专利名称：一种人工诱导臭马比木内生菌合成喜树碱的技术方法
技术领域：
本发明涉及一种合成喜树碱的技术方法，尤其是一种人工诱导臭马比木内生菌合 成喜树碱的技术方法，属于生物技术领域。
背景技术：
喜树碱(Camptothecin，CPT)是从中国特有的珙桐科植物喜树中分离得到的一种 天然五环生物碱。喜树碱是由Wall等于1966年首次从喜树皮中提取出来，随后人们的研 究又逐步分离出10-羟基喜树碱、甲氧基喜树碱、10-甲氧基喜树碱等喜树碱类似物。喜树 碱通过嵌合抑制DNA拓扑异构酶I (Topo I)攻击肿瘤细胞，最终导致肿瘤细胞死亡，是理 想的抗癌药物。喜树碱系列衍生物抗癌药物是附加值极高的高技术产品，对胰腺癌、前列腺 癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、子宫颈癌、胃癌和血液肿瘤等均有效，加之可以口服，且对 心、肺、肝、肾和神经毒性较小，已成为世界抗肿瘤药物市场上主要品种。喜树碱的原料来源主要有两种，一是喜树，二是马比木。从目前的研究情况和国内 外的研究趋势来看，喜树碱及类似物主要是靠从喜树中分离获得，至今已从喜树中分离出 来的30余种成分中，喜树碱及其类似物已有10余种。喜树碱及类似物的提取与分离主要是 利用这些物质不溶于水而溶于乙醇、氯仿等有机剂等方面的特性，通过渗漉使其溶于这些 溶剂中，此后回收溶剂、结晶即可得到最终产品。但由于喜树的生长周期较长，通常要8-15 年才能结果，喜树果中喜树碱的最高含量也只万分之七左右。此外，由于喜树主要分布在人 为活动区，面临以毁林开田为目的的砍伐，优良的野生喜树资源较少，其相关的药用研究和 开发也受到一定限制。马比木为茶茱萸科植物海桐假柴龙树(Nothapodytes Pittosporoides (Oliv.) sleum.)的根皮，其含有喜树碱(camptothecine)及喜树碱的甲氧基衍生物，马比木根茎中 所含喜树碱的含量最高可达万分之十四，是喜树碱的另一个原料主要来源。臭马比木，名 称青脆枝，学名为Nothapodytes ηimmoniana (Graham) MabIerley，原产地为兰屿，也属于 茶茱萸科，分布我国于甘肃、湖北、湖南、广东、海南、广西、四川、贵州等地，臭马比木全株含 有喜树碱。据植物提取产业信息网了解，马比木来源的99%喜树碱价格要比喜树来源的低 一万元左右，价格上的优势使马比木成为了喜树碱提取的另一个关注热点。目前，喜树碱的获得途径要有由植物中提取、生物合成、化学全合成。由植物中 提取喜树碱的方法，主要是利用喜树碱不溶于水而溶于乙醇、氯仿等有机溶剂的特性，通过 渗滤使其溶解于溶剂中，然后再回收溶剂、结晶得到喜树碱产品。由于利用了有机溶剂，此 方法产生的环境污染较大，且提取步骤繁琐、成本较高。喜树碱的生物合成途径来自单帖吲 哚生物碱途径，吲哚生物碱的生物合成则来源于莽草酸途径和甲羟戊酸途径。生物技术为 传统中药研究提供了新的技术手段，但由于我国在这一方面研究的深度仍不够，喜树碱是 生物合成途径中，酶的调节规律和酶基因的调控和相互作用仍是亟待解决的问题。喜树碱 的化学全合成方法基于喜树碱的五环结构，通过不同的建环方法进行合成，例如拆分法、不 对称氧化法等。多数的化学全合成方法存在路线过长，总产率过低等不足，要得到产业化应用仍存有很大的改进余地。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组 织和器官内部或细胞间隙的真菌或细菌。植物内生菌可通过自身的代谢产物或借助于信号 传导作用对植物体产生影响，如内生菌对植物的固氮作用、促进植物生产的作用和增强宿 主植物抗逆境、抗病虫害等作用。由于内生菌分布在宿主植物组织内部，比暴露于外部环境 的附生菌和腐生菌具有更加稳定的生存环境，更易于发挥作用，且植物内生菌具有一定的 宿主专一性，因此具有优良的开发特性。随着人们对喜树碱类抗癌药物需求的增加，单纯靠从喜树中提取喜树碱已经无法 满足人们的需求，同时也会造成资源的浪费和环境的破坏。利用植物组织培养的方法是一 种有效的手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工诱导臭马比木内生菌合成喜树碱的技术方法，该方 法通过将臭马比木未成熟的细胞置于添加了一定浓度的生长调节剂的培养基培养，在细胞 指数生长初期，加入诱导剂和糖，然后在细胞指数生长中期，再加入诱导剂，采用人工的方 式，诱导臭马比木内生菌合成喜树碱。本发明所采用的技术方案是将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为5(T200g/L 湿重的比例，置于添加了 5(Γ80 μ mol/L浓度的萘乙酸(NAA)或5-10 μ mol/L浓度的苄氨基 嘌呤(BA)的培养基中，在25-30°C中培养；在细胞指数生长初期，加入浓度为1-2000 μ mol/ L的诱导剂和20-50g/L的糖；在细胞指数生长中期，再加入浓度为1-2000 μ mol/L的非生 物诱导剂。本发明相对于现有技术的优点在于
(1)利用富含喜树碱的植物臭马比木，通过人工诱导，组织培养的方法实现喜树碱的合 成，利用了内生菌易培养、易控制和生长快等特点，可以获得生理活性与植物来源一致的喜 树碱；
(2)本发明的培养条件可以使细胞快速、良好地生长，并具有均一性；
(3)本发明的方法可提高喜树碱的产量；
(4)随着人们对喜树碱类抗癌药物需求的增加，单纯靠从喜树中提取喜树碱已经无法 满足人们的需求，同时也会造成资源的浪费和环境的破坏。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并 不限制本发明的范围。实施例1
(1)培养基制备MS基本培养基中添加50μ mol/L浓度的萘乙酸(NAA)生长调节剂；
(2)接种培养将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为100g/L湿重的比例，置于25°C 摇床，转速80rpm，暗培养；
(3)联合诱导培养过程中利用诱导剂培养，在接种培养基后5天，加入浓度为 300 μ mol/L的诱导剂，并补糖30g/L ；接种培养基后10天，再加入浓度为500 μ mol/L的非生物诱导剂；
(4)提取由获得的培养物分离，提取细胞部分和吸附部分的喜树碱。获得的生产率最 为 68. 58mg/(L · d)，最高产量为 1289. 24mg/L0实施例2
(1)培养基制备MS基本培养基中添加65ymol/L浓度的萘乙酸(NAA)生长调节剂；
(2)接种培养将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为100g/L湿重的比例，置于25°C 摇床，转速lOOrpm，暗培养；
(3)联合诱导培养过程中利用诱导剂培养，在接种培养基后7天，加入浓度为 600 μ mol/L的诱导剂，并补糖30g/L ；接种培养基后10天，再加入浓度为1000 μ mol/L的非 生物诱导剂；
(4)提取由获得的培养物分离，提取细胞部分和吸附部分的喜树碱。获得的生产率最 为 72. 95mg/(L · d)，最高产量为 1301. 59mg/L。实施例3
(1)培养基制备MS基本培养基中添加80μ mol/L浓度的萘乙酸(NAA)生长调节剂；
(2)接种培养将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为150g/L湿重的比例，置于25°C 摇床，转速lOOrpm，暗培养；
(3)联合诱导培养过程中利用诱导剂培养，在接种培养基后7天，加入浓度为 600 μ mol/L的诱导剂，并补糖40g/L ；接种培养基后15天，再加入浓度为1200 μ mol/L的非 生物诱导剂；
(4)提取由获得的培养物分离，提取细胞部分和吸附部分的喜树碱。获得的生产率最 为 76. 02mg/ (L · d)，最高产量为 1272. 06mg/L。实施例4
(1)培养基制备MS基本培养基中添加5μ mol/L浓度的苄氨基嘌呤(BA)；
(2)接种培养将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为100g/L湿重的比例，置于25°C 摇床，转速80rpm，暗培养；
(3)联合诱导培养过程中利用诱导剂培养，在接种培养基后5天，加入浓度为 300 μ mol/L的诱导剂，并补糖30g/L ；接种培养基后10天，再加入浓度为500 μ mol/L的非 生物诱导剂；
(4)提取由获得的培养物分离，提取细胞部分和吸附部分的喜树碱。获得的生产率最 高可达59. 4lmg/ (L · d)，最高产量可达到945. 58mg/L。
权利要求
1.一种人工诱导臭马比木内生菌合成喜树碱的技术方法，其特征在于由以下步 骤组成将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为5(T200g/L湿重的比例，置于添加了 一定浓度的生长调节剂的培养基中，在25 30°C中培养；在细胞指数生长初期，加入浓 度为HOOOymol/L的诱导剂和2(T50g/L的糖；在细胞指数生长中期，再加入浓度为 1 2000ymol/L的诱导剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的生长调节剂为萘乙酸(NAA)或苄氨 基嘌呤(BA)。
3.根据权利要求2所述的生长调节剂，其特征在于生长调节剂萘乙酸(NAA)或苄氨基 嘌呤(BA)的浓度分别为50 80 μ mol/L和5 10 μ mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养基为MS基本培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的诱导剂为硝酸银和水杨酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖为蔗糖或葡萄糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的细胞指数生长初期为接种培养基后 的5 10天；所述细胞指数生长中期为接种培养基后的1(Γ20天。
全文摘要
本发明涉及一种人工诱导臭马比木内生菌合成喜树碱的技术方法。本发明的方法由以下步骤组成将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为50~200g/L湿重的比例，置于添加了50~80μmol/L的生长调节剂萘乙酸(NAA)或5~10μmol/L苄氨基嘌呤(BA)的MS基本培养基中，在25~30℃中培养；在细胞指数生长初期，加入浓度为1~2000μmol/L的非生物诱导剂和20~50g/L的蔗糖或葡萄糖；在细胞指数生长中期，再加入浓度为1~2000μmol/L的非生物诱导剂。本发明利用了富含喜树碱的植物臭马比木，通过人工诱导，组织培养的方法实现喜树碱的合成，在一定程度上可提高喜树碱的产量，本发明的培养条件可以使细胞快速、良好地生长，并具有均一性。
文档编号C12P17/18GK102071233SQ201010574700
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者张苑金 申请人:张苑金