专利名称：一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片，特别涉及一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片及应用。
背景技术：
抑郁症(Major depression disorder, MDD)是一种情感障碍性精神疾病，主要表 现持续的情感低落、思维迟缓和意志减退，常伴有认知障碍、行为紊乱及躯体症状。其终生 患病率为10% 20%，自杀率高达10% 25%。抑郁症引起的精神残疾给患者、家庭和社会 带来了精神上和经济上沉重的负担，自伤自杀等行为更是危害巨大，且许多患者为反复发 作病程，因此有效、规范、全程抗抑郁治疗的重要性不言而喻。目前，以选择性5-HT和5-HT/NE再摄取抑制剂(SSRIs/SNRIs)为代表的各种新型 抗抑郁药物以其临床总体的安全性和耐受性较好而得到广泛应用。但是抗抑郁治疗的个体 差异非常显著，部分患者出现严重不良反应，30 50%患者治疗无显效，20%成为难治性 抑郁；而且，应用抗抑郁药物治疗后即刻导致突触间隙5-HT/NE水平增高，给药1周后脑内 药物浓度稳定维持在有效水平，但是临床起效通常需2 3周，充分显效更需4 6周以 上，还有部分患者因不良反应而提早停止药物治疗，造成早期复发率增加，病程期间自杀风 险显著增加。抗抑郁药物临床疗效差异显著和延迟起效造成的疗效早期预测困难是临床存 在的极为普遍而突出的问题，亟待解决！
本发明提供一种生物芯片，可以根据患者遗传基因的特征(单核苷酸多态性)，，从选用 药物的种类、接受治疗患者的性别、药物发挥疗效的推定时间点，以及可能产生的不良反应 等方面，早期预测抗抑郁剂对于患者的治疗效应，从而指导临床医生制定和实施个体化的 治疗方案。
发明内容
本发明的目的在于本发明提供一种生物芯片，可以根据患者的遗传基因的特征 (单核苷酸多态性)，从选用药物的种类、接受治疗患者的性别、药物发挥疗效的推定时间 点，以及可能产生的不良反应等方面，早期预测抗抑郁剂对于患者的治疗效应，从而指导临 床医生制定和实施个体化的治疗方案。一种用于预测抗抑郁药物影响的生物芯片，由载体与生物探针构成，其特征在于 所述的生物探针含有序列为NO :1-20任意一种或多种，所述的序列末端经荧光标记修 饰。具体来说根据前期科研成果获得的与抗抑郁剂疗效相关的易感基因单核苷酸多态性位 点(SNP)，采用I^rimer Primer 5.0软件，针对每一个SNP位点分别设计并合成一对上下游 引物和一对寡核苷酸序列标签探针(野生型标签探针和突变型标签探针)，且一对寡核苷酸 序列标签探针的序列末端经荧光标记修饰。一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片的制备方法为，包括原位合成或预合 成后点样。
有益效果
本发明可以通过生物芯片技术可以根据患者的遗传基因的特征(单核苷酸多态性)，从 选用药物的种类、接受治疗患者的性别、药物发挥疗效的推定时间点，以及可能产生的不良 反应等方面，早期预测抗抑郁剂对于患者的治疗效应，从而指导临床医生制定和实施个体 化的治疗方案。同时，本发明涉及生物芯片基因分型技术是一种特异性强、高通量的基因分 型技术，适用于临床快速基因分型，在临床方面具有很大应用前景。
具体实施例方式实施例1
一、临床患者的入组和评估 1.入组标准
入组符合DSM-IV单相抑郁症的诊断标准、汉密尔顿抑郁量表(HAMD-17)评分> 18分、 18 60岁、男女首发或复发的中国汉族抑郁症患者，均签写知情同意书，经伦理委员会同
辰、ο2.排除标准
严格排除有精神分裂症、酒精和药物依赖病史；有脑器质性疾病和内分泌疾病史；经 检查血象、心、肝、肾功能异常者；妊娠期和哺乳妇女；有躁狂或轻躁狂发作史；抑郁发作过 程中伴有精神病性症状者；电休克治疗者。3.临床评估 3. 1.抑郁症状
采用HAMD (17项版本)量表评定抑郁症状严重程度。3. 2.药物治疗和评价
3. 2. 1.共入组首发或反复发作患者400例，随机分入SSRI治疗组和SNRI治疗组各200 例，治疗前和治疗后每两周(第2、4、6、8、10、12周)均采用HAMD量表(17项版本)评定治疗效应。3. 2. 2.治疗效应评定标准
第6周时HAMD-17减分率》50%，为药物治疗有效 < 50%，为药物治疗无效
第8周时HAMD-17得分< 7分，为病情缓解(痊愈) > 7分，为病情未缓解(未愈)
3. 2. 3.随访结束后的半年到一年期间，对所有入组患者进行门诊或电话回访，此间出 现转躁、转精神分裂症、转其他精神疾病的患者，均不纳入本研究。4.血液标本采集和基因组DNA提取
患者入院后第2天晨6 8点，取肘静脉血5ml，以2g/L EDTA抗凝。采用基因组DNA 提取试剂盒(TIANGEN-DP318-03，北京天根公司)提取患者血液基因组DNA，采用紫外分光光 度计(T6，北京普析通用仪器有限公司)测定浓度和纯度，于-20°C储存。二.药物基因组学研究 1.遗传标记筛选1.1.功能SNP (fSNP):主要通过物种间保守序列的比对，筛选原则包括a.改变氨基 酸理化性质的SNPs ；b.改变内含子剪切位点的SNPs ；c.启动子或增强子区域可能会影响 表达的SNPs。采用dbSNP数据库结合Hapmap Project,筛选fSNPs.
1. 2.标签SNP (tSNP)染色体上某一个SNP往往倾向于与其附近的若干个SNPs组合 在一起共同遗传，这样形成的组合称为单倍域。单倍域内SNP的变化较少，基因的遗传多态 性主要表现为单倍域之间的重组改变。因此tSNP的遗传特征可以代表其所属的整个单倍 域(其中包含了除tSNP外的多个SNPs)的遗传特征，具有简化并且优化遗传关联分析的优 势。采用Haploview 4. O软件筛选tSNPs。2.候选基因位点分型采用Illumina Golden Gate定制芯片进行分型检测。3.药物疗效相关易感基因确定应用统计学软件及建立数学模型进行SNPs与疗 效的关联分析、单倍型分析以及基因-基因交互模型分析，以此来确定精神药物疗效相关 的易感基因。4. 1.统计分析
4. 1. 1.运用t检验和卡方检验分析比较(有效/无效，缓解/未缓解)两组的性别、年 龄、病程、发病次数、有无家族史等一般资料，采用SPSS13.0软件。两组间上述一般资料的 差异无统计学意义。4. 1.2.计算每个SNP位点的基因型检出率(call rate)、最小等位基因频率 (MAF)、哈迪温伯格频率(HWE)，采用Haploview 4. 0软件。筛选保留同时符合以下条件的 SNP 位点基因型数据call rate 彡 95%、MAF 彡 5%、HWE 彡 0. 001%。4.1.3.运用Multinomial Logistic model EM方法进行SNP基因型频率、等位基 因频率与疗效的关联分析，采用Unphased 3. 0. 13软件。4. 1. 4.单倍型分析，采用 Unphased 3. 0. 13 软件。4. 2.分析筛选出与抗抑郁药物疗效相关的易感基因和多态性位点。三、探针的制备方法
一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片，由载体与生物探针构成，其特征在于所 述的生物探针含有序列为NO :1-20任意一种或多种，所述的序列末端经荧光标签修 饰。根据前期科研成果获得的与抗抑郁剂疗效相关的易感基因单核苷酸多态性位点(SNP)， 采用I^rimer Primer 5.0软件，针对每一个SNP位点分别设计并合成一对上下游引物和一 对寡核苷酸序列标签探针(野生型标签探针和突变型标签探针)，且一对寡核苷酸序列标签 探针的序列末端经荧光标记修饰。四、生物芯片的制备方法
将丙烯酰胺修饰的PCR产物核酸片段、丙烯酰胺单体、过硫酸铵、丙三醇和水混合成 预聚合物，其中，PCR产物核酸片段的浓度在0. OOl-lOOuM之间，丙烯酰胺单体重量浓度在 1-30%之间，过硫酸铵重量浓度在0.01-5%之间，丙三醇的重量浓度为10-50%。充分振荡 后离心静置，移入96孔板，用微阵列点样仪点样至经丙烯酰基硅烷修饰的固体基片(玻片) 的反应槽内。点样完后将点样基片置于一放置有四甲基乙二胺(TEMED)的密闭盒中，使四 甲基乙二胺挥发，挥发的四甲基乙二胺与固体基板上预聚合物阵点接触并使其发生聚合反 应，使各阵点上的核酸通过共聚反应在固体基板上固定。保存于4°C备用。五、生物芯片杂交反应和信号检测配制杂交反应液，每一种杂交反应液只包含单个SNP位点的成对Cy3/cy5双色荧光标 记的探针各2mmol/L (MicroHybTM杂交液成分购自iTeleChem公司)。固定好的三维凝胶核酸芯片置于0. lmmol/L NaOH溶液中5V/cm电泳lOmin，变性 处理为单链DNA阵列。每一个反应槽内只加入一种含单个SNP成对荧光标记探针的杂交反应液IOul。然 后其上覆盖疏水化盖玻片，使杂交液在反应槽内充分展开，同时反应槽之间彼此隔离。杂 交反应在37°C持续2h，反应槽保持潮湿密闭状态。完成杂交的芯片置于含有MgC12的IXTBE中5V/cm电泳8min，清除非特异吸附 探针。氮气吹干芯片后，设置扫描仪Lux Scan IOK (北京博奥生物芯片公司)的激光功率 (Power) 70%,光电倍增管效率(PMT Gain) 70 %,对微阵列进行扫描，分别得到Cy3扫描图 与Cy5扫描图，可得到绿、黄、红三种颜色的图像，分别对应于野生纯合子、杂合子和突变 纯合子，通过颜色的区分可很容易地对SNP进行分型。进一步使用Quant Array软件分析 每一样本点的荧光强度，得到样本在两种激光源扫描下的荧光强度及背景强度，据此求得 样品的基因型，修正肉眼直接观察的结果。其中患者的基因组DNA扩增产物制备方法为多重PCR扩增。反应体系为50ul，其 中含 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 3)，50mmol/L KCl, 2. 0mmol/L MgCl2, 200umol/L dNTPs，各 60pmol/每一对上游和下游引物，5U Taq DNA聚合酶(Promaga公司)，患者血液样本抽提基 因组DNA 250ng。将PCR反应体系在PTC220型扩增仪上进行如下程序94°C预变性5min， 然后94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共；35个循环，最后72°C再延伸5min。其中上、下游引物为kq NO :21_40。六、生物芯片的效果验证试验
为验证芯片的分型结果，随机抽取20份标本使用普通引物进行PCR扩增，PCR产物 纯化后通过3730XL自动测序仪(ABI公司)直接测序验证。20份标本的直接测序结果与基 因芯片分型结果一致。
权利要求
1.一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片，由载体与生物探针构成，其特征在于 所述的生物探针含有序列为kq NO :1-20任意一种或多种，所述的序列末端经荧光标记修 饰。
2.根据一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片的制备方法，其特征在于包括原位 合成或预合成后点样。
3.一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片的应用。
全文摘要
本发明涉及生物芯片，特别涉及一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片及应用。一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片，由载体与生物探针构成，其特征在于所述的生物探针含有序列为SeqNO1-20任意一种或多种，所述的序列末端经荧光标记修饰。本发明通过生物芯片技术，可以根据患者的遗传基因的特征(单核苷酸多态性)，从选用药物的种类、接受治疗患者的性别、药物发挥疗效的推定时间点，以及可能产生的不良反应等方面，早期预测抗抑郁剂对于患者的治疗效应，从而指导临床医生制定和实施个体化的治疗方案。
文档编号C12Q1/68GK102071254SQ201010581089
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者史艳艳, 张志珺, 徐治, 浦梦佳, 耿磊钰 申请人:东南大学