专利名称：辣椒疫霉荧光定量pcr检测法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明为一种荧光定量PCR检测辣椒疫霉的方法，专用于检测辣椒疫霉，属于农 作物病害诊断与防治技术领域，同时还包括检测用试剂盒。
背景技术：
辣椒疫霉寄主范围很广，可以侵染植物地上和地下部分，引起茄科、瓜类疫病。疫 霉菌以厚垣孢子或卵孢子形式在土壤中存活。在保护地农作物种植栽培过程中，辣椒疫霉 引致的辣椒上的土传病害发生越来越严重，发病严重的辣椒幼苗，先在茎基部形成暗绿色 水渍状病斑，迅速褐腐缢缩而猝倒。有的茎基部呈黑褐色，幼苗枯萎死亡。叶片感病，病斑 圆形或近圆形，直径2-3cm，边缘黄绿色，中央暗褐色。因其发生具有隐蔽性，大多在结果期 才达到发病的高峰期，因此损失巨大，严重影响了保护地的发展与人民的经济收入。辣椒疫霉菌的传统鉴定方法是采用选择性培养基进行分离培养，菌落形态观察， 显微镜下观察病菌的菌丝体，孢子等特征，结合田间发病植株症状的观察，确定病原菌的种 类。传统的鉴定方法在很多方面存在一定误差和困难，尤其是对疫霉菌的准确鉴定具有很 大局限性，所以仅依靠传统的分离培养方法及显微镜观察是不够的，为了便于准确鉴定，还 需要其他补充技术，尤其是分子生物学技术的应用。随着分子生物学技术的日益成熟和广 泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研究，对植物组织及土壤 中的病原菌进行鉴定。定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR 技术(real-time fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR)是一种在 PCR 反应体系中力口 入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩增产物熔解曲线分析可 以特异的检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技 术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反 应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研 究和医学研究等领域，但在农业研究领域，尤其是在辣椒疫霉的定性定量检测研究中应用 的较少。
发明内容
本发明的目的在于克服辣椒疫霉传统检测鉴定方法的不足，提供一种辣椒疫霉的 荧光定量PCR快速检测方法。该方法采用根据辣椒疫霉ITS区所设计的特异性引物，优化 荧光定量PCR反应体系，实现对发病植物组织中及土壤中的辣椒疫霉的快速检测定量。利 用实时荧光定量PCR检测技术体系，可以特异的检测和鉴定辣椒疫霉，并且可以作为辣椒 疫霉侵染辣椒植株过程中的监测手段。不仅提高了检测的准确性，还节约了检测时间。根据上述方法设计的试剂盒，在植物病害诊断与防治领域可以大规模推广。辣椒疫霉的PCR检测方法，以辣椒疫霉的DNA为模板进行PCR扩增检测，其特征在 于在PCR扩增反应体系中加入有如下一对特异性引物
特异性引物Ijyml :5，-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，特异性引物1 jym2 5，-CCACAGCAGGAAAAGCATT-3，。所述PCR 反应体系为10XPCR buffer 2 μ L, 15mM MgCl2O. 5 μ L, 2. 5mM dNTPs 1· 6μ L，5yM 弓丨物 ljyml/ljym2 各 0· 5 μ L，Taq 酶(5U/μ L) 0. 2 μ L, DNA 模板 1 μ L，灭菌双 蒸水13. 7 μ L，终体积为20 μ L，扩增检测的程序为:94°C预变性3min ；94°C变性lmin, 65°C 退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸IOmin0所述PCR检测为实时荧光PCR检测。所述PCR扩增反应体系中加入有荧光标记为SYBR Green Supermix。所述PCR反应总体积为20 μ L，其中包括SYBR Green Supermix用量10 μ L，浓度 为10 μ M/L特异性引物Ijyml用量1 μ L，浓度为10 μ M/L特异性引物ljym2用量1 μ L，DNA 模板用量1 μ L，其扩增程序为第一步95. OO0C 3分钟，1个循环；第二步95.O0C 45 秒，65. 0°C 45 秒，55. 0°C 1 分钟，45 个循环；第三步55. O0C 10分钟，95. 0°C 1分钟，1个循环；第四步55.0°C 1分钟，第五步55. O0C 10秒，80个循环。所述DNA模板来自于植物组织或土壤。辣椒疫霉的检测试剂盒，其特征在于包括一 PCR反应体系，该反应体系中含有上 述特异性引物对ljyml/ljym2。所述反应体系中还包括荧光标记SYBR Green Supermix。所述反应体系的总体积为20 μ L，其中包括SYBR Green Supermix用量10 μ L，浓 度为ΙΟμΜ/L特异性引物Ijyml用量1 μ L，浓度为ΙΟμΜ/L特异性引物ljym2用量lyL， 余量为无菌双蒸水7 μ L。所述PCR反应体系还包括标准阳性模板。本发明根据辣椒疫霉ITS区设计了的一对特异性引物Ijyml和1 jym2，在辣椒疫霉 检测中扩增出500bp的产物。采用引物对ljyml/ljym2对辣椒疫霉及其近缘种，属真菌，均 没有扩增出上述产物，证明该引物对ljyml/ljym2对辣椒疫霉的检测具有特异性。通过灵 敏度实验检测，该引物对1 jyml/1 jym2对辣椒疫霉的检测具有很高的灵敏性，其DNA浓度可 低至 0. 2ng/ml。本发明在反应体系中加入荧光物质SYBR Green Supermix，利用荧光信号的积累， 可以对辣椒疫霉进行定量分析。本发明对PCR反应体系进一步优化，实现对发病植物组织中及土壤中的辣椒疫霉 的快速检测定量。按照上述方法可以设计成试剂盒，该试剂盒中还可以提供阳性模板DNA，其浓度按 定量标准曲线制备的要求系列稀释。本发明的有益效果本发明提供一种辣椒疫霉的实时荧光定时PCR检测方法，可对植物组织及土壤中 的辣椒疫霉进行快速检测定量。与现有技术相比，本发明的有益效果是检测准确性高，特异性好，可从植物组织中及土壤中复杂的病原菌环境准确地检
4测到辣椒疫霉。检测灵敏度高，对辣椒疫霉的精确检测可达到3个孢子。操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制。定量检测，能真实反映 辣椒疫霉侵染植株的情况；可同时进行高通量的样本检测。本发明提供的试剂盒可对辣椒疫霉进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离 培养的传统鉴定方法，并适于在植物病害诊断及防治领域广泛推广应用。因此本发明提供一种荧光定量PCR法检测辣椒疫霉的试剂盒，实用性强，可满足 植物病害诊断及监测的需要。
图1为特异性检测引物对1 jyml/1 jym2对辣椒疫霉及其近缘种、属真菌的PCR扩
增结果。其中1-7号为引物对1 jyml/1 jym2扩增6种病原菌结果1.辣椒疫霉 (Phytophthora capsici) 2.番晚疫(Phytophthora infestans) 3.丰帛疫# (Phytophthora boehmeriae) 4. I ^fe β (Phytophthora parasitica) 5. iik β (Phytophthora cryptogea)6. Hj^e (Pythiumaphanidermatum) 7. % DNA X^tM M DNAMarker I图2为辣椒疫霉特异引物对ljyml/1 jym2的灵敏度检测结果。其中1-6号为引物对ljyml/1 jym2扩增辣椒疫霉DNA模板浓度从高至低系列稀释 (200ng/mL-2pg/mL) 7.无 DNA 模板对照 M. DL 2000Markero图3为标准样品和未知样品的辣椒疫霉荧光定量PCR扩增曲线图(y轴荧光吸收 率；X轴循环数)。图4为标准样品和未知样品的辣椒疫霉荧光定量PCR熔解曲线图，图示熔解温度 为 88 0C ο图5为标准样品和未知样品的辣椒疫霉荧光定量PCR标准曲线图。未知样品1.病根(有症状，7. 5 X IO2个孢子)，2.病茎(有症状，52个孢子)， 3.叶(无症状，40个孢子)4. 土样(5g 土壤，3个孢子)，标准样品辣椒疫霉质粒DNA系列 稀释(3父104-3个孢子)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1辣椒疫霉ITS区的克隆、测序1)辣椒疫霉DNA制备采用平板培养辣椒疫霉(Phytophthora capsici)，置于30°C的培养箱内，生长一 周左右，用灭菌的解剖针刮取菌丝体，收集于EP管内，_20°C保存备用。采用液氮研磨菌丝 体，常规CTAB法提取各菌株DNA。2)辣椒疫霉ITS区的扩增采用真菌rDNA ITS 扩增的通用引物 ITS1/ITS4 (White，T.J.，Bruns, Τ.，Lee, S. ， et al. ， Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenies. Innis MA, Glefand D H, Sninsky JJ, et al. a Guide to Methods andApplications. San Diego =AcademicPress, New York, 1990,315 322.)扩增辣椒疫霉的 ITS 区。PCR反应体系见表1。表IPCR反应体系
权利要求
辣椒疫霉的PCR检测方法，以辣椒疫霉的DNA为模板进行PCR扩增检测，其特征在于在PCR反应体系中加入有如下一对特异性引物特异性引物ljym15’ TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT 3’，特异性引物ljym25’ CCACAGCAGGAAAAGCATT 3’。
2.根据权利要求1所述的检测方法，所述PCR反应体系为10XPCRbuffer 2 μ L, 15mMMgCl20. 5μ L,2. 5mM dNTPs 1. 6 μ L，5 μ M 弓 | 物 1 jyml/1 jym2 各 0. 5 μ L，Taq 酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L，DNA模板1 μ L，灭菌双蒸水13. 7 μ L，终体积为20 μ L，扩增程序为94°C预变性 3min ；94°C变性 lmin，65°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，共 30 个循环；最后 72°C延伸 IOmin0
3.根据权利要求1所述的检测方法，所述PCR检测方法为实时荧光PCR检测方法。
4.根据权利要求3所述的检测方法，所述PCR反应体系中加入有荧光基团SYBR GreenSupermix0
5.根据权利要求4所述的检测方法，所述PCR反应总体积为20μ L，其中包括SYBR GreenSupermix用量10 μ L，浓度为ΙΟμΜ/L特异性引物Ijyml用量1 μ L，浓度为10 μ M/L 特异性引物ljym2用量1 μ L，DNA模板用量1 μ L，余量为无菌双蒸水7 μ L，其扩增程序为第一步95. OO0C 3分钟，1个循环；第二步95. O0C 45 秒，65. 0°C 45 秒，55. 0°C 1 分钟，45 个循环；第三步55. O0C 10分钟，95. O0C 1分钟，1个循环；第四步55. O0C 1分钟；第五步55. O0C 10秒，80个循环。
6.根据权利要求1所述的检测方法，所述DNA的模板来自于植物组织或土壤。
7.辣椒疫霉的检测试剂盒，其特征在于包括一PCR反应体系，该反应体系中含有特异 性引物对1 jyml/1 jym2，特异性引物 Ijyml :5，-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，特异性引物 ljym2 :5’ -CCACAGCAGGAAAAGCATT-3，。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，所述反应体系中还包括荧光标记SYBR GreenSupermix0
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，所述反应体系的总体积为20yL，其中包括 SYBRGreen Supermix用量10 μ L，浓度为ΙΟμΜ/L特异性引物Ijyml用量lyL，浓度为 10 μ M/L特异性引物1 jym2用量1 μ L，模板为植物组织或土壤中的DNA 1 μ L，以无菌水补 足，终体积为20 μ L。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，所述PCR反应体系还包括标准阳性模板。
全文摘要
本发明涉及辣椒疫霉荧光定量PCR检测法及检测试剂盒。本发明根据辣椒疫霉rDNA的ITS区设计引物对ljym1/ljym2，反应液中含有该对特异性引物及荧光染料，加入辣椒疫霉DNA模板，随着PCR反应的进行，实时检测反应体系的荧光强度，并根据分析软件计算Ct值，从而计算出样品中辣椒疫霉的含量。根据该方法设计的试剂盒操作简便、快速；特异性好，灵敏度高；基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制；定量检测，能真实反映辣椒疫霉侵染植株的情况；可同时进行高通量的样本检测，该试剂盒可对辣椒疫霉进行快速定量检测，可以替代一直沿用的选择性培养基分离培养的传统鉴定方法，并适于在植物病害诊断检测领域广泛推广应用。
文档编号C12Q1/68GK101974651SQ20101057095
公开日2011年2月16日 申请日期2010年12月2日 优先权日2010年12月2日
发明者吴篆芳, 崔瑞, 曹坳程, 李园, 赵海滨, 郭美霞 申请人:中国农业科学院植物保护研究所