专利名称：三疣梭子蟹微卫星ssr-18检测技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种三疣梭子蟹微卫星位点遗传多态性的检测技术，可以应用于三 疣梭子蟹遗传多态性检测和家系识别等领域，是一种DNA分子标记技术。
背景技术：
DNA分子标记是能够用来作为指纹鉴定或区分基因组中某种差异特征的DNA片 段，这种标记在遗传学研究和生物技术应用方面越来越成为有用的工具。在基因组水平 上，由于DNA上核苷酸碱基的突变造成不同的生物个体之间存在着一定的差别，进而造成 许多基因组DNA序列的多态性，即这些序列在不同的个体间是有差别的。分子标记技术就 是把这些差别用分子生物学方法表现出来的技术，目前主要有以下几种分子标记技术限 制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，缩写 RFLP)、微卫星 (Microsatellite)或简单重复序列(Simple sequence repeats，缩写SSR)、随机扩增多态 性DNA(Random amplified polymorphic DNA，缩写RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,缩写 AFLP)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写SNP)技术等。其中微卫星分子标记技术(Microsatellite)是由串联重 复序列组成，其核心序列为1-6个核苷酸，其中两碱基重复数目最多。微卫星分子标记技术 利用PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增的原理，在核心重复序列区两端非重复序列区 设计PCR扩增引物，扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，经染色处理后可以显示 出扩增的结果。微卫星广泛分布于真核生物基因组中，因重复单元数目不同而呈现高度多 态性，已成为非常重要的分子遗传标记之一，具有数量多、分布广且均勻、多态性丰富、分析 快速方便等一系列优点，并具有重要的理论意义和深远的应用前景。该技术最早于1994年 由Zietkiewicz创建。微卫星呈孟德尔共显性遗传，可以区别纯合显性个体和杂合显性个 体，是家系或者个体识别以及群体遗传多态性分析的有用工具。值得一提的是，通常所说的 微卫星技术是泛指一切以基因组中核心重复序列区重复序列的多态性为检测对象的技术， 具体到基因组中的各个重复序列区，则每个重复序列所在的序列区被称为微卫星基因座， 针对每个基因座可以开发出相应的微卫星位点检测技术，本专利所申请的就是这样一种特 定基因座的分析检测技术。目前，海洋生物中已经广泛利用该技术进行了群体遗传多态性分析、遗传图谱构 建、系谱认证等工作。在海洋水产生物三疣梭子蟹中的研究起步较晚，开发出来的微卫星数 量也较少，但少数开发的几个微卫星基因座扩增技术都申请了国家发明专利，如“三疣梭子 蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术”(200810017119)、三疣“梭子蟹ptssrl7微卫星DNA 标记的检测技术” O00810017118)。鉴于微卫星分子标记技术在遗传结构分析中的广泛用 途，开发更多的三疣梭子蟹微卫星基因座分子标记检测技术具有重要的理论和应用价值。
发明内容
本发明描述了一个新的三疣梭子蟹微卫星基因座检测技术，为三疣梭子蟹家系识别和遗传结构分析提供了一个新的技术，主要内容为通过提取三疣梭子蟹基因组DNA，利用 含有重复序列的随机引物PCR扩增基因组DNA，利用扩增产物建立基因组文库，对基因组文 库进行测序，查找测序序列中含有微卫星重复序列的片段，以重复序列为核心设计微卫星 扩增引物，以PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色的方法检测这些引物的扩增结果，从 中挑选出一个编号为SSR-15微卫星引物，建立一个适合于三疣梭子蟹家系识别和遗传结 构分析的微卫星基因座检测技术。
图中显示的编号1-20为来源于不同家系的混合个体，21-30为单一家系的10个个 体，M为DNA分子量标准Marker的缩写。微卫星SSR-18在1_30个个体中检测出来的基因 型见表 1。在编号 1-20 个体中，共扩增出 106bp、178bp、202bp、211bp、218bp、219bp、2;35bp、 243bp共8个等位基因，在编号21-30单一家系10个个体中共扩增出211bp、231bp三个等 位基因，而且这些等位基因在这一单个家系中的分布规律符合来源于同一家系父母本在某 一等位基因座的遗传分离规律，即从中可以推断出父亲和母亲的基因型均为211/231。图中 分子量Marker有三条带，最上面的条带指示的标准为250bp。
权利要求
1.三疣梭子蟹微卫星SSR-18检测技术通过提取三疣梭子蟹基因组DNA，建立三疣梭子蟹微卫星富集文库，以及对文库的测序 和PCR引物设计，获得了一对适合于三疣梭子蟹系谱认证和遗传结构分析的微卫星引物， 其特征在于正向引物序列为5’-CAAAGCGACGCAACTCATAA-3’，反向引物序列为 5， -AGGGAACACAGGACCCAAGA-3，。
全文摘要
本发明是一种三疣梭子蟹微卫星SSR-18检测技术，其特征是首先提取三疣梭子蟹基因组DNA，然后建立三疣梭子蟹富含微卫星的基因组文库，再对文库进行测序获得富含微卫星的序列；挑选出基因组文库中的SSR-18序列，并在其序列两端设计适合PCR扩增的特异性引物，并对三疣梭子蟹基因组DNA进行PCR扩增，将获得的PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型。本发明适用于三疣梭子蟹系谱认证、遗传图谱构建和遗传结构分析等研究。
文档编号C12Q1/68GK102140504SQ20101056964
公开日2011年8月3日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者于飞, 董志国, 阎斌伦, 陈百尧, 高焕 申请人:淮海工学院