专利名称：一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用，具体地说是从肠杆菌9043C12中分离纯 化得到酸性脲酶；将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37°C下自 然干燥脱水成膜，微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，属于酶制剂、酿酒添加剂技术 领域。
背景技术：
酸性脲酶(acid urease)是能将尿素(脲)分解为氨和二氧化碳或碳酸铵的酶。该 酶广泛分布于植物的种子中，但以大豆、刀豆中含量丰富。也存在于动物血液、尿和微生物 体内。能耐受酸性环境，在ΡΗ4.(Γ5.5的体系中仍具有活性。尿素是酒中由微生物代谢过 程中所产生的副产物，是形成氨基甲酸乙酯的前体物质。氨基甲酸乙酯(EC)是发酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪等)和酒精饮料(如葡 萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等)的伴随产物。氨基甲酸乙酯对人的危害主要来自 酒精饮料的饮用。调查显示，氨基甲酸乙酯含量大于30X10_6 Pg/L的酒，人饮用后易患 癌；在麦芽饮料中氨基甲酸乙酯几乎不可测，而果酒白兰地中平均含有10X10_9 73X10_9 Pg/L，黄酒及清酒中约20X 1(Γ9 300Χ10-9 Pg/L，多数威士忌酒中氨基甲酸乙酯的量为 50 X Kr9 200 X Kr9 Pg/L，餐饮葡萄酒中约 7 X 1(Γ9 12 X 1(T9 Pg/L。经研究，氨基甲酸乙酯是由氨甲酰化合物与乙醇自发反应生成的
R-CO-NH2+ C2H5OH^KIH2-C-O-C2Hj+- R-H
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根据酒中尿素来源和尿素与乙醇反应机理控制酒中EC含量可有三个途径①适当的 控制发酵条件，比如温度、PH值等；②选育低尿素的酵母菌；③在发酵后的酒中添加适量的 酒用酸性脲酶，以分解形成的EC前体物质尿素。以上消除EC的三种方法中，尤以第三种方法最为可行。此法不但简易、见效快，且 具有以下明显特点不改变原酒的风味特性；不改变原酿造酒的工艺条件，使生产不受影 响；降低酒中EC的含量可达90%左右；而且在成酒中不会检测到活性酸性脲酶的存在。我国的绍兴黄酒在国际上尤其在日本拥有广阔的市场。1987年，日本有关部门提 出，绍兴黄酒中有EC超标现象，希望厂家采取措施控制EC的含量。目前，酒用脲酶在我国 尚未形成生产能力，酿酒生产中需要的酒用脲酶需花费大
量外汇从国外进口。因此，研究酒用脲酶对我国酿酒业的发展，拓展国际市场等均有深 远的意义。游离酸性脲酶由于活力不易保持、难于重复利用和难于长期贮存等缺点，其应用 受到一定的限制。而固定化酸性脲酶可作为一个良好的反应系统，使自然的酶结合于不溶 性的载体材料上.使酸性脲酶稳定性得到加强，且可重复利用。酶膜将酶的催化功能与膜 的分离功能交叉融合，在降低成本的同时极大地提高了反应效率。此外天然大分子壳聚糖 材料无毒，亲水性好，具有适合酶催化反应的天然微环境，并且价格低廉，来源丰富，可应用于食品行业。故而该固定化酸性脲酶酶膜有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，从肠杆菌9043C12中 分离纯化提取得到酸性脲酶，将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板 中，37°C下自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，该固定化酸性 脲酶的最适温度为40°C，最适pH为4. 5，贮存半衰期为40天，酶活回收率为64. 3% ；本发明 还涉及这种固定化酸性脲酶酶膜的应用，在黄酒中加入该固定化酸性脲酶酶膜后首次尿素 去除率能达到73%，连续使用10次后，尿素去除率仍可达50%。该酸性脲酶酶膜产品以膜 作为固定的载体，接触面积大，可以重复使用，具有其他载体不可比拟的优点；应用于黄酒 中，可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，是目前较为理想的去除酒中尿素的 方法。本发明的技术方案固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，从肠杆菌9043C12中分离纯 化得到酸性脲酶，将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37°C自然 脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，其工艺为
A.酸性脲酶的提取
(1)菌种采用实验室已有肠杆菌(Enterobacter sp. ) 9043C12，该菌株已在《浙江农业 大学学报》22 (5) :493 498，1996公开。(2)种子培养
种子培养基成分g/L 葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5， NaAc 2，尿素5，用去离子水定容至1L，ρΗ7· 0 ； 接种量5%，35°C恒温静置培养18 20h ；
(3)发酵培养
发酵培养基成分g/L:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4 2, NaCl 5, NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0. 05，六水硫酸镍0. 05，用去离子水定容至1L，pH5. 5 ； 接种量5%，35°C恒温静置培养28 32 h ；
(4)收集菌体将发酵液在8000r/min、4°C条件下离心IOmin后，弃上清，
将菌体用去离子水洗涤两次，PH5. 5的柠檬酸缓冲液洗涤一次，离心后所得菌体最终溶 于PH5. 5的柠檬酸缓冲液中，Ig菌泥溶于35mL该柠檬酸缓冲液；
(5)高压破碎850Pa条件下，处理量每次25mL，15min处理IOOmL的
菌泥溶液，回收率达到80%，适合规模化处理；将破碎液于4°C下14500r/min离心 20min,收集上清液，即为所需酸性脲酶酶液；
B、固定化过程
(1)取0.8g壳聚糖溶解于IOOmL质量浓度1%的乙酸中，将4 mL酸性脲酶酶液溶 于其 中，置于磁力搅拌器上，搅勻脱泡后，过滤，以0. 3-0. 5mL滤液/cm2的量倾倒在光滑的玻璃 板上，37°C下脱水干燥成膜，该膜用缓冲液浸泡后剥离。(2)将制好的膜剪成4 cmX4 cm 10 cmX 10 cm大小均勻的方块，浸泡在质量 浓度0. 02%的戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h，去离子水洗涤，去除游离戊二 醛，浙干，所得固定化膜贮存在4 V冰箱内，备用。
制备的固定化酸性脲酶酶膜的应用该固定化酸性脲酶的最适温度为40°C，最适 PH为4. 5，贮存半衰期为40天，酶活回收率为64. 3% ；
在黄酒中加入该固定化酸性脲酶酶膜后，加酶膜的量固定化酶体积/黄酒体积为16 cm2/IOOmL 100 cm2/100mL，在搅拌的条件下，37°C作用24h，首次可去除酒样中73%的尿 素，连续使用多次后，尿素去除率达50%。该固定化酒用酸性脲酶的性质最适温度、最适PH及贮存半衰期的确定 在20-80°C范围内，每隔5°C，分别测定酶活力，以最高酶活力为100%，计 算相对酶活力，最适温度为40°C。 在pH 3. 0-7. 5范围内，每隔0.5 pH梯度，分别测定酶活，以最高酶活力为100%，计 算相对酶活力，最适pH*4.5。将固定化酸性脲酶酶膜放于柠檬酸缓冲液中，4°C冰箱内保存，每隔三天测定固定 化酸性脲酶酶膜的酶活，贮存半衰期为40天。该固定化酒用酸性脲酶的应用
将一定面积的固定化酸性脲酶酶膜置于黄酒中，在搅拌条件下，温度37°C，作用24h 后，测定其尿素浓度，计算尿素去除率，首次使用后黄酒中的尿素去除率为73%，然后将膜取 出用缓冲液洗净，再加入IOOmL的黄酒重复试验，重复10次后尿素去除率仍然可达50%。酶活测定方法
游离酶活测定方法采用靛酚蓝反应(Berthelot reaction)比色法。酶活力定义在常压，37°C，pH5. 5条件下，每分钟分解底物尿素产生1 μ mol氨为 一个酶活力单位。固定化酸性脲酶酶活测定方法取Icm2膜浸入一定体积的柠檬酸缓冲液配制的 PH5. 5的3%尿素溶液中，在37°C恒温水浴箱中保温30min后，过滤取其滤液，余下的方法与 游离酶活力测定相同。尿素含量的测定方法二乙酰一肟法。蛋白含量测定方法考马斯亮蓝G-250法。戊二醛含量的测定紫外分光光度法。本发明的有益效果游离酶的提取方法采用易规模化的方法，固定化酸性脲酶酶 膜的制作过程可以用机器制作代替，实现工业化生产。该固定化酸性脲酶酶膜能在酒中稳 定发挥作用，尿素去除率高，在黄酒中加入固定化酸性脲酶酶膜后尿素去除率能达到73%， 且固定化酸性脲酶酶膜便于回收，可重复利用多次。本发明可以不改变原酿造酒的工艺条 件，不改变酒的风味，在勾兑，澄清酒的过程中，添加固定化酸性脲酶酶膜，就可以降低尿素 含量，是目前较为理想的去除酒中尿素的方法。
图1固定化酸性脲酶酶膜制备工艺示意图。
具体实施例方式实施例1 将4mL酸性脲酶溶于IOOmL的0. 8%的壳聚糖溶液中，用玻璃棒充分搅 拌，搅勻后置于4°C冰箱中冷藏至溶液中无气泡为止，以0. 3mL/cm2的量倒入光滑的玻璃 板上，37°C下干燥成膜，用少量柠檬酸缓冲液浸泡后剥离，浙干，将膜 裁成均勻大小方块后，置于0. 02%戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h (用不透明 容器盖住，以防戊二醛见光变色)，去离子水洗涤，去除游离戊二醛(紫外分光光度法检测)， 浙干，冷藏备用，得固定化酸性脲酶酶膜。取10 cmX 10 cm大小的膜，放入IOOmL的黄酒中， 37°C下作用24h，测定黄酒中尿素含量，计算尿素去除率，尿素含量从24. 8mg/L降至6. 7mg/ L，尿素去除率达到73%。 实施例2 将4mL酸性脲酶溶于IOOmL的0. 8%的壳聚糖溶液中，用玻璃棒充分搅 拌，搅勻后置于4°C冰箱中冷藏至溶液中无气泡为止，以0. 5mL/cm2的量倒入光滑的玻璃板 上，37°C下干燥成膜，用少量柠檬酸缓冲液浸泡后剥离，浙干，将膜裁成均勻大小方块后，置 于0. 02%戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h(用不透明容器盖住，以防戊二醛见 光变色)，去离子水洗涤，去除游离戊二醛(紫外分光光度法检测)，浙干，冷藏备用，得固定 化酸性脲酶酶膜。取4 cmX4 cm大小的膜，放入IOOmL的黄酒中，37°C下作用24h，测定尿 素含量，计算尿素去除率。尿素含量从24. 8mg/L降至9. 6mg/L。取出膜用缓冲液洗净，重新 置于IOOmL的黄酒中，循环测定黄酒中尿素含量，循环10次后，尿素去除率还可达到50%。
权利要求
1.一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，其特征在于从肠杆菌9043C12中分离纯化提 取得到酸性脲酶；将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37°C下自 然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜；其工艺为A.酸性脲酶的提取(1)菌种采用实验室已有肠杆菌(Enterobactersp. ) 9043C12;(2)种子培养种子培养基成分g/L:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2P04 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用去离子水定容至1L，pH7. 0 ；接种量5%，35°C恒温静置培养18 20h ；(3)发酵培养发酵培养基成分g/L葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0. 05，六水硫酸镍0. 05，用去离子水定容至1L， ρΗ5· 5 ；接种量5%，35°C恒温静置培养观 32 h ；(4)收集菌体将发酵液在8000r/min、4°C条件下离心IOmin后，弃上清，将菌体用去离 子水洗涤两次，PH5. 5的柠檬酸缓冲液洗涤一次，离心后所得菌体最终溶于pH5. 5的柠檬酸 缓冲液中，Ig菌泥溶于35mL该柠檬酸缓冲液中；(5)高压破碎8501 条件下，每次处理量25mL，15min处理IOOmL的菌泥溶液；将破碎 液于4°C下14500r/min离心20min，收集上清液，即为所需酸性脲酶酶液；B.固定化过程(1)取0.8g壳聚糖溶于IOOmL质量浓度1%的乙酸中，将4mL酸性脲酶酶液溶于其中， 置于磁力搅拌器上，搅勻脱泡后，双层纱布过滤，以0. 3-0. 5mL滤液/cm2的量倾倒在光滑的 玻璃板上，37°C自然脱水成膜，用柠檬酸缓冲液浸泡后剥离；(2)将制好的膜剪成4cmX4 cm 10 cmXIO cm大小均勻的方块，浸泡在质量浓度 0. 02%的戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h，去离子水洗涤，去除游离戊二醛， 浙干，所得固定化膜贮存在4 V冰箱内，备用。
2.用权利要求1的方法制备的固定化酸性脲酶酶膜的应用其特征是该固定化酸性脲 酶酶膜的最适温度为40°C，最适pH为4. 5，贮存半衰期为40天；在黄酒中加入该固定化酸性脲酶酶膜后，加酶膜的量固定化酸性脲酶酶膜面积/黄 酒体积为16 cmVlOOmL 100 cm2/100mL,在搅拌的条件下，37°C作用Mh，首次可去除酒样 中73%的尿素，连续使用10次后，尿素去除率达50%。
全文摘要
一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。本发明将从肠杆菌9043C12中分离纯化的酸性脲酶，溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得到固定化酸性脲酶酶膜，该固定化酸性脲酶的最适温度为40℃，最适pH为4.5，贮存半衰期为40天，酶活回收率为64.3%；该固定化酸性脲酶酶膜的应用在黄酒中加入该酶膜后尿素去除率能达到73%，连续使用10次后，尿素去除率依旧可达50%。该固定化酸性脲酶酶膜产品以膜作为固定的载体，接触面积大，可以重复使用；应用于黄酒中，可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，是目前较为理想的去除酒中尿素的方法。
文档编号C12G3/08GK102051355SQ201010572018
公开日2011年5月11日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者吕园园, 田亚平 申请人:江南大学