专利名称:一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法
技术领域:
本发明涉及一种铁皮石斛种苗生产方法,尤其涉及一种铁皮石斛组培菌根化种苗 生产方法。
背景技术:
铁皮石斛iPendrobium officinale Kimura et Migo)属珍稀濒危高附加值药材, 其养生保健治疗效果确切,在《道藏》、《神农本草经》、《本草纲目》、《现代中药大辞典》、2010 年版《中华人民共和国药典》等医药典籍中均有记载。唐开元年道家经典著作《道藏》收录 中华九大仙草(铁皮石斛、天山雪莲、三两重人参、百二十年首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山 灵芝、海底珍珠、冬虫夏草),因铁皮石斛滋阴补虚效果显著,被列为“中华九大仙草”之首 位。李时珍《本草纲目》记载“强阴益精。久服,厚肠胃,补内绝不足,平胃气,长肌肉,逐皮 肤邪热痱气,脚膝疼冷痹弱,定智除惊,轻身延年。益气除热,健阳,逐皮肤风痹,骨中久冷, 补肾益力。治发热自汗,痈疽排脓内塞。”在2010年版《中华人民共和国药典》一部中单列, 与其它环草石斛、马鞭石斛、黄草石斛、金钗石斛和鼓槌石斛等普通石斛种类区分,其功能 与主治“益胃生津,滋阴清热。用于阴伤津亏,口干烦渴,食少干呕,病后虚热,目暗不明。”
因属濒危、珍稀、高附加值的资源性药材,铁皮石斛被列入《国家重点保护野生药材 物种名录》(1987年)、《中国植物红皮书》(1992年)、《濒危野生动植物种国际贸易公约》 (CITES)附录II。2010年,铁皮石斛生产技术及产业化再次被列入国家重点新产品计划和 国家火炬计划的优先发展技术领域。铁皮石斛作为一种常用中药材,市场需求量较大,如何 解决需求与资源之间的矛盾惟一的途径是人工栽培,采用植物组培技术。随着组织培养技 术的发展和应用,铁皮石斛的组培技术已经基本成熟,但是组培无菌苗移入自然条件下成 活率低,易染杂菌,这些都和缺少与之共生的菌根真菌有关。在自然状态下,兰科植物要与 真菌共生形成菌根,才能使兰科植物健壮的生长。根据这个特点,我们自1992年开始从事 铁皮石斛菌根真菌的分离、培养及铁皮石斛组培苗的菌根化方法的研究。
发明内容
本发明目的在于提供一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法,使用该方法不仅促 进铁皮石斛组培种苗生长,而且组培苗明显粗壮,种植成活率高。本发明采用的方法是先分别培养菌根真菌和细菌,再将菌根真菌及细菌与铁皮石 斛茎诱导出的原球茎小芽共生培养,具体方法如下
(1)菌根真菌的培养
将菌根真菌LPl菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后,接于PDA平皿中,于 23^280C (优选M 26°C)恒温培养1(T15 d (优选1广13 d),在菌落边缘打孔成菌片(优选 Φ =8 mm),并以小块接入固体培养基或液体培养基;菌根真菌LPl为毛壳菌属ijOhaetomium 印.),该菌种保藏于中国药用微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CPCC 480286 ;
菌根真菌的固体培养基含有木质素、纤维素、碳、氮等营养素,由选自原料棉籽壳、木屑、碎玉米芯、阔叶树锯末、麦麸中的一种或几种组成,加水,水量为原料的15(T200 wt%(优 选16(T180 wt%);高压灭菌后分别接入经培养所得菌根真菌LP1,每100 g培养基接2 3片 菌片;真菌用试管、锥形瓶或培养瓶等器皿静置暗培养,待菌丝大部分或全部长满培养基时 取出备用;
菌根真菌的液体培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物;菌根真菌的液体培 养基用水配制,其中葡萄糖If 22 g/L(优选20 g/L),KH2PO4 18^22 g/L(优选20 g/L), MgSO4 1.2 1.8 g/L(优选1.5 g/L),维生素B1 8 12 mg/L(优选10 mg/L),天然物麦麸 25 35 g/L (优选30 g/L)(煮汁)或马铃薯180 220 g/L (优选200 g/L)(使用其浸出 液),培养基PH值为5.6飞.5(优选?!1=6.0);高压灭菌后接入经培养所得菌根真菌LPl,每 100 mL培养基接入广2片菌片;真菌用三角瓶或其他容器通气暗培养,盛装量为50%,置于 23 25°C振荡,转速10(T120 rpm,培养2(T30 d后收获;培养结束后得到液态菌根真菌,可 直接使用或用勻浆机打碎培养产物备用; (2)菌根细菌的培养
配制无氮培养基葡萄糖8 12g/L (优选10 g/L),NaCl 0. 18 0. 22 g/L (优选0. 2 g/ L),KH2PO4 0. 18 0. 22 g/L (优选 0. 2 g/L),CaSO4 · 2H20 0. 08 0. 12g/L (优选 0. 1 g/L), MgSO4 0. 18 0. 22g/L (优选 0. 2g/L),CaCO3 4 6 g/L (优选 5 g/L),其余为水;调节 pH 值为 6.纩7.2(优选7.0),于120°C高压灭菌20 min后,放入4°C冰箱备用,保存不超过半年;
将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后,接于上述配制的无氮培养基中, 20 30°C水浴静止培养16 h,或者20 30°C (优选25°C )水浴摇床,转速100 120 rpm 培养8 10 h (优选9 h);菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter印.),保藏于中国林业微生 物菌种保藏管理中心,保藏编号为CFCC1605 ; (3)铁皮石斛组培苗培养 本步骤在培养室中培养,温度为23 27°C,采用组培特定光谱节能灯(红光波长 640^650 nm,蓝光波长450 460 nm)作为光源,每天光照10 14 h (优选12 h);取野生 的生长一年的铁皮石斛的茎进行灭菌处理,将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段,接种于诱 导培养基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L,诱导茎节发芽;将芽接种于培养基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L,诱导出大量原球茎;将原球茎接种于培养基(1/2_1)N6+BA 1.5 mg/ L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁,诱导原球茎分化成小芽;将小芽接种于培养基(1/2-1) N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中,在此培养基中同时加入备好的液体菌 根真菌1.5 3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5 3.0 g/L,以及细菌培养液广2 mL/L,在此培养 基中小芽生长成小植株;再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖 3 wt%+液体菌根真菌1. 5 3. 0 mL/L或固体菌根真菌1. 5 3. 0 g/L+细菌培养液广2 mL/L, 其pH=5. 8,待小芽生长成中植株;最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香 蕉汁+3 wt%蔗糖+液体菌根真菌1.5 3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5 3.0 g/L+细菌培养 液广2 mL/L,其pH=5. 8,待中植株生长成大植株; (4)组培苗的水培炼苗
营养液由以下组分构成硝酸钾1. 0 1. 2 wt%o (优选1. 1 wt%o),硫酸铵0. 18 0. 22 wt% (优选 0. 2 wt% ),硝酸铵 0. 08 0. 12 wt%。(优选 0. 1 wt%。),硫酸镁 0. 1 0. 14 wt% (优选 0. 12 wt% ),磷酸二氢钾 0. 08 0. 12 wt%。(优选 0. 10 wt%。),氯化钙0. 04 0. 08 wt% (优选 0. 06 wt% ),硫酸锰 0. 01 0. 03 wt%。(优选 0. 02 wt%。),硫 酸亚铁 0. 02 0. 04 wt% (优选 0. 03 wt% ),硫酸锌 0. 004 0. 006 wt%。(优选 0. 005 wt%。),其余为水;
将得到的铁皮石斛培养苗取出,用15 20°C (优选17°C)的清水冲洗,浙去多余水分, 栽种于架在营养液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中,将营养液注入营养液槽中,使营养 液浸没根系的40飞0%,开动营养液槽的循环水泵,流速4飞m/s;通风,风速0.3 0.5 m/s, 进行种苗炼化;1圹22 d后,铁皮石斛种苗根系发达,再生根增多,茎长长增粗,叶片变绿,变 厚,即可以拔出进行大田移栽。采用本发明提供的铁皮石斛组培菌根化苗的生产方法,不仅促进铁皮石斛组培种 苗生长,而且组培苗明显粗壮。移栽后,成活率可达95%以上,生长量大,新芽分蘖多且长势 迅猛,抗逆性强。与不接菌根真菌和细菌组培的铁皮石斛苗对照组相比,接菌的铁皮石斛苗 比对照植株根系发达,植株节间明显膨大,鲜重有所提高,一般提高1(Γ20%。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行进一步说明。实施例1
(1)菌根真菌的培养
本实施例采用菌根真菌LPl自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后,转接与PDA平皿 中,25°C恒温培养12 d时,用Φ=8 mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片,以小 块接入固体培养基;
真菌菌株培养采用固体培养,菌根真菌的固体培养基原料采用棉籽壳与阔叶树锯末按 重量比1:1混合,加水量为原料的170 wt%;高压灭菌后分别接入上述真菌,每100 g培养 基接2片菌片(Φ=8 mm);真菌用锥形瓶静置暗培养,待菌丝大部分或全部长满培养基时取 出,得到固体菌根真菌;
(2)菌根细菌的培养
配制无氮培养基葡萄糖 10 g/L,NaCl 0. 2 g/L,KH2PO4 0. 2 g/L,CaSO4 · 2H20 0. 1 g/ L,MgSO4 0. 2 g/L, CaCO3 5 g/L,其余为水,调节pH值为7. 0,于120°C高压灭菌20 min后, 放入4°C冰箱备用,保存不超过半年;
将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后,接于上述配制的无氮培养基中, 25°C水浴摇床,转速120 rpm,培养9 h ;菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter印.),目前 保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CFCC1605 ;
(3)铁皮石斛组培菌根化苗的生产
本步骤在培养室中培养,温度为25士 1°C,采用组培特定光谱节能灯(红光波长645 nm,蓝光波长455 nm)作为光源,每天光照12 h ;取野生的生长一年的铁皮石斛的茎进行 灭菌处理,将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段,接种于诱导培养基(1/2-1)Ν6+ΒΑ 2.5 mg/ L,诱导茎节发芽;将芽接种于培养基(1/2-1)N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L,诱导出大量 原球茎;将原球茎接种于培养基(1/2-1) N6+BA 1.5 mg/L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁,诱 导原球茎分化成小芽;将小芽接种于培养基(1/2-1)N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中,在此培养基中同时加入备好的固体菌根真菌2. 0 g/L,以及细菌培养液2. 0mL/L,在此培养基中小芽生长成小植株;再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖3 wt%+固体菌根真菌2. 0 g/L+细菌培养液2. 0 mL/L,其pH=5. 8,待小芽 生长成中植株;最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香蕉汁+3 wt%蔗糖 +固体菌根真菌2. 0 g/L+细菌培养液2. 0 mL/L,其pH=5. 8,待中植株生长成大植株; (4)组培苗的水培炼苗
按如下比例配制营养液硝酸钾1. 1 wt%。,硫酸铵0. 2 wt%。,硝酸铵0. 1 wt%。,硫酸镁 0. 12 wt%。,磷酸二氢钾0. 10 wt%。,氯化钙0. 06 wt%。,硫酸锰0. 02 wt%。,硫酸亚铁0. 03 wt%。,硫酸锌0. 005 wt%。,其余为水;
将得到的铁皮石斛培养苗取出,用17士 1°C的清水冲洗,浙去多余水分,栽种于架在营 养液槽上的打好小孔(Φ=5 mm)的泡沫板(厚5 mm)的孔隙中,将营养液注入营养液槽中, 使营养液浸没根系的50%,开动营养液槽的循环水泵,流速5米/秒;通风,风速0.4 m/s,进 行种苗炼化;19 d后,铁皮石斛种苗根系发达,再生根增多,茎长长增粗,叶片变绿,变厚,即 可以拔出进行大田移栽。实验设置对照组和接菌组,对照组植株生长过程不添加菌根真菌和细菌,其余所 有步骤与接菌组相同。实验结果如表1。实施例2
本实施例基本操作同实施例1,不同之处是
1、本实施例用的菌株LPl真菌菌株,不采用DP6细菌菌株。2、菌根真菌采用液体培养培养基。培养基的配制用水配制,葡萄糖20 g/L,KH2PO4 20 g/L, MgSO4 1. 5 g/L,维生素 B1 10 mg/L,天然物麦麸 30 g/L (煮汁),培养基 pH=6. 0。 高压灭菌后接入上述真菌,每100 mL培养基接入2片菌片(φ=8 mm)。真菌用三角瓶振荡 通气暗培养,三角瓶装量50%,转速100 rpm,25°C培养25 d收获。培养结束后用勻浆机打 碎培养产物,得到液体菌根真菌。铁皮石斛组培菌根化苗的生产过程中菌根真菌添加为液体菌根真菌2 mL/L。实验设置对照组和接菌组,对照组植株生长过程不添加菌根真菌和细菌,其余所 有步骤与接菌组相同。实验结果如表1
权利要求
1. 一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法,其特征在于步骤如下(1)菌根真菌的培养将菌根真菌LPl菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后,接于PDA平皿中,于23l8°C 恒温培养1(T15 d,在菌落边缘打孔成菌片,并以小块接入固体培养基或液体培养基;菌根 真菌LPl为毛壳菌属ifhaetomium印.),该菌种保藏于中国药用微生物菌种保藏管理中 心,保藏编号为CPCC 480286 ;菌根真菌的固体培养基含有木质素、纤维素、碳、氮等营养素,由选自原料棉籽壳、木 屑、碎玉米芯、阔叶树锯末、麦麸中的一种或几种组成,加水,水量为原料的15(Γ200衬%;高 压灭菌后分别接入经培养所得菌根真菌LP1,每100 g培养基接2 3片菌片;真菌用试管、 锥形瓶或培养瓶等器皿静置暗培养,待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用;菌根真菌的液体培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物;菌根真菌的液体培 养基用水配制,其中葡萄糖If 22 g/L(优选20 g/L),KH2PO4 18^22 g/L(优选20 g/L), MgSO4 1.2 1.8 g/L(优选1.5 g/L),维生素B1 8 12 mg/L(优选10 mg/L),天然物麦麸 25 35 g/L (优选30 g/L)(煮汁)或马铃薯180 220 g/L (优选200 g/L)(使用其浸出 液),培养基PH值为5.6飞.5(优选?!1=6.0);高压灭菌后接入经培养所得菌根真菌LPl,每 100 mL培养基接入广2片菌片;真菌用三角瓶或其他容器通气暗培养,盛装量为50%,置于 23 25°C振荡,转速10(T120 rpm,培养2(T30 d后收获;培养结束后得到液态菌根真菌,可 直接使用或用勻浆机打碎培养产物备用;(2)菌根细菌的培养配制无氮培养基葡萄糖 8 12g/L,NaCl 0. 18 0. 22 g/L, KH2PO4 0. 18^0. 22 g/L, CaSO4 · 2H20 0. 08 0. 12g/L, MgSO4 0. 18 0. 22g/L, CaCO3 4 6 g/L,其余为水;调节 pH 值为 6. 9^7. 2,于120°C高压灭菌20 min后,放入4°C冰箱备用,保存不超过半年;将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后,接于上述配制的无氮培养基中, 20 30°C水浴静止培养16 h,或者20 30°C水浴摇床,转速100 120 rpm培养8 10 h ; 菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter印.),保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心,保 藏编号为CFCC1605 ;(3)铁皮石斛组培苗培养 本步骤在培养室中培养,温度为23 27°C,采用组培特定光谱节能灯(红光波长 640^650 nm,蓝光波长450 460 nm)作为光源,每天光照10 14 h (优选12 h);取野生 的生长一年的铁皮石斛的茎进行灭菌处理,将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段,接种于诱 导培养基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L,诱导茎节发芽;将芽接种于培养基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L,诱导出大量原球茎;将原球茎接种于培养基(1/2_1)N6+BA 1.5 mg/ L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁,诱导原球茎分化成小芽;将小芽接种于培养基(1/2-1) N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中,在此培养基中同时加入备好的液体菌 根真菌1.5 3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5 3.0 g/L,以及细菌培养液广2 mL/L,在此培养 基中小芽生长成小植株;再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖 3 wt%+液体菌根真菌1. 5 3. 0 mL/L或固体菌根真菌1. 5 3. 0 g/L+细菌培养液广2 mL/L, 其pH=5. 8,待小芽生长成中植株;最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香 蕉汁+3 wt%蔗糖+液体菌根真菌1.5 3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5 3.0 g/L+细菌培养液广2 mL/L,其pH=5. 8,待中植株生长成大植株;(4)组培苗的水培炼苗营养液由以下组分构成硝酸钾1. 0 1. 2 wt%o (优选1. 1 wt%o),硫酸铵0. 18 0. 22 wt% (优选 0. 2 wt% ),硝酸铵 0. 08 0. 12 wt%。(优选 0. 1 wt%。),硫酸镁 0. 1 0. 14 wt% (优选 0. 12 wt% ),磷酸二氢钾 0. 08 0. 12 wt%。(优选 0. 10 wt%。),氯化钙 0. 04 0. 08 wt% (优选 0. 06 wt% ),硫酸锰 0. 01 0. 03 wt%。(优选 0. 02 wt%。),硫 酸亚铁 0. 02 0. 04 wt% (优选 0. 03 wt% ),硫酸锌 0. 004 0. 006 wt%。(优选 0. 005 wt%。),其余为水;将得到的铁皮石斛培养苗取出,用15 20°C (优选17°C )的清水冲洗,浙去多余水分, 栽种于架在营养液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中,将营养液注入营养液槽中,使营养 液浸没根系的40飞0%,开动营养液槽的循环水泵,流速4飞m/s;通风,风速0.3 0.5 m/s, 进行种苗炼化;1圹22 d后,铁皮石斛种苗根系发达,再生根增多,茎长长增粗,叶片变绿,变 厚,即可以拔出进行大田移栽。
2.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法,其特征在于所述将菌根 真菌管经菌种活化后,接于PDA平皿中,于M 26°C恒温培养1广13 d。
3.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法,其特征在于所述菌根真 菌的固体培养基的加水量为原料的16(T180 wt%0
4.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法,其特征在于所述菌根真 菌的液体培养基用水配制,其中葡萄糖20 g/L, KH2PO4 20 g/L,MgSO4 1.5 g/L,维生素B1 10 mg/L,天然物麦麸30 g/L(煮汁)或马铃薯200 g/L(使用其浸出液),培养基pH值为6.0。
5.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法,其特征在于所述配制 无氮培养基葡萄糖 10 g/L, NaCl 0. 2 g/L, KH2PO4 0. 2 g/L, CaSO4 · 2H20 0. 1 g/L, MgSO4 0. 2g/L,CaCO3 5 g/L,其余为水,调节pH值为7.0。
6.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法,其特征在于所述菌根细 菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后于无氮培养基中水浴摇床培养时,温度为25°C, 培养9 h。
7.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法,其特征在于所述铁皮石 斛组培苗培养时,每天光照12 h。
8.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法,其特征在于所述营养液 由以下组分构成硝酸钾1. 1 wt%。,硫酸铵0. 2 wt%。,硝酸铵0. 1 wt%。,硫酸镁0. 12 wt%0, 磷酸二氢钾0. 10 wt%。,氯化钙0. 06 wt%。,硫酸锰0. 02 wt%。,硫酸亚铁0.03 wt%。,硫酸锌 0.005 wt%。,其余为水。
9.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法,其特征在于所述组培 苗的水培炼苗时,将前述步骤得到的铁皮石斛培养苗取出,用17°C的清水冲洗,浙去多余水 分。
全文摘要
一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法,其步骤分为(1)采用固体或液体培养基对菌根真菌进行培养,菌根真菌采用菌根真菌LP1为毛壳菌属(Chaetomiumsp.);(2)菌根细菌的培养,菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobactersp.);(3)铁皮石斛组培苗培养;(4)组培苗的水培炼苗。采用本发明提供的铁皮石斛组培菌根化苗的生产方法,不仅促进铁皮石斛组培种苗生长,而且组培苗明显粗壮。移栽后,成活率可达95%以上,生长量大,新芽分蘖多且长势迅猛,抗逆性强。与不接菌根真菌和细菌组培的铁皮石斛苗对照组相比,接菌的铁皮石斛苗比对照植株根系发达,植株节间明显膨大,鲜重提高10~20%。
文档编号C12N1/20GK102144540SQ201010581919
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者吴维佳, 崔晓娟, 张苏锋, 李 杰, 梁经军, 赵兴兵, 高正龙, 黄生云 申请人:梁经军