专利名称:甘薯病毒病害spvd的多重rt-pcr检测方法
技术领域:
本发明涉及甘薯病毒的RT-PCR检测,属于生物工程技术领域,特别是涉及一种危 险性甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法。
背景技术:
甘暮病毒病害(Sweet potato virus diseases, SPVD)是由甘暮極绿矮化病毒 potato chlorotic stunt virus, SPCSV)禾口甘薯羽状斑驳病毒(51 腳 potato feathery mottle 狀,SPFMV)协生共侵染甘薯引起的病毒病害。SPVD是上世纪70年代首先在非洲 发现,目前主要分布在非洲和南美的一些国家。感染SPVD的甘薯表现为植株矮化、叶片褪 绿、扭曲变形、脉明等症状。该病对甘薯产量影响极大,在非洲,病害严重时可造成减产80% 以上,甚至绝收,SPVD是甘薯上最危险的病害之一。目前,发明人已在我国的广东、四川、江 苏等地首次检测到SPVD的存在,为了加强对该病的预警和控制,防止该病的进一步蔓延危 害,必须建立快速、高效的检测技术。目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附(ELISA)技术和PCR技术,由 于ELISA技术的灵敏度较低,而且需要分别检测SPCSV和SPFMV才能确定SPVD是否存在。 另外SPFMV在中国至少存在CH和CH2两个株系类型,由于SPCSV与SPFMV不同的株系类型 互作可能引起不同的产量损失,利用ELISA方法还不能有效区分SPFMV不同株系。而利用 单一的RT-PCR进行检测时,也需要分别对SPCSV和SPFMV进行检测才能确定SPVD是否存 在,工作量大,效率低。
发明内容
本发明要解决的技术问题克服现有的甘薯病毒检测的缺点,提供一种在一次PCR反 应中检测危险性甘薯病毒病害SPVD是否存在以及存在类型的方法,为甘薯病毒的特异性 检测提供了一种简便、高效和低成本的方法。本发明的技术方案是
甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法,包括以下步骤
(1)分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物CSV1和CSV 2;甘薯羽状斑驳病毒的引物FMV 1和FMV 2 ;甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物FMVCH,甘薯羽状斑驳病毒CH2株系的上 游引物FMVCH2,所述引物序列为
CSV 1 5 ‘ -AGTGGTGAYGTAATAGTCGGTGG-3 ‘, CSV 2 5 ‘ -GCTAACGATTCACADACAGACTTCA-3 ‘, FMV 1 5 ‘ -GARCARTTYCRMGCATGGTATGA-3 ‘, FMV 2 5 ‘ -GAAGTGYGTCATRATYTGCCTAA-3 ‘, FMVCH 5 ‘ -GCGTGATACGAGCAAAGAAAAGG-3 ‘, FMVCH2 5 ‘ - CCAAAAGGGGCATTTACAGCACC-3 ‘, 其中Y为C或T,D为G、A或T,R为A或G,M为A或C;
(2)提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板,进行反转录;
(3)将所述CSV 1、CSV 2, FMV 1、FMV 2、FMVCH和FMVCH2弓丨物置于PCR反应体系中,以反转录产物作为模板,进行PCR扩增; (4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。所述反转录时的反应体系为10μ1,包括2μ1 5XRT buffer, μ 浓度为25mmol/ L 的 MgCl2, μ 浓度各为 10mmol/L 的 dNTP 混合物,CSV 2 引物 0. 5μ1,FMV 2 引物 0. 5μ1, 0. 25μ1浓度为40υ/μ1的抑制剂,0. 5μ1浓度为5_的反转录酶,4. 25μ1甘薯叶片的总 RNA ;所述CSV 2、FMV 2引物浓度均为10Mmol/L。所述PCR 反应体系为 25μ1,包括2. 5μ1 10XPCR buffer, 0. 3μ1 浓度为 5υ/μ1 的 Taq酶,2μ1浓度各为2. 5mmol/L的dNTP混合物,1. 3μ1浓度为25mmol/L的MgCl2溶液, CSV 1 引物 0. 5Pl、CSV 2 引物 0. 5Pl、FMV 1 引物 0. 2Pl、FMV2 引物 1. 3Pl、FMVCH 引物 0. 3μ1、 FMVCH2引物0. 5μ1,所述引物浓度均为lOMmol/L,用2μ1反转录产物作模板,用DEPC- H2O 补足至25μ1。所述反转录时反应程序为42°C 40min,99°C 5min,5°C 5min,反应后得到反转录产物。所述PCR反应程序为94°C预变性3min,94°C变性30s,退火30s,72°C延伸 40s, 30个循环,最后72°C延伸lOmin。本发明的有益效果
(1)本发明建立了在一次PCR反应中即可检测出危险性甘薯病毒病害SPVD是否存在 的方法,并且可有效区分SPFMV的株系类型,能对SPVD的危险程度及时预警,为该病的防控 提供可靠依据。而目前单一的RT-PCR检测,需要分别对SPCSV和SPFMV进行检测才能确定 SPVD是否存在,本发明的检测方法的工作量大大降低,工作效率大大提高。(2)本发明利用建立的多重RT-PCR体系对疑似SPVD病毒甘薯样品进行检测,检测 结果与单一的RT-PCR检测结果一致,进一步证明了本发明方法的可行性。(3)本发明可应用于脱毒甘薯的培育过程中,通过对SPVD的快速高效检测,可以 确保脱毒甘薯的质量和增产效果。(4)本发明可有效区分甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)的株系类型,及时对SPVD的危 险程度进行预警,可应用于甘薯种薯调运以及病害调查等过程中,防止该病的进一步扩散。
图1 多重PCR反应中引物浓度对实验结果的影响
图中1-6分别表示4种上游引物FMVl、FMVCH、FMVCH2、CSVl的比例分别 为 0.2:0. 2:0.4:0.4>0.2:0.4:0.4:0.4>0.2:0.4:0.6:0.6>0.3:0.3:0.6:0.6> 0. 2:0. 4:0. 4:0. 4、0· 2:0. 4:0. 6:0. 6。图2 多重PCR反应中退火温度对实验结果的影响
图中 1-6 分别表示退火温度为:50. 0°C、51. 9°C >53. 7°C >56. 1°C、58. 0°C禾口 60. 0°C。图3 多重PCR反应中dNTP混合物浓度对实验结果的影响
图中 1-6 分别表示 dNTP 浓度为:0μ1、0. 5μ1、1· 0μ1、1· 5μ1、2· 0μ1、2· 5μ1。图4 多重PCR反应中Mg2+浓度对实验结果的影响
图中 1-6 分别表示 Mg2+浓度为:0μ1、0. 5μ1、 μ1、1. 5μ1、2μ1、2. 5μ1。图5 多重PCR反应中酶浓度对实验结果的影响
图中 1-6 分别表示 0μ1、0· μ1、0· 2μ1、0· 3μ1、0· 4μ1、0· 5μ1。
图6 多重和单一 RT-PCR检测结果比较
图中1-5分别表示引物混扩增、FMVCH2引物扩增、FMVCH引物扩增、CSV引物扩增、FMV 通用引物扩增。图7 多重RT-PCR的特异性检测结果
图中1-5分别表示混样、苏-10-34、苏-10-45、渝_10_1、阴性对照。图8 多重RT-PCR的灵敏性测试结果
图中1-7分别表示叶片总RNAU0—1倍稀释、10_2倍稀释、10_3倍稀释、10_4倍稀释、10_5 倍稀释、10_6倍稀释。
具体实施例方式
以下结合实施例详细说明本发明,其中出现的百分比浓度如无特别说明,均指质量百 分比浓度。实施例1 甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法 (一)材料和方法
1、引物的设计与合成
根据SPCSV和SPFMV病毒的基因组序列,设计以下引物,引物由TaKaRa公司合成。引 物序列见下表1。
权利要求
1.甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法,其特征在于,(1)分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物CSV1和CSV 2;甘薯羽状斑驳病毒的引物FMV 1和FMV 2 ;甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物FMVCH,甘薯羽状斑驳病毒CH2株系的上 游引物FMVCH2,所述引物序列为CSV 1 5 ‘ -AGTGGTGAYGTAATAGTCGGTGG-3 ‘, CSV 2 5 ‘ -GCTAACGATTCACADACAGACTTCA-3 ‘, FMV 15 ‘ -GARCARTTYCRMGCATGGTATGA-3 ‘, FMV 2 5 ‘ -GAAGTGYGTCATRATYTGCCTAA-3 ‘, FMVCH 5 ‘ -GCGTGATACGAGCAAAGAAAAGG-3 ‘, FMVCH2 5 ‘ - CCAAAAGGGGCATTTACAGCACC-3 ‘, 其中Y为C或T,D为G、A或T,R为A或G,M为A或C;(2)提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板,进行反转录;(3)将所述CSV 1、CSV 2, FMV 1、FMV 2、FMVCH和FMVCH2弓丨物置于PCR反应体系中, 以反转录产物作为模板,进行PCR扩增; (4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法,其特征在于,所述反转录时的反应体 系为 10μ1,包括2μ1 5 X RT buffer, μ 浓度为 25mmol/L 的 MgCl2, μ 浓度各为 IOmmol/ L的dNTP混合物,CSV 2引物0. 5μ1,FMV 2引物0. 5μ1,0· 25μ1浓度为40υ/μ1的抑制剂, 0. 5μ1浓度为5υ/μ1的反转录酶,4. 25μ1甘薯叶片的总RNA ;所述CSV 2,FMV 2引物浓度均 为 10Mmol/L。
3.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法,其特征在于,所述PCR反应体系为 25μ1,包括2. 5μ1 10XPCR buffer,0. 3μ1 浓度为 5υ/μ1 的 Taq 酶,2μ1 浓度各为 2. 5mmol/ L的dNTP混合物,1. 3μ1浓度为25mmol/L的MgCl2溶液,CSV 1引物0. 5μ1、CSV 2引物 0. 5μ1、FMV 1 引物 0. 2μ1、FMV2 引物 1. 3μ1、FMVCH 引物 0. 3μ1、FMVCH2 引物 0. 5μ1,所述引 物浓度均为lOMmol/L,用2μ1反转录产物作模板,用DEPC- H2O补足至25μ1。
4.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法,其特征在于,所述反转录时反应程序 为42°C 40min,99°C 5min,5°C 5min,反应后得到反转录产物。
5.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法,其特征在于,所述PCR反应程序为 94°C预变性3min,94°C变性30s,退火30s,72°C延伸40s,30个循环,最后72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本发明涉及一种危险性甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法,先分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物、甘薯羽状斑驳病毒的引物、甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物,然后提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板,进行反转录;将上述引物置于PCR反应体系中,以反转录产物作为模板,进行PCR扩增;PCR反应程序为94℃预变性3min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s,30个循环,最后72℃延伸10min;最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。本发明建立了在一次PCR反应中即可检测出甘薯病毒病害SPVD是否存在的方法,并且可有效区分SPFMV的株系类型,检测效率提高,并能对SPVD的危险程度及时预警,为该病防控提供可靠依据。
文档编号C12Q1/68GK102108419SQ20101056566
公开日2011年6月29日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者乔奇, 张德胜, 张振臣, 王永江, 田雨婷, 秦艳红 申请人:河南省农业科学院植物保护研究所