专利名称：培养碱性土壤中优势菌--真菌的方法
技术领域：
本发明属于土壤微生物的分离纯化技术领域，尤其是涉及一种碱性土壤培养优势菌真菌的分离纯化方法。
背景技术：
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、 纯化得到许多有价值的菌株。土壤中微生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物。 微生物以细菌数量最多，细菌占土壤微生物总量的70% 90%，且种类多，多数是异养菌。 放线菌的数量仅次于细菌，多存在于偏碱性的土壤中，主要是链霉菌属、诺卡菌属和小单孢菌属等。土壤中的微生物有些对农业有害，如反硝化细菌，能把硝酸盐还原成氨散失到大气中，降低土壤肥力，但多数是对农业有益的。土壤中的真菌有许多能分解纤维素、木质素和果胶等，对自然界物质循环起重要作用。真菌菌丝的积累，能使土壤的物理结构得到改善。 放线菌能产生抗生素。总之土壤中的微生物对增加土壤肥力、改善土壤结构、促进自然界的物质循环具有重要作用。针对土壤中不同的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。目前我们经常所做的是从土壤中分离细菌、真菌、放线菌三类优势菌，通常采用的是牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌、高氏一号培养基培养放线菌、马丁氏培养基培养真菌，针对不同的菌种配制PH值不同的培养基以适合各类菌种的培养。一般从土壤中分离微生物的目的是测定不同的微生物在土壤里的含量，其优势菌有哪几种，但是，培养基都是参照菌种的适宜生长条件配制的，而与它原生的土壤条件存在差异，这是不符合实际的一种测定方法。测出的数据存在一定的误差，因而经常所用的这种培养基培养方法不能很好的表达土壤中微生物的含量，影响了从土壤微生物分离纯化研究的进一步发展。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，打破常规的培养基培养菌种的方法，本发明目的旨在提供一种碱性土壤培养优势菌真菌的方法，实现真菌的培养基培养条件与土壤中的生长条件保持一致，以利于更加精确地测得碱性土壤中其优势菌一真菌的含量。为了实现上述目的，本发明从碱性土壤中分离出真菌，利用改良的马丁氏培养基培养真菌，使培养基培养条件与土壤中真菌的生长条件保持一致，测定其真菌的含量，具体采用如下技术方案该方法通过以下步骤实现(1)样本采集及处理采用对角线5点取样法，每点分别取地表IOcm和15cm深度土壤，等份混勻，过30 目筛子，用无菌塑料袋分装，立即置于4度冰箱中保存。在24小时内进行真菌培养。(2)培养基的配制马丁氏培养基由如下组分以重量份组成=K2HPO4I份，MgSO4. 7H20 0. 5份，蛋白胨5 份，葡萄糖10份，琼脂15-20份，水1000份，孟加拉红水溶液2. 5份，自然pH。改良后的马丁氏培养基由如下组分以重量份组成=K3PO41份，NaCl 4份， MgSO4. 7H20 0. 5份，蛋白胨5份，葡萄糖10份，琼脂15-20份，水1000份。用10% NaOH调其PH与上述碱性土壤的PH值一致，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。按上述组分称量，并将其溶解在水中；调其PH与碱性土壤的PH值一致；将其分装、包扎、灭菌。(3)制作平板将步骤(2)经过灭菌的马丁氏培养基置于水浴锅中冷却到45-50°C立刻倒平板， 培养基需满皿底的2/3，凝固后即制成平板。(4)制备土壤稀释液称取步骤(1)采取的碱性土样，使土样与无菌水充分混合，成为土壤悬液，经过稀释制备出不同稀释度的土壤稀释液。(5)涂布用无菌吸管分别从步骤(4)制得的不同稀释度的土壤稀释液中各吸取菌液涂布均勻于步骤(3)已备好的平板上；静置，放入温箱倒置培养。(6)优势菌的分离纯化用接种环以无菌操作法分别从上述平板培养基上不同形态菌落中挑取一环菌种， 在改良后的马丁氏培养基中进行划线分离，并标记优势菌种，放入恒温培养箱中培养观察； 重复以上操作至培养基上出现单一菌种，将纯化后的菌种编号并接种在相应选择培养基中，培养后保存备用。本发明所述的优势菌的分离与纯化，真菌采用的是真菌的点植培养和形态观察。本发明创新点在于在实验中通过改良的马丁氏培养基，将其用于所采集土壤样品中的真菌进行接种，经过培养后，进一步使用选择培养基对培养菌种进行培养，以达到纯化、分离真菌的目的。本发明优点和积极效果如下土壤微生物分离与纯化由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的PH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 一般培养真菌都是用马丁氏培养基培养，因为真菌喜欢在酸性条件下生存。而在此，本发明打破常规改变其配方调节PH值，使其营养条件更接近碱性土壤，通过一系列的步骤最终培养出了真菌，让土壤真菌的分离更接近实际，数据更精确。真菌的点植培养和形态观察对从培养基中选出的真菌分别做点植培养，培养后观察记录真菌的菌丝和产无性孢子的子实体的形态，通过比较对微生物形态等有所进一步的了解与认识。
图1是本发明分离纯化程序示意图。
具体实施例方式为对本发明进行更好的说明，举实施例如下实施例以河南某农业基地的碱性土壤为样。1、样本采集及处理在两块土地上分别采取碱性土样，每块土地采用对角线5点取样法，每点分别取地表IOcm和15cm深度土壤，等份混勻，过30目筛子，用无菌塑料袋分装，立即置于4°C冰箱中保存。在24小时内进行真菌培养，每点取样量一致，将土样均勻混合并。土壤1和土壤 2其PH值分别为7. 5和8.3。2、真菌培养基的配制马丁氏培养基由如下组分以重量份组成=K2HPO4I份，MgSO4. 7H20 0. 5份，蛋白胨5 份，葡萄糖10份，琼脂15-20份，水1000份，孟加拉红水溶液2. 5份，自然pH。改良后的马丁氏培养基由如下组分以重量份组成=K3PO4I份，NaCl 4份， MgSO4. 7Η200· 5份，蛋白胨5份，葡萄糖10份，琼脂15-20份，水1000份。用10% NaOH调其 PH与上述碱性土壤的PH值一致，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口上引起杂菌污染。三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。用0. lMpa(151b/in2)高压蒸汽灭菌15 20min。3、倒平板将步骤2制得的上述两种马丁氏培养基置于水浴锅中冷却到45-50°C，立刻倒平板，培养基需满皿底的2/3。倒入后立即轻轻摇动培养皿，使其均勻。水平放置待其冷却，凝固后即制成平板。上述过程都进行无菌操作。4、制备土壤稀释液称取两种土样各10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使土样与水充分混合，将细胞分散。静置，成为土壤悬液( ο—1)。用ImL的无菌吸头从土壤悬液 (10—1)中吸取ImL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，振荡混勻，成为土壤悬液(10_2)。 然后再用同一支ImL吸头，从土壤悬液(10_2)中吸取ImL注入另一盛有9mL无菌水的试管中，成为土壤悬液(10_3)。5、涂布用一支ImL无菌吸管分别从稀释度IO-1UO-2和10_3的土壤稀释液中各吸取0. 5mL 菌液，用无菌玻璃涂棒均勻涂布在步骤3已制备好的平板上，每个浓度做3个平板。将已经接种的平皿静置IOmin后，放入温箱倒置培养3-5日(28°C )。6、真菌的分离纯化用接种环以无菌操作法分别从平板培养基上不同形态菌落中挑取一环菌种，分别在两种马丁氏培养基中进行划线分离，并标记优势菌种.放入恒温培养箱中培养24h后观察；重复以上操作至培养基上出现单一菌种，将纯化后的菌种编号并接种在相应选择培养基中，培养48h后4°C下保存备用。培养结束后，根据在固体培养基上所形成的一个菌落，也就是说一个菌落即代表一个单细胞这一生理及培养特征进行计数，统计菌落数目，即可计算出每克土壤中的真菌含量，即稀释平板计数法。本发明在进行纯化及培养后，对该土壤所形成的菌落形态进行观察，发现许多菌落呈现的颜色、形态、透明程度，均有所不同，观察到的真菌主要菌种青霉菌落特征菌落较大，地疏松，外观干燥而不透明，菌落与培养基连接紧密，不易挑取，其正反面颜色不同，正面为浅绿色，反面为淡黄色，边缘不整齐，高度较高，明显隆起。根霉菌落特征菌落无定形，为絮状，高度很高，覆盖整个培养皿，质地疏松，外观干燥为褐色、不透明。 菌落与培养基连接紧密，不易挑取。在同样采样及实验条件下，本专利技术方法测得该土壤中真菌结果和现有技术手段测得该土壤中真菌结果如下(XlO6可培养活菌落数/g千土)
权利要求
1.一种培养碱性土壤中优势菌--真菌的方法，其特征在于，该方法通过以下步骤实现(1)样本采集及处理采集碱性土样，每个地点在不同位置至少各取3个样.每点取样量一致，将土样均勻混合并用无菌袋分装；(2)改良马丁氏培养基配制改良马丁氏培养基由如下组分以重量份组成=K3PO4I份，NaCl 4份，MgS04.7H20 0.5份， 蛋白胨5份，葡萄糖10份，琼脂15-20份，水1000份。用10% NaOH调其PH与上述碱性土壤的PH值一致，将其分装、包扎、灭菌。(3)、制作平板将步骤(2)经过灭菌、改良后的马丁氏培养基置于水浴锅中冷却到45 50°C立刻倒平板，培养基需满皿底的2/3，凝固后即制成平板；(4)、制备土壤稀释液称取步骤(1)采取的碱性土样，使土样与无菌水充分混合，成为土壤悬液，经过稀释制备出不同稀释度的土壤稀释液；(5)、涂布用无菌吸管分别从步骤(4)制得的不同稀释度的土壤稀释液中各吸取菌液涂布均勻于步骤(3)已备好的平板上；静置，放入温箱倒置培养；(6)、优势菌的分离纯化用接种环以无菌操作法分别从上述平板培养基上不同形态菌落中挑取一环菌种，在改良后的马丁氏培养基中进行划线分离，并标记优势菌种，放入恒温培养箱中培养观察；重复以上操作至培养基上出现单一菌种，将纯化后的菌种编号并接种在相应选择培养基中，培养后保存备用。
2.如权利要求1所述的培养碱性土壤中优势菌一真菌的方法，其特征在于，采取的碱性土壤PH值在7. 0-8. 5之间。
全文摘要
本发明公开了一种培养碱性土壤中优势菌--真菌的方法，属于土壤微生物的分离纯化技术领域。该方法用改良后的马丁氏培养基培养碱性土壤中的真菌，通过采样、选择性培养、平板菌落计数(即活菌计数)、培养基的制备、高压蒸汽灭菌等步骤对碱性土壤中的微生物真菌进行分离计数。实现了真菌的培养基培养条件与土壤中的生长条件保持一致，利于更加精确地测定碱性土壤中其优势菌--真菌的含量。
文档编号C12N1/14GK102485882SQ20101057030
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月2日 优先权日2010年12月2日
发明者卢彩霞, 岳润清, 朱卫红, 杨影丽, 王延召, 铁双贵, 齐建双 申请人:河南省农业科学院