专利名称：一种淡水沉积物总dna的提取方法
技术领域：
本发明属于淡水沉积物DNA样品制备技术领域，具体涉及一种从淡水沉积物中提取DNA的方法。提取的DNA样品可用于PCR反应的模板或用于检测淡水沉积物中微生物的数量或群落结构。同时本发明中涉及到的试剂亦可作为沉积物总DNA提取试剂盒的核心试剂。
背景技术：
由于淡水水体沉积物中的成分复杂，常规提取DNA的方法难以除去腐植酸，而微量的腐殖酸即可抑制taq酶的扩增，以及酶切反应的限制性内切酶活性(Steffen and Alats，1998 ；Porteous and Armstrong, 1991)。目前尚未见到针对淡水沉积物总DNA的提取试剂盒，提取沉积物总DNA通常采用土壤提取试剂盒。但土壤提取试剂盒价格非常昂贵， 且基因组断裂现象明显，对大批量样品的提取不经济。
发明内容
本发明的目的在于克服现有方法存在的缺陷，建立一种操作简单、方便且价格经济的淡水沉积物总DNA的提取方法，该方法可用于制作试剂盒，直接从淡水沉积物中提取纯度极高的总DNA，可做为PCR反应的模板，检测淡水沉积物微生物的数量和群落结构。本发明通过以下技术方案实现本申请人发明了一种从淡水沉积物中提取总DNA的方法。该方法包括以淡水沉积物为材料，采用适当浓度的明矾溶液来去除底泥中的腐殖质，用焦磷酸钠作为分散剂将微生物与沉积物分离开，用CTAB和SDS联合裂解细胞，PEG沉淀，能将底泥中的绝大部分腐殖质去除。用此法得到的DNA在^Onm和^Onm处的吸光值的比值在1. 8左右，260nm和 230nm处的吸光值的比值在2. O左右，接近理想值，不做稀释，不用试剂盒纯化，能直接用于 PCR反应。本发明的技术方案如下所示本发明的主要步骤包括沉积物预处理、细胞裂解、DNA抽提和纯化步骤。具体方法按照以下步骤操作1、一种从淡水沉积物中提取总DNA的方法，其特征在于包括下列步骤1)称取新鲜淡水沉积物0. 3g于2ml的无菌离心管中，加300 μ IpH为6. 6磷酸缓冲液，再往其中加400μ 1溶液Α，在微型涡旋混合仪上涡旋2-;3min，使沉积物与溶液混勻， 再往该离心管中添加40 μ 1沉积物预处理液B，涡旋lmin，于室温在12000g下离心5min，弃上清，得沉积物；2)向步骤1)中的离心管沉积物中添加630 μ 1溶液C和70 μ 1溶液D，10 μ 11 Omg/ ml的蛋白酶K，涡旋5min，得到沉积物悬浮物；3)将步骤2、的沉积物悬浮物在37°C下水浴Ih，再加100 μ 1 20%的SDS，于65 °C 水浴2h，期间每隔10-15min颠倒一次离心管；
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4)将步骤3)的离心管于IOOOOg下离心5min，取上清700 μ 1于一 1.5ml无菌离心管中，加入700 μ 1溶液Ε，充分混勻，于室温IOOOOg下离心5min，取600 μ 1上清于一新的1. 5ml无菌离心管中，再加入500 μ 1溶液Ε，充分混勻，室温IOOOOg离心lOmin，得上清；5)取450 μ 1步骤4)的上清于一新的1. 5ml无菌离心管中，加入45 μ 1溶液F和 250 μ 1溶液G，混勻，于室温下放置lh，然后IOOOOg离心lOmin，弃上清，留沉淀物1 ；6)向步骤5)的沉淀1中加入500 μ 1 80%的乙醇，于12000g下离心lOmin，弃上清，重复该步骤，得沉淀物2;7)将步骤6)沉淀物2在5000g离心ls，用微量移液器将离心管中残留的液体除去，于室温下干燥lOmin，得沉积物总DNA ；8)向步骤7)离心管中添加50 μ 1超纯水，使沉积物总DNA溶解，得到沉积物总 DNA，在紫外分光光度计上检测沉积物DNA的浓度和纯度；9)用步骤 8)得到的 DNA,以 16S rDNA 的特异引物 341F :5，CCTACGGGAGGCAGCAG 3，和534R :5，ATTACCGCGGCTGCTGGCA 3，为引物进行PCR，扩增得到沉积物16S rDNA序列片段，其中步骤1)中的溶液A为200mM的明矾溶液；溶液B为20%浓度的NaOH溶液；步骤2)中的溶液 C 的配方为IOOmM Tris-Hcl ； IOOmM EDTA ； IOmM pH 为 8. O 的磷酸盐，1. 5M NaCl及CTAB溶液；溶液D为IOOmM的焦磷酸钠溶液。步骤4)中的溶液E配方为饱和酚、三氯甲烷和异戊醇，其体积比为25 24 I0
步骤5)中的溶液F为5M的NaCl溶液；溶液G为50%的聚乙二醇6000溶液。本发明的积极效果是本发明提取的沉积物总DNA得率高，重复性强，纯度高，无明显剪切现象，操作简单，价格低，适宜淡水沉积物大批量DNA样品的提取。
图1 用本提取方法提取的湖北省武汉市洪山区南湖渔场(以下简称“南湖”)和淡水养殖池塘沉积物总DNA电泳检测图(图中泳道1为湖北省武汉市洪山区南湖养殖场沉积物总DNA，泳道2为淡水养殖池塘沉积物总DNA)，点样量为2 μ 1。图中两侧的泳道为DNA Marker,其分子量标准从上往下依次为 23130bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp, 2027bp, 564bp (bp :碱基对，lambda DNA/HindIII，购自 Fermentas 公司)。图2 用本发明提取的淡水养殖池塘沉积物总DNA在NaNODROP紫外分光光度计 (型号 NanoDropTM2000，基因有限公司)上的扫描图，A260/A280 = 1. 85, A260A230 = 1. 94 ；DNA 的浓度为253. 4ng/ul (从每克沉积物中可以得到DNA的总量为42. 2ug)。图3 用本发明提取的南湖沉积物总DNA在NaNODROP紫外分光光度计(型号 NanoDropTM2000，基因有限公司)上的扫描图，A26。/A28。= 1. 86, A260A230 = 1. 92 ；DNA 的浓度为80. 4ng/ul (从每克沉积物中可以得到DNA的总量为13. 4ug)。图4 是以本发明提取的两不同沉积物样品DNA为模板做PCR扩增的得到的产物电泳检测图。DNA Marker，其分子量标准从上往下依次为700bp，600bp，500bp，400bp， 300bp, 200bp, IOObp (bp 碱基对，DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司)。
具体实施例方式实施例1 从淡水沉积物中提取总DNA所用淡水沉积物(底泥)来自湖北省公安县崇湖渔场静水淡水养殖池塘和武汉市洪山区南湖渔场，取样后，-80°C保存待用，具体操作步骤如下1)称取0.3g上述的沉积物(底泥)置于2毫升无菌离心管中，加300 μ 1磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的制备称取十二水磷酸氢二钠2. 686g和二水磷酸二氢钠1. 950g，定容至1L)和400ml溶液A (溶液A的制备称取9. 487g十二水硫酸铝钾，溶于无菌双蒸水，定容至100ml)，在微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司，产品型号为WH-2型)上涡旋2-3分钟，充分混勻，再往该离心管中添加40 μ 1沉积物预处理液B (沉积物预处理B液的制备称取4克氢氧化钠，用无菌双蒸水溶解并定容至100ml)，涡旋Imin ；室温20_25°C， 12000g下离心5分钟，弃上清，得到沉积物悬浮物；2)向步骤1)的离心管中添加630μ1溶液C(溶液C的制备称取12.110g Tris-HCl、29. 224gEDTA、3. 581g NaH2PO4,87. 660g NaClUOg CTAB (溴代十六烷基三甲胺)， 溶于900ml双蒸水，调pH到8. 0，定容至1L)和70 μ 1溶液D (溶液D的制备称取4. 461g 十水焦磷酸钠，溶于无菌双蒸水，定容至100ml)，加10 μ 1 10mg/ml的蛋白酶K，涡旋5分钟，得沉积物悬浮物；37°C水浴lh，再加100 μ 1 20%的SDS (十二烷基硫酸钠)(20% SDS 的制备称取20gSDS，加入90ml无菌双蒸水中，使其充分溶解)，于65°C下水浴2h，期间每 10-15min颠倒一次离心管；3)将上步的离心管于IOOOOg下离心5min，取上清700 μ 1于一新的1. 5ml无菌离心管中，加入700 μ 1溶液E(溶液E的制备量取50ml饱和苯酚、48ml三氯甲烷、2ml 异戊醇充分混勻，静止30分钟后使用)，充分混勻，在室温00-25。C )下，IOOOOg离心 5min,取600 μ 1上清于一新的1. 5ml无菌离心管中，再加入500 μ 1溶液Ε，充分混勻，室温 20-250C IOOOOg 离心 IOmin ；4)取450 μ 1上清于另一新的1.5ml无菌离心管中，加入45 μ 1溶液F (溶液F的制备称取29. 220g氯化钠，溶于无菌双蒸水，定容至IOOml)和250 μ 1溶液G (溶液G的配制称取50. OOOg聚乙二醇6000 (PEG6000)，用无菌双蒸水溶解并定容至IOOml)，混勻，室温 (20-250C )放置lh，在12000g下离心lOmin，弃上清，留沉淀物1 ；5)向上步的沉淀1加入500 μ 1 80%的乙醇，于12000g下离心lOmin，弃上清，重
复本步骤，得沉淀物2;6)将步骤5)的沉淀物2在5000g下离心ls，用微量移液器将离心管中残留的液体除去，于室温20-25°C下干燥lOmin，得沉积物总DNA。再向离心管中添加50 μ 1超纯水， 得沉积物总DNA溶液。本实施例的效果如图1所示，提取的沉积物总DNA的分子大小在23Kbp左右，无明显剪切现象。经过电泳检测其条带相当整齐。实施例2 实施例1提取的沉积物总DNA的纯度和浓度检测以超纯水为空白对照，在NaNODROP紫外分光光度计上对实施例1提取的沉积物总 DNA进行纯度和浓度的检测，得到如图2和图3所示的扫描图像。图2中所示A26(i/A28Q = 1. 85，A260ZA230 = 1. 94 ；DNA的浓度为253. 4ng/ul (从每g沉积物中可以得到DNA的总量为42. 2ug)。图 3 中所示 A260A280 = 1. 86，A260A230 = 1. 92 ；DNA 的浓度为 80. 4ng/ul (从每 g 沉积物中可以得到DNA的总量为13. 4ug)。实施例3 实施例1提取的沉积物总DNA应用于PCR检测试验用实施例1提取的沉积物总DNA为模板，以16S rDNA引物正向引物341F 5，CCTACGGGAGGCAGCAG3，和反向引物 534R 5，ATTACCGCGGCTGCTGGCA3，为引物进行 PCR， 扩增出沉积物16S rDNA。PCR反应体系如下(总体积20ul)双蒸水14. 8ul ；DNA =Iul ； 10XPCR buffer (购自宝生物工程大连有限公司代理，或称TaKaRa公司)2ul ；dNTP(购自宝生物工程大连有限公司代理，每种IOmM) 0. 4ul ；16S rDNA引物341F (100uM，由生工生物工程(上海)有限公司合成)0.8ul ；16S rDNA引物534R(100uM，由生工生物工程(上海) 有限公司合成):0. 8ul ；Taq Enzyme (TaKaRa公司，5U/ul) :0. 2ul。PGR程序如下预变性: 950C Imin ；变性:95°C 5s ；退火和延伸:60°C 60s ；最后延伸:72°C 3min，30个循环。扩增的目的DNA片段大小为193bp (参照文献Muyzer G, de Waa EC and UitterlindenAG. 1993)，其电泳结果见附图4所示(图4中泳道1是以湖北省武汉市南湖渔场沉积物DNA为模板扩增的16S rDNA的部分片段，泳道2为以湖北省公安县池塘沉积物 DNA为模板扩增的16S rDNA的部分片段)。主要参考文献1、Steffan R J and Atlas R Μ. DNA amplification to enchance detection of geneticallyengineered bacteria in environmentel samples. Applied EnvrionmentalMicrobiolgy, 1998，54 :2185-2191.2、Porteous L A and Armstrong J L. Recovery of bulk DNA from soil by a rapid, small-scaleextration method. Current Microbiology,1991,22 :345-348.3、Muyzer G, de Waa EC, Uitterlinden AG. Profiling of complex microbial populationby denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chainreaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol, 199359 :695-700.
权利要求
1. 一种从淡水沉积物中提取总DNA的方法，其特征在于包括下列步骤1)称取新鲜淡水沉积物0.3g于2ml的无菌离心管中，加300 μ IpH为6. 6磷酸缓冲液， 再往其中加400μ 1溶液Α，在微型涡旋混合仪上涡旋2-3分钟，使沉积物与溶液混勻，再往该离心管中加40 μ 1沉积物预处理液B，涡旋lmin，于室温在12000g下离心5min，弃上清；2)向步骤1)中的离心管中添加630μ 1溶液C和70 μ 1溶液D，10 μ 1 10mg/ml的蛋白酶K，涡旋5分钟，得到沉积物悬浮物；3)将步骤幻的沉积物悬浮物在37°C下水浴lh，再加100μ 1 20%的十二烷基硫酸钠， 于65°C水浴2h，期间每隔10-15min颠倒一次离心管；4)将步骤3)的离心管于IOOOOg下离心5min，取上清700μ1于一 1. 5ml离心管中，加入700 μ 1溶液Ε，充分混勻，于室温IOOOOg下离心5min，取600 μ 1上清于另一 1. 5ml离心管中，再加入500 μ 1溶液Ε，充分混勻，室温IOOOOg离心lOmin，得上清；5)取450μ 1步骤(4)的上清至1.5ml离心管中，加入45 μ 1溶液F和250 μ 1溶液G， 混勻，于室温下放置lh，然后在IOOOOg下离心lOmin，弃上清，留沉淀物1 ；6)向步骤5)的沉淀物1中加入500μ1 80%的乙醇，于12000g下离心lOmin，弃上清， 重复该步骤，得沉淀物2;7)将步骤6)沉淀2在5000g离心ls，用微量移液器将离心管中残留的液体除去，于室温下干燥lOmin，得沉积物总DNA ；8)向步骤7)的沉积物总DNA中添加50μ 1超纯水，使该沉积物总DNA溶解，在紫外分光光度计上检测该沉积物DNA的浓度和纯度；9)用步骤8)得到的 DNA,以 16S rDNA 的特异引物 341F :5，CCTACGGGAGGCAGCAG 3，和 534R 5' ATTACCGCGGCTGCTGGCA 3，为引物进行PCR，扩增得到沉积物16S rDNA序列片段， 其中步骤1)中的溶液A为200mM的明矾溶液；沉积物预处理液B为20%浓度的NaOH溶液；步骤2)中的溶液C的配方为IOOmM Tris-Hcl ；IOOmM EDTA ； IOmM pH为8. O的磷酸盐，1. 5M NaCl及CTAB溶液；溶液D为IOOmM的焦磷酸钠溶液。步骤幻中的溶液E配方为饱和酚、三氯甲烷和异戊醇，其体积比为25 24 I0步骤6)中的溶液F为5M的NaCl溶液；溶液G为50%的聚乙二醇6000溶液。
全文摘要
本发明属于淡水沉积物DNA样品制备技术领域，具体涉及一种从淡水沉积物中提取DNA的方法。以淡水沉积物为材料，采用适当浓度的明矾溶液来去除底泥中的腐殖质，用焦磷酸钠作为分散剂将微生物与沉积物分离开，用CTAB和SDS联合裂解细胞，PEG沉淀，能将底泥中的绝大部分腐殖质去除。用此法得到的DNA在260和280处的吸光值的比值在1.8左右，260和230处的吸光值的比值在2.0左右，接近理想值，不做稀释，不用试剂盒纯化，能直接用于PCR反应。本发明得到的DNA纯度高，得率稳定，获取的DNA量大，无明显剪切现象，价格低廉，操作简单，可用于商业试剂盒的组装。
文档编号C12N15/10GK102485891SQ20101057301
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者何绪刚, 廖明军, 张敏, 谢从新, 陆诗敏 申请人:华中农业大学