专利名称：结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现暴发流行，且呈增长的趋 势。据WHO报道，全世界有2000万结核病人，每年有800-1000万新增病例，300万人死于结 核病。在我国目前有肺结核病人600多万，每年死于结核病人达25万之多，亦呈增长的趋 势。结核病已成为21世纪严重危及人类健康的疾病之一，快速、可靠的实验技术对于有效 控制结核病显得至关重要，已成为国内外研究的重点。目前，结核病的诊断标准仍然是临床检查结合细菌培养和痰涂片直接镜检，但是 结核分枝杆菌的培养需4-8周，周期太长且有约10%-20%的病例培养失败，涂片虽简单易 行，但阳性率低，传统的结核菌素皮肤试验由于接种卡介苗(BCG)等的影响导致特异性不 好，均难以满足临床需要。近年来，作为直接检测分枝杆菌、种系鉴定和药敏试验的许多分子生物学方法得 到长足发展，这些方法能将诊断时间从几周大大缩短到几天甚至几小时。其中，实时荧光定 量PCR(FQ-PCR)因其技术成熟具有较高的灵敏度和特异性，已逐渐应用于临床。而且，从 定性检测迈上了可以量化的台阶，它的技术更先进，操作更便捷，利用荧光定量PCR技术能 达到实时监测、绝对定量和快速检测的目的，它与核酸分子杂交等技术一起领导着基因诊 断的发展趋势，目前已经广泛应用于临床检验的多项指标中。开发结核分枝杆菌荧光定量 PCR试剂盒，将能定量检测结核分枝杆菌DNA的拷贝数，不但可以为临床提供更准确和更有 价值的诊断信息，还可为临床上的疗效观察、用药剂量、用药时间等提供依据。国家卫生部 已开禁荧光定量PCR检测结核分枝杆菌、HBV等6种病原体。因此实时荧光定量PCR是一 个可以商业化的高技术平台，从技术的角度来看，进行商业化开发比基因芯片、蛋白质芯片 更加成熟。现有的结核分枝杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒产品主要为广州达安、深圳匹基等 公司利用国外Roche公司Taqman探针技术开发，这种技术除了扩增引物以外还需要单独合 成Taqman探针，该探针必须要分别标记荧光基团和淬灭基团，Taqman探针合成以及其进行 的双标记价格昂贵，给病人带来了极大的经济压力。另外现有的试剂盒都还存在一些问题， 会受到非结核分枝杆菌、BCG及结核分枝杆菌变异等的影响，再加上DNA提取方法常采用酸 碱消化法，使得有时由于消化不彻底，影响DNA提取，造成一定的假阳性和假阴性。因此，如 何降低成本，提高试剂盒的诊断灵敏度和特异性，是目前亟待解决的一个重要问题。而自身淬灭探针技术(self-quenched probe)则为我们提供了一种既能降低成本 又不影响检测效果的方法。本研究拟采用结核分枝杆菌16s rRNA作为靶序列，rRNA是与 核糖体蛋白结合的RNA分子，是细菌和真核细胞核糖体基本成分，16s rRNA约1500个核苷 酸组成，内含二个高度可变区，1 267位核苷酸A可变区，430 500位核苷酸B可变 区。其为分枝杆菌属菌种共有，既高度保守又有高度多态性序列，既含属特异性位点，又有种特异性位点，可作为分枝杆菌属及各种分枝杆菌属种鉴定靶基因，这将在特异性方面有 所提高，另外我们将摸索标本的前处理方法使标本消化效果更有利于结核分枝杆菌DNA的 提取。自身淬灭探针技术是2002年研究开发出的一种荧光定量PCR技术，它的主要特点 是在保证高灵敏度和高特异性的前提下，能够极大的降低成本(仅为Taqman探针技术的 50%)，该技术只需要一对扩增引物，引物中的某一条3’端经过荧光标记(该引物即为自身 淬灭探针)，同时自身淬灭探针5’端连接有几个和3’自身配对的碱基，自身淬灭探针是通 过自身构象的变化实现荧光信号的淬灭和荧光信号的产生。PCR开始前引物处于游离状态，自身淬灭探针5’端和3’端自身配对，形成发夹结 构，这种结构的构象可以导致标记的荧光物质发生淬灭，此时荧光信号很弱，当PCR反应开 始后，自身淬灭探针在变性温度下解链，形成单链结构，在退火阶段，自身淬灭探针和模板 杂交，并进行延伸反应，引物(自身淬灭探针)延伸导致其构象发生变化，荧光淬灭效应减 弱，此时可以产生强烈的荧光信号，随着PCR反应进行，有更多的自身淬灭探针构象发生改 变，荧光信号也不断增强。由于该技术只需要合成一对引物(其中一条引物即为自身淬灭 探针)，因此在反应体系的优化上将比较容易，而且它只需要一个荧光基团标记，不需要淬 灭基团，可以极大的节约试剂的成本，更适宜临床采用。国外利用自身淬灭探针技术已成功进行了多重荧光定量，在技术上已比较成熟， 申请者已利用该技术完成了淋病奈瑟氏菌实时荧光定量PCR试剂盒的开发，现正处于专利 申请阶段，技术风险不大。从商业的角度看，在利用荧光定量PCR技术开发的诊断试剂中， 仅有Taqman方法在国内有专利。自身淬灭探针技术才建立不久，国内外尚无利用该项技 术开发诊断试剂的报道，进行产业化开发具有很好的前景。荧光定量PCR技术在目前基因 诊断中占有重要的地位，但Taqman方法昂贵的试剂使病人承受困难，市场急需一种既稳 定、价格又低廉的试剂。自身淬灭探针能够降低试剂成本，其检测效果不亚于其他方法，比 Taqman方法可以节约50%的成本，以100元/人为例，每年检测20万人，可以创产值2000 万，而且由于自身淬灭技术的成本只有Taqman技术的一半，实际节约成本达500万。因此， 这对于广大患者来说是福音。目前结核病的发病率很高，因此，本项目具有广阔的应用前 景，其较低的成本、良好的检测效果将可以满足市场对更好性价比的结核分枝杆菌荧光定 量PCR试剂盒的要求。
发明内容
本发明的目的是利用自身淬灭探针技术建立一种能广泛应用于临床的快捷、敏 感、特异、价格低廉和稳定性较好的新型结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。本发明采 用基因克隆技术，将结核分枝杆菌16s rRNA基因片段插入到载体PET-32a(+)中，获得含有 16s rRNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据结核分枝杆菌16s rRNA的基因片段 编码基因序列设计合成自身淬灭引物，优化PCR条件，建立以自身淬灭引物技术为平台的 实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法，并对所建立的方法进行方法学评价。最后用该 方法对临床收集的疑为结核分枝杆菌感染的患者标本进行检测并和培养方法进行比较。本发明通过以下技术方案予以实现提供一对用于结核分枝杆菌(TB)进行定性 检测的引物，用于标准品的制备。
本发明所提供的引物,其上游引物为5 ’ -ACTCCATGGGATACGGCCCAGACTCCT-3，(含 NcoI 位点)，下游引物为 5，-CGCAAGCTTCATTCCACCGCTACACCAG-3‘(含 HindIII 位点)。由上述引物衍生的引物序列属于本发明保护的范围，适用于结核分枝杆菌常规 PCR的检测，其检测对象是结核分枝杆菌(TB)的16s rRNA基因，提取结核分枝杆菌基因组 DNA，用作16s rRNA基因PCR扩增的模板，在上述引物的引导下进行PCR扩增，扩增产物中 有365bp大小的条带，则样本中含有TB。本发明还提供了用于对结核分枝杆菌进行定量检测的自身淬灭探针，利用探针自 身构象变化来实现荧光信号淬灭。本发明所提供的自身淬灭探针，其上游引物为 5，-cgcgCTCGTAGGTGGTTTGTCGC(FAM)G-3，，下游引物为 5，-CCCGCACGCTCACAGTTAAG-3，，上游 引物3’端最后一个碱基为G，在3’端的第二个碱基为C，在这个C上标记荧光物质FAM，在 探针的5’端引入几个和3’末端互补的碱基(cgcg)以便自身配对形成发夹结构。上述自身淬灭探针序列的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列是指在 上游引物或下游引物的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得 到的序列。本发明的第三个目的是提供一种检测结核分枝杆菌的新型实时荧光定量PCR试剂盒。本发明所提供的检测结核分枝杆菌的新型新型实时荧光定量PCR试剂盒，包括用 于对结核分枝杆菌进行定性、定量检测的的引物和自身淬灭探针。本发明提供用于对结核分枝杆菌进行定性、定量检测的引物和自身淬灭探针，通 过提取待测样品的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中结 核分枝杆菌DNA的目的。本发明所提供的引物及探针可用于临床及科研中对感染结核分 枝杆菌的患者中的结核分枝杆菌DNA进行定性及定量分析，对判断结核分枝杆菌感染的发 生、治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。本发明将在临床医学检测领域发挥重 要作用。下面结合附图以及具体实施方案对本发明作更加详细的阐述。
图1为自身淬灭引物原理示意图。图2为PCR扩增16s rRNA基因片段电泳结果。图3为PCR快速鉴定可疑菌落电泳结果。图4为重组质粒经Nco I和HidIII双酶切电泳结果。图5为重组质粒PCR扩增后电泳结果。图6为重组质粒中16s rRNA基因原始测序结果。图7为荧光定量PCR标准曲线。图8为灵敏度实验的标准曲线。图9为低拷贝样品批内重复性荧光定量PCR扩增曲线。图10为高拷贝样品批内重复性荧光定量PCR扩增曲线。图11为特异性实验扩增曲线。
图12为FQ-PCR检测病人标本的扩增曲线。图13为FQ-PCR检测病人标本的标准曲线，图中的三角点代表标准品(质粒)；圆 点代表临床标本。
具体实施例方式下述实验例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物和所有序列测定工 作均由上海生工合成，所用自身淬灭探针由美国^witrogen公司合成。实例一 16s rRNA基因标准品的制备要建立荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含 高度保守、特异的序列，以保证反应的高特异性。本研究拟采用结核分枝杆菌16s rRNA作为 靶序列，其为分枝杆菌属菌种共有，既高度保守又有高度多态性序列，既含属特异性位点， 又有种特异性位点，可做为分枝杆菌属及各种分枝杆菌属种鉴定靶基因。本部分主要采用 PCR技术扩增结核分枝杆菌16s rRNA基因，将其克隆入质粒载体PET-32a(+)中，构建出重 组质粒PET-32a(+)-16s rRNA，进行相应的酶切鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方 法的标准品，为下一步的方法建立及评价奠定基础。一、模板DNA的制备1.提取结核分枝杆菌(标准菌株)基因组DNA，用作16s rRNA基因PCR扩增的模 板(1)细菌的消化将Iml菌液9000g离心15秒，弃上清。在细菌沉淀中加入40ul Lysozyme 反应液(含 25mg/ml 的 Lysozyme 160ul 和 RNaseA 20ul)。彻底振荡悬浮，37°C 温水浴30 60分钟。(2)加入400ul裂解液(试剂盒自带)和25ul proteinase K，迅速振荡混勻，置 65°C温水浴15 30分钟，期间来回颠倒离心管数次，9000g离心1分钟后，取上清液至另外
一离心管中。(3)加入200ul异丙醇，剧烈颠倒离心管使溶液混勻后，移取600ul至吸附柱中， 9000g离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，将剩余的全部液体 移至吸附柱中，9000g离心30秒，弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。(4)加入500ul洗涤液，静置1分钟后，9000g离心30秒。(5)将吸附柱移入另外一干净收集管中，加入500ul洗涤液，9000g离心15秒。(6)弃去收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，9000g离心1分钟。(7)将吸附柱移入一个干净的1. 5ml离心管中，在吸附膜中央加入IOOul洗脱液， 65°C静置5分钟，9000g离心1分钟，将提取得到的DNA置_20°C保存。二、16s rRNA基因片段的PCR扩增1.引物的设计与合成根据Pub-Med上基因库中报道的结核分枝杆菌基因组DNA序列中的16s rRNA的 基因序列，由上海生物工程有限公司设计合成PCR引物，扩增片段预期大小为36^p，引物 序列如下上游5，-ACTCCATGGGATACGGCCCAGACTCCT-3’(含 NcoI 位点)下游5，-CGCAAGCTTCATTCCACCGCTACACCAG-3‘(含HindIII 位点)
2. PCR反应体系和反应条件(1)反应体系PCR反应体系
权利要求
1. 一种结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法，其特征在于提供用于对结核分枝 杆菌进行定性、定量检测的引物和自身淬灭探针，所述引物的上游引物为5’ -ACTCCAT GGGATACGGCCCAGACTCCT-3’,下游引物为 5， -CGCAAGCTTCATTCCACCGCTACACCAG-3’,所 述自身淬灭探针的上游引物为5 ’ -cgcgCTCGTAGGTGGTTTGTCGC (FAM) G-3 ’，下游引物为 5’ -CCCGCACGCTCACAGTTAAG-3’，上游引物3’端最后一个碱基为G，在3’端的第二个碱基为 C，在这个C上标记荧光物质FAM，在探针的5’端引入几个和3’末端互补的碱基(cgcg)以 便自身配对形成发夹结构。
全文摘要
本发明提供结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法，设计对结核分枝杆菌进行定性、定量检测的引物、自身淬灭探针，引物的上游引物为5’-ACTCCATGGGATACGGCCCAGACTCCT-3’，下游引物为5’-CGCAAGCTTCATTCCACCGCTACACCAG-3’，自身淬灭探针的上游引物为5’-cgcgCTCGTAGGTGGTTTGTCGC(FAM)G-3’，下游引物为5’-CCCGCACGCTCACAGTTAAG-3’，上游引物3’端最后一个碱基为G，在3’端的第二个碱基为C，在这个C上标记荧光物质FAM，在探针的5’端引入几个和3’末端互补的碱基(cgcg)以便自身配对形成发夹结构。通过提取待测样品的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中结核分枝杆菌DNA的目的。
文档编号C12Q1/68GK102108398SQ20101057303
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者张伟铮, 曾建明, 李有强, 李沫, 王丽娜, 鄂顺梅, 陈茶, 黄彬 申请人:广东省中医院