专利名称：鉴定奶牛早期胚胎性别的多重pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定奶牛早期胚胎性别的多重PCR方法，属于动物繁殖技术领 域。
背景技术：
奶牛是单胎动物，由于妊娠期长、繁殖率低和性别限制等因素的影响，其年增长率 只有20%左右。因此性别控制技术与繁殖新技术的结合对奶牛业发展具有十分重要的意 义。19世纪70年代中期胚胎移植技术广泛应用以来，奶牛胚胎性别的早期鉴定成为研究的 热点，很多方法被用于奶牛的胚胎性别鉴定中。而PCR技术因其高效、快速的特点得到快速 的发展。目前，多种基于PCR技术的家畜早期胚胎性别鉴定方法已经建立，主要有巢式PCR 法，单重PCR法，两步PCR法，LAMP法，多重PCR法等。巢式PCR法所需时间长；两步PCR法， 增加了鉴定所用的时间及污染的机会；单重PCR法只对Y-染色体特异片段进行扩增，没有 内部标记，假阴性几率高；LAMP法虽然具有简单、快速、特异性高、准确的特点，但是由于其 成本较高使其推广应用受到了限制。因此，准确、快速、实用的PCR性别鉴定技术仍是当前 生产实践中的迫切需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴定奶牛早期胚胎性别的多重PCR方法， 通过改善传统的PCR反应体系，在PCR反应体系中引入牛Y染色体特异性引物和牛常染色 体共有序列引物的组合，优化反应体系组份配比和反应条件，建立一种快速、简便、准确和 实用的奶牛早期胚胎性别鉴定技术。本发明所采用的技术方案如下
一种鉴定奶牛早期胚胎性别的多重PCR方法，其特征在于其是将以下2对不同的引物 引入下述PCR反应体系中在下述反应条件下一次性扩增出不同的目标产物 牛Y染色体特异性引物序列
正向引物5，一CTGTCATTCTACTCTACTGTTTTCCCC—3，； 反向引物5，一GATGTTATTATCTCTTTTCAGGTTTT—3，； 内标引物序列
正向引物5’ 一TCGTCAGAAACCGCACACTG— 3，； 反向引物5’ 一TGGAAGCAAAGAACCCCGCT— 3，；
所述PCR反应体系为总体积20 μ L，其中Mg2+浓度为1. 5mmol/L, dNTP浓度为 200ymol/L, Y-染色体特异引物浓度为150pmol/L，内标引物浓度为50pmol/L，模板量为 Γ10个胚胎细胞DNA, Taq酶1. 4U ；
所述反应条件为95°C预变性5分钟；然后进行循环条件95°C变性30秒，55°C退火30 秒，72 °C延伸30秒，35个循环；最后72°C延伸5分钟。所述Y染色体特异性引物序列的扩增产物为344bp，所述内标引物序列的扩增产物为216bp。本发明的有益效果是本发明中引入了牛常染色体共有片段引物作为内标引物， 避免了单重PCR法单一扩增Y染色体特异引物可能因反应失败而造成的假阴性，进而造成 误判的现象，提高了鉴定结果的准确性。利用本发明的方法，只需一次PCR反应即可完成奶 牛早期胚胎的性别鉴定，操作简便快速，检测结果准确可靠。
图1为常量牛血液基因组DNA扩增产物的电泳图2为微量牛血液基因组DNA不同浓度梯度样品和已知性别奶牛胚胎DNA样品扩增产 物的电泳图3为奶牛体内胚胎DNA样品扩增产物的电泳图。
具体实施例方式实施例1牛血液DNA的性别鉴定 1、血液模板DNA制备
取公、母牛各两头的血液样品，ACD抗凝，采用常规的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA， TE溶解。用0. 7%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，紫外分光光度计测定其纯度和浓度。将 DNA 样品分别稀释至 20ng/ μ L、50pg/ μ L、20pg/ μ L 和 IOpg/ μ L，用于 PCR 检测，或-20°C
保存备用。2、多重PCR反应
按以上方法制备的牛血液基因组DNA各浓度样品分别取1 μ L，作为反应模板进行PCR 扩增。PCR反应体系为总体积20 μ L，其中Mg2+浓度为1. 5mmol/L, dNTP浓度为 200ymol/L, Y-染色体特异引物浓度为150pmol/L，内标引物浓度为50pmol/L，Taq酶 1. 4U，模板DNA分别为上述牛血液基因组DNA各浓度样品。PCR反应条件为95°C预变性5分钟；然后进行循环条件95°C变性30秒，55°C退 火30秒，72 °C延伸30秒，30个循环；最后72°C延伸5分钟。3、多重PCR产物的检测
取5 μ L扩增产物，加1 μ L 6 X Loading Buffer，进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色， 凝胶成像系统检测，结果如图1和图2所示。其中，图1为血液基因组DNA模板为20ng的 扩增产物检测结果，M为分子量标记，泳道1和2是模板为雄性血液样品的扩增产物，泳道3 和4是模板为雌性血液样品的扩增产物，泳道5为空白对照。由图1可见，泳道1和2中同 时出现344bp和216bp的两条带，鉴定为雄性，泳道3和4中只出现216bp的一条带，鉴定 为雌性，检测结果与血液样品来源牛只性别一致。图2中M为分子量标记，泳道1为空白对 照，泳道2 5是模板为雄性血液样品的扩增产物，泳道6 8是模板为雌性血液样品的扩 增产物。泳道2和6为模板为10 pg/ μ L的DNA的扩增产物，泳道3和7为模板为20 pg/ μ L的DNA的扩增产物，泳道4和8为模板为50 pg/ μ L的DNA的扩增产物。检测结果与血 液样品来源牛只性别一致。实施例2已知性别冷冻胚胎的性别鉴定 1、胚胎模板DNA制备将已知性别的冷冻胚胎解冻后，用倒置显微镜和分割刀切取中、晚期囊胚内细胞团对 面的滋养层细胞5 10个，置于灭菌的PCR管中，瞬时离心后备用。2、多重PCR反应
取按以上方法制备的胚胎DNA样品作为模板，利用实施例1建立的多重PCR反应体系 和反应条件对已知性别胚胎模板DNA样品进行扩增。 3、胚胎性别鉴定
取5 μ L扩增产物，加1 μ L 6 X Loading Buffer，进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色， 凝胶成像系统检测，结果见图2。其中，M为分子量标记，泳道1为空白对照，泳道5为雄性 胚胎样品扩增结果，泳道9为雌性胚胎样品扩增结果。检测结果与胚胎的已知性别一致。实施例3奶牛体内胚胎的性别鉴定 1、胚胎模板DNA制备
供体奶牛超数排卵处理后，检出可用胚胎6枚，分别在倒置显微镜下用电动胚胎分割 仪取2 10个细胞，吸取至灭菌的PCR管内(管内预先加入8 μ L灭菌超纯水)，瞬时离心后2、多重PCR反应
取按以上方法制备的胚胎DNA样品5 μ L，作为模板DNA，利用实施例1建立的多重PCR 反应体系和反应条件对胚胎DNA样品进行扩增。3、胚胎性别鉴定
取5 μ L扩增产物，加1 μ L 6 X Loading Buffer，进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色， 凝胶成像系统检测，结果见图3。其中，M为分子量标记，泳道1 一 6为胚胎样品扩增结果。 鉴定结果表明泳道1、2和6为雌性胚胎，泳道3、4和5为雄性胚胎。对鉴定后的胚胎进行移植，产犊后对照验证表明，产犊结果与PCR鉴定结果一致。
权利要求
1.一种鉴定奶牛早期胚胎性别的多重PCR方法，其特征在于其是将以下2对不同的引 物引入下述PCR反应体系中，在下述反应条件下一次性扩增出不同的目标产物牛Y染色体特异性引物序列正向引物5，一CTGTCATTCTACTCTACTGTTTTCCCC—3，； 反向引物5，一GATGTTATTATCTCTTTTCAGGTTTT—3，； 内标引物序列正向引物5’ 一TCGTCAGAAACCGCACACTG— 3，； 反向引物5’ 一TGGAAGCAAAGAACCCCGCT— 3，；所述PCR反应体系为总体积20 μ L，其中Mg2+浓度为1. 5mmol/L, dNTP浓度为 200 μ mol/L，Y-染色体特异性引物浓度为150pmol/ L，内标引物浓度为50pmol/ L，模板量 为Γ10个胚胎细胞DNA, Taq酶1. 4U ；所述反应条件为95°C预变性5分钟；然后进行循环条件95°C变性30秒，55°C退火30 秒，72 °C延伸30秒，35个循环；最后72°C延伸5分钟。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定奶牛早期胚胎性别的多重PCR方法，其特征在于所 述Y染色体特异性引物序列的扩增产物为344bp，所述内标引物序列的扩增产物为216bp。
全文摘要
本发明提供了一种鉴别奶牛早期胚胎性别的多重PCR方法，即在PCR反应体系中引入牛Y染色体特异性引物和牛常染色体共有序列引物的组合，并优化反应体系组份配比和反应条件，建立一种快速、简便、准确和实用的奶牛早期胚胎性别鉴定技术。利用本发明的方法，只需一次PCR反应即可完成牛早期胚胎的性别鉴定，且操作简便快速，检测结果准确可靠。
文档编号C12Q1/68GK102061339SQ201010580929
公开日2011年5月18日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者吴占军, 张峰, 张新同, 李魁英, 王学清, 王昆, 王栋 申请人:河北省农林科学院粮油作物研究所