分布在非洲和南美的一些国家。感染SPVD的甘薯表现为植株矮化、叶片褪 绿、扭曲变形、脉明等症状。该病对甘薯产量影响极大，在非洲，病害严重时可造成减产80% 以上，甚至绝收，SPVD是甘薯上最危险的病害之一。目前，发明人已在我国的广东、四川、江 苏等地首次检测到SPVD的存在，为了加强对该病的预警和控制，防止该病的进一步蔓延危 害，必须建立快速、高效的检测技术。目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附(ELISA)技术和PCR技术，由 于ELISA技术的灵敏度较低，而且需要分别检测SPCSV和SPFMV才能确定SPVD是否存在。 另外SPFMV在中国至少存在CH和CH2两个株系类型，由于SPCSV与SPFMV不同的株系类型 互作可能引起不同的产量损失，利用ELISA方法还不能有效区分SPFMV不同株系。而利用 单一的RT-PCR进行检测时，也需要分别对SPCSV和SPFMV进行检测才能确定SPVD是否存 在，工作量大，效率低。
发明内容
本发明要解决的技术问题克服现有的甘薯病毒检测的缺点，提供一种在一次PCR反 应中检测危险性甘薯病毒病害SPVD是否存在以及存在类型的方法，为甘薯病毒的特异性 检测提供了一种简便、高效和低成本的方法。本发明的技术方案是
甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤
(1)分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物CSV1和CSV 2;甘薯羽状斑驳病毒的引物FMV 1和FMV 2 ；甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物FMVCH，甘薯羽状斑驳病毒CH2株系的上 游引物FMVCH2，所述引物序列为
CSV 1 5 ‘ -AGTGGTGAYGTAATAGTCGGTGG-3 ‘， CSV 2 5 ‘ -GCTAACGATTCACADACAGACTTCA-3 ‘， FMV 1 5 ‘ -GARCARTTYCRMGCATGGTATGA-3 ‘， FMV 2 5 ‘ -GAAGTGYGTCATRATYTGCCTAA-3 ‘， FMVCH 5 ‘ -GCGTGATACGAGCAAAGAAAAGG-3 ‘， FMVCH2 5 ‘ - CCAAAAGGGGCATTTACAGCACC-3 ‘， 其中Y为C或T，D为G、A或T，R为A或G，M为A或C;
(2)提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板，进行反转录；
(3)将所述CSV 1、CSV 2, FMV 1、FMV 2、FMVCH和FMVCH2弓丨物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增； (4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。所述反转录时的反应体系为10μ1，包括2μ1 5XRT buffer, μ 浓度为25mmol/ L 的 MgCl2, μ 浓度各为 10mmol/L 的 dNTP 混合物，CSV 2 引物 0. 5μ1，FMV 2 引物 0. 5μ1， 0. 25μ1浓度为40υ/μ1的抑制剂，0. 5μ1浓度为5_的反转录酶，4. 25μ1甘薯叶片的总 RNA ；所述CSV 2、FMV 2引物浓度均为10Mmol/L。所述PCR 反应体系为 25μ1，包括2. 5μ1 10XPCR buffer, 0. 3μ1 浓度为 5υ/μ1 的 Taq酶，2μ1浓度各为2. 5mmol/L的dNTP混合物，1. 3μ1浓度为25mmol/L的MgCl2溶液， CSV 1 引物 0. 5Pl、CSV 2 引物 0. 5Pl、FMV 1 引物 0. 2Pl、FMV2 引物 1. 3Pl、FMVCH 引物 0. 3μ1、 FMVCH2引物0. 5μ1，所述引物浓度均为lOMmol/L，用2μ1反转录产物作模板，用DEPC- H2O 补足至25μ1。所述反转录时反应程序为42°C 40min,99°C 5min,5°C 5min，反应后得到反转录产物。所述PCR反应程序为94°C预变性3min，94°C变性30s，退火30s，72°C延伸 40s, 30个循环，最后72°C延伸lOmin。本发明的有益效果
(1)本发明建立了在一次PCR反应中即可检测出危险性甘薯病毒病害SPVD是否存在 的方法，并且可有效区分SPFMV的株系类型，能对SPVD的危险程度及时预警，为该病的防控 提供可靠依据。而目前单一的RT-PCR检测，需要分别对SPCSV和SPFMV进行检测才能确定 SPVD是否存在，本发明的检测方法的工作量大大降低，工作效率大大提高。(2)本发明利用建立的多重RT-PCR体系对疑似SPVD病毒甘薯样品进行检测，检测 结果与单一的RT-PCR检测结果一致，进一步证明了本发明方法的可行性。(3)本发明可应用于脱毒甘薯的培育过程中，通过对SPVD的快速高效检测，可以 确保脱毒甘薯的质量和增产效果。(4)本发明可有效区分甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)的株系类型，及时对SPVD的危 险程度进行预警，可应用于甘薯种薯调运以及病害调查等过程中，防止该病的进一步扩散。
图1 多重PCR反应中引物浓度对实验结果的影响
图中1-6分别表示4种上游引物FMVl、FMVCH、FMVCH2、CSVl的比例分别 为 0.2:0. 2:0.4:0.4>0.2:0.4:0.4:0.4>0.2:0.4:0.6:0.6>0.3:0.3:0.6:0.6> 0. 2:0. 4:0. 4:0. 4、0· 2:0. 4:0. 6:0. 6。图2 多重PCR反应中退火温度对实验结果的影响
图中 1-6 分别表示退火温度为:50. 0°C、51. 9°C >53. 7°C >56. 1°C、58. 0°C禾口 60. 0°C。图3 多重PCR反应中dNTP混合物浓度对实验结果的影响
图中 1-6 分别表示 dNTP 浓度为:0μ1、0. 5μ1、1· 0μ1、1· 5μ1、2· 0μ1、2· 5μ1。图4 多重PCR反应中Mg2+浓度对实验结果的影响
图中 1-6 分别表示 Mg2+浓度为:0μ1、0. 5μ1、 μ1、1. 5μ1、2μ1、2. 5μ1。图5 多重PCR反应中酶浓度对实验结果的影响
图中 1-6 分别表示 0μ1、0· μ1、0· 2μ1、0· 3μ1、0· 4μ1、0· 5μ1。
图6 多重和单一 RT-PCR检测结果比较
图中1-5分别表示引物混扩增、FMVCH2引物扩增、FMVCH引物扩增、CSV引物扩增、FMV 通用引物扩增。图7 多重RT-PCR的特异性检测结果
图中1-5分别表示混样、苏-10-34、苏-10-45、渝_10_1、阴性对照。图8 多重RT-PCR的灵敏性测试结果
图中1-7分别表示叶片总RNAU0—1倍稀释、10_2倍稀释、10_3倍稀释、10_4倍稀释、10_5 倍稀释、10_6倍稀释。
具体实施例方式
以下结合实施例详细说明本发明，其中出现的百分比浓度如无特别说明，均指质量百 分比浓度。实施例1 甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法 (一)材料和方法
1、引物的设计与合成
根据SPCSV和SPFMV病毒的基因组序列，设计以下引物，引物由TaKaRa公司合成。引 物序列见下表1。
权利要求
1.甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，(1)分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物CSV1和CSV 2;甘薯羽状斑驳病毒的引物FMV 1和FMV 2 ；甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物FMVCH，甘薯羽状斑驳病毒CH2株系的上 游引物FMVCH2，所述引物序列为CSV 1 5 ‘ -AGTGGTGAYGTAATAGTCGGTGG-3 ‘， CSV 2 5 ‘ -GCTAACGATTCACADACAGACTTCA-3 ‘， FMV 15 ‘ -GARCARTTYCRMGCATGGTATGA-3 ‘， FMV 2 5 ‘ -GAAGTGYGTCATRATYTGCCTAA-3 ‘， FMVCH 5 ‘ -GCGTGATACGAGCAAAGAAAAGG-3 ‘， FMVCH2 5 ‘ - CCAAAAGGGGCATTTACAGCACC-3 ‘， 其中Y为C或T，D为G、A或T，R为A或G，M为A或C;(2)提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板，进行反转录；(3)将所述CSV 1、CSV 2, FMV 1、FMV 2、FMVCH和FMVCH2弓丨物置于PCR反应体系中， 以反转录产物作为模板，进行PCR扩增； (4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述反转录时的反应体 系为 10μ1，包括2μ1 5 X RT buffer, μ 浓度为 25mmol/L 的 MgCl2, μ 浓度各为 IOmmol/ L的dNTP混合物，CSV 2引物0. 5μ1，FMV 2引物0. 5μ1，0· 25μ1浓度为40υ/μ1的抑制剂， 0. 5μ1浓度为5υ/μ1的反转录酶，4. 25μ1甘薯叶片的总RNA ；所述CSV 2,FMV 2引物浓度均 为 10Mmol/L。
3.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为 25μ1，包括2. 5μ1 10XPCR buffer，0. 3μ1 浓度为 5υ/μ1 的 Taq 酶，2μ1 浓度各为 2. 5mmol/ L的dNTP混合物，1. 3μ1浓度为25mmol/L的MgCl2溶液，CSV 1引物0. 5μ1、CSV 2引物 0. 5μ1、FMV 1 引物 0. 2μ1、FMV2 引物 1. 3μ1、FMVCH 引物 0. 3μ1、FMVCH2 引物 0. 5μ1，所述引 物浓度均为lOMmol/L，用2μ1反转录产物作模板，用DEPC- H2O补足至25μ1。
4.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述反转录时反应程序 为42°C 40min,99°C 5min，5°C 5min，反应后得到反转录产物。
5.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应程序为 94°C预变性3min，94°C变性30s，退火30s，72°C延伸40s，30个循环，最后72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本发明涉及一种危险性甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法，先分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物、甘薯羽状斑驳病毒的引物、甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物，然后提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板，进行反转录；将上述引物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；PCR反应程序为94℃预变性3min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s,30个循环，最后72℃延伸10min；最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。本发明建立了在一次PCR反应中即可检测出甘薯病毒病害SPVD是否存在的方法，并且可有效区分SPFMV的株系类型，检测效率提高，并能对SPVD的危险程度及时预警，为该病防控提供可靠依据。
文档编号C12Q1/68GK102108419SQ20101056566
公开日2011年6月29日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者乔奇, 张德胜, 张振臣, 王永江, 田雨婷, 秦艳红 申请人:河南省农业科学院植物保护研究所