专利名称：植物病原菌诱导型乙烯响应因子基因启动子序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明是用分子生物学技术获得一种新的植物病原菌诱导表达的启动子序列及 其在转基因植物中的应用，属于植物基因工程领域。
背景技术：
植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。高等 植物基因表达调控主要发生在转录水平上，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互作 用。植物起始启动子是RNA聚合酶识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，通 常位于基因上游，包括CAAT box和TATA box,分别依赖DNA的RNA聚合酶的识别和结合位 点。从转录起始点到CAAT box附近的这一段区域通常称为基础启动子。在启动子上游的 5/远上游区有增强或阻遏基因表达的序列和对激素或外界胁迫有应答作用的序列，这些序 列决定了基因在特定时空条件下表达，统称为顺式作用元件，转录调控是通过其与转录因 子之间的相互作用来实现的。根据启动子的作用方式及其功能，可将其分为3类组成型启动子，即基因的表达 不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达出来、组织特异性启动子，即其基因的表 达分布在植物的某个组织或器官中和诱导性启动子。诱导性启动子是在某些特定的物理或 化学信号的刺激下，可以大幅度提高外源基因的转录水平。与组成型启动子相比，它具有独 特的优点它可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，让其接受诱导信 号当植物处在胁迫条件下，外源基因才高效表达，而在正常条件下，外源基因表达很弱或 根本不表达，这样有利于转基因植物的生长，又可以提高植物的抗逆性。一般而言，诱导性 启动子的活性受物理、化学及逆境胁迫等信号的诱导，启动子区包含光、ABA、热、干旱、盐、 低温、病原菌等响应元件。当植物受到真菌、细菌、病毒等病原微生物侵染时，植物体内相关 保护蛋白基因被激活，从而消除有害代谢产物对植物自身的伤害，调控这类保护蛋白基因 表达的启动子即生物胁迫诱导性启动子。诱导性启动子在转录水平上参与调控下游相应基 因的表达，从而使植物能够抵御外界环境胁迫，因此，对植物启动子的研究有助于了解基因 转录调控表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。
发明内容
本发明的目的是解决目前分子抗病育种过程中，因使用组成型启动子，使得外源 基因持续表达，而破坏了植物的新陈代谢，阻碍植物的正常生长发育问题，提供一种新的植 物病原菌诱导型启动子序列及其应用。本发明提供了一种新的植物病原菌诱导的乙烯响应因子基因(VpERF4)启动子， 其启动子核苷酸全长序列为158;3bp ；同时提供了植物病原菌诱导型启动子的应用，即利用 获得的病原菌诱导型启动子，构建获得“启动子-目的基因”的载体，将其瞬时转化植物，病 原菌诱导可以激活下游目的基因的表达，其目的基因是提高植物抗病性的基因。本发明利用诱导性启动子代替组成型启动子，可以获得病原菌诱导的特异表达的启动子；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获 得病原菌诱导表达目的基因的转基因植株；这不仅可以实现目的基因在特定逆境情况下的 表达，而且为植物抗病基因的应用提供强有力的工具。
附图1是本发明中国野生华东葡萄株系“白河-35_l”VpERF4基因的表达方式图， 描述中国野生华东葡萄株系“白河-35-1，，在接种葡萄白粉菌0，6，12，24，48，72，96小时， VpERF4基因的表达方式，采用半定量PCR的方法，葡萄Actin基因作为内参。附图2是本发明烟草叶片的GUS染色图，描述烟草赤星病病原菌孢子接种两天后， VpERF4启动子-GUS瞬时转化烟草叶片的GUS染色结果，对照喷施清水，瞬时转染喷施烟草 赤星病病原菌孢子。
具体实施例方式以下结合实施例及附图对本发明做进一步详细描述实施例一中国野生华东葡萄‘白河-35-1’在葡萄白粉病诱导下VpERF4基因的 表达及VpERF4基因启动子的克隆a.葡萄白粉病诱导材料的处理葡萄白粉病压片法接种中国野生华东葡萄‘白河-35-1’叶片，接种后于0，6，12， 24,48,72,96,120h剪取叶片，立刻放入液氮中，于_80°C保存备用；b.中国野生华东葡萄叶片总RNA的提取参照张今今等2003《果树学报》“葡萄总RNA提取方法研究”所提出的改进的SDS/ 酚法，提取中国野生华东葡萄叶片的总RNA ；c.半定量 RT-PCR，c. 1所用引物如下目的基因 VpERF4 上游引物5，-GGACTAAAATCACTTGCCCCATCT-3，下游引物5，-TCTTTGCTCCCTGCTCTCCCCATC-3，内参基因 Actin:上游引物5，-TCCTGTGGACAATGGATGGA-3，下游引物5，-CTTGCATCCCTCAGCACCTT-3，
c. 2半定量RT-PCR试验流程，c. 2. 1对提取的总RNA进行DNAase消化，去除含有的基因组DNA，电泳检测确保 RNA样品中DNA已去除干净，c. 2. 2取1 μ gRNA,采用Promega公司的反转录试剂盒进行反转录，c. 2. 3将反转录20 μ 1产物稀释5倍，取1 μ 1作为模板，按如下反应体系和程序进 行PCR扩增，PCR体系cDNA模板1 μ 1，上游弓丨物1 μ 1，下游弓丨物1 μ l，2XTaq Plus PCRMasterMix 10 μ 1, DD-H2O 7 μ 1，总计 20 μ 1，PCR 反应程序94°C变性:3min ；94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，27 个循 环；72°C 10min，4°C保温，c. 3半定量PCR结果，中国野生华东葡萄VpERF4基因未接种葡萄白粉菌时，表达量比较低，或基本上不表达，接种后，表达量升高，12小时达到最高峰，而后降低，96小时恢复 至未接种状态，c. 4PCR扩增目的片段根据已知的中国野生华东葡萄VpERF4基因和葡萄基因组 序列设计启动子特异引物，其上游引物中引入BamH I酶切位点，下游引物中引入Nco I酶 切位点上游引物5，-GGGGGATCCAACATCTGCGTCATGCCA-3，下游引物5，-GGGCCATGGGGCCTGTTGTTCTTCTCC-3，PCR反应体系DNA模板1 μ 1，上游引物1 μ 1，下游引物1 μ 1，10XLA PCRBuffer (Mg2+) 2. 5 μ 1, Takara LA Taq 0· 25 μ 1，Dntp Mixture 4 μ 1，DD_H2015. 25 μ 1，总 计 25 μ 1，PCR 反应程序94°C 变性 5min ；94°C 变性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 循环，72°C 10min，4°C保温，取反应产物10 μ 1用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，c. 5目的DNA片段的回收和克隆，c. 5. 1目的基因DNA片段的回收目的基因DNA片段从琼脂糖凝胶上的回收用天 根生化科技有限公司普通琼脂糖凝胶回收试剂盒进行，c. 5. 2回收片段与克隆载体pGEM-T-easy的连接反应连接反应按照Promega公 司pGEM-T-easy载体试剂盒说明进行操作，连接反应体系2XRapid Ligation Buffer 2· 5 μ 1，pGEM-T-easy Vector 0· 5 μ 1，回收 DNA 片段 1· 5 μ 1，T4DNA Ligase 0. 5 μ 1，总计 5 μ 1，混勻反应物，短暂离心，4°C，12小时，c. 6转化和阳性克隆的鉴定用于转化的大肠杆菌为天根生化科技有限公司，型 号CB104-01的ToplO菌株，连接产物的转化在无菌条件下操作，挑取转化平板上的白色菌 落于LB液体培养，采用天根生化科技有限公司的离心柱型高纯度质粒小提试剂盒提取质 粒作为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1583bp的VpERF4基因的启动子， 即为含有VpERF4基因启动子的阳性克隆，c. 7测序验证经过鉴定的阳性克隆，进行DNA测序，其启动子核酸序列为158;3bp。实施例二 “VpERF4启动子-GUS”植物表达载体构建及瞬时转化烟草，病原菌诱导 特异表达，a.酶切载体质粒pCAMBIA1301和含有VpERF4启动子的T载体质粒，回收相应的 DNA片段，b.将上述两片段在连接酶催化下于16°C，连接12小时，连接体系T4 DNALigase 2. 5 μ 1，T4DNA Ligase Buffer 0. 5 μ l，pCAMBIA1301 载体回收片段 1. 5μ l,VpERF4 启动子 回收片0. 5μ 1，总计5μ 1 ；c.转化和阳性克隆的鉴定，用于转化的大肠杆菌为天根生化科技有限公司，型号CB104_01的ToplO菌株，感 受态细胞的制备和连接产物的转化均在无菌条件下操作，挑取转化平板上的白色菌落于LB 液体培养，采用天根生化科技有限公司的离心柱型高纯度质粒小提试剂盒提取质粒作为模 板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆；d.将从阳性克隆中提取的质粒，采用电转化的方法转化GV3101，获得工程化农杆菌，用于植物的瞬时转化；e.挑取含有VpERF4启动子的工程菌单菌落于液体LB培养基，培养12小时， 用MES溶液重悬，调整OD值为0. 3，用Iml的无针头的注射器将菌液注入生长4周后的烟 草叶片中，用塑料薄膜覆盖保湿，附MES溶液成分5mg L—1葡萄糖，500mM MES, pH5. 5,20mM MgS04, IOOuM 乙酰丁香酮；f.瞬转一天后，用浓度为IX IO5个/毫升的烟草赤星病孢子液喷施转染叶片表 面，28°C培养；g.接种烟草赤星病两天后利用组织化学染色法检测转基因烟草叶片中GUS报告 基因的表达，瞬转叶片于X-GLUC溶液中抽真空15分钟，37°C放置12小时，而后75%的酒精 脱色，染色结果喷施清水的瞬转烟草叶片，染色后呈白色，GUS基因未表达，而喷施烟草黑 星病菌孢子的瞬转叶片呈现蓝色，烟草赤星病诱导了 GUS基因的表达。
权利要求
1.植物病原菌诱导型乙烯响应因子基因启动子序列，其特征是启动子核苷酸全长序列 为 1583bp。
2.如权利要求1所述的植物病原菌诱导型乙烯响应因子基因启动子序列，其特征在 于病原菌诱导型乙烯响应因子基因启动子核苷酸全长序列1583bp 5 ‘ AACATCTGCG ‘TCATGCCACCCGGAAATCCAACCACCTTTATCACCTCTTTGTATATATCTCTTTGTTGCCTTGTTTTTAGTCACCGGGATGACGTGACCCAAGCCTAAGTGTGTTTGCTATAATTTGCCATCGTATTCGGCCTAAATTGCAGAATTACCCTTCATCAAACAAATTTATTAAGAATTTGCTTTTGTTATTATTTATTTTTTGTACTTTAAAATAGAAAGGAAATTCAAATGCGTTTATGTTAAAATCGGGTTTTATTTTATTTATCTCTTTAATCCCCTTTTGTACTCCATTTAATTTAAAAATATTAAATTTATTGTCATATGTATTTATAATAACCCCTTTTGAATTTCTCATCATCAAGCTTGTGAAAAGATAAAAAAAAGTCTTGTGCCCCAATTGTGCCCAAGCCCATTTGAGAGGGAATTTAAGTGGTTTGAGTCGAAACCCCTCAATGCACGACATGTCCATATATGCATTTTGCGTAAGGTTTTTAATTGCTGAATTTAAAGATAGGTCGTCAACCCCTTTCTACGCCGAGTTTGATTATTGAAAAGGACAAATCTATTTTAGTCATATTGCTATCATGCCTCAACCAAATCCAHGGTTCCTTTTTTTGGTTATTTGTTTTGGGATTCGTCAATTCTAGTTTTAGTCTTATTCTTTGAGACCTATTTTTTTAACAATATATATAACCCTTACCTAGTATAAGATTATCTATGCATAAAGACTTTTGTTAAAAGAATTTTTTCAACCTTTAGATGAAGCTTAGTTCATTCTACGGATCTTTCACTAAAGTCTAGCAAACTCTATGAGTTTATTACAAAAGCATTGAAAGTAAATATATATAAAATGAATGGTATTTACTTTAATGACATAATGAACACATGTCTTCACGGTAATTCTAGAGCTTTTATGACATATTTACTAAGGCTTTTTTTAAAAAAAAAAAACCAAATGAAAAAAAAAGAA0CCATAACAATAATGAAAATAAAAGGAAATGAAAAATAGAGTTGAGAATCTTTCGAAGTATTCGAAAACCCAATACTACGGCAGATGCAAATAAGAATATTTTCAACATTTTATAGGGCAGGTAACTTGTCGGAGTTAATTAAACCCAATATCTACGGTGGAAGAAAGAAGCAAACAAATAATAAGCCAAGTGCGCAGGGGCGTGAGGACAATGACCCACATGGAAACTCACTGCCGTTAAACAAATAAATTAATCTTTTTAGGCATTTCCCAACCTAAGATATGCGGATAAGCAGATCTTTATGCATTAGAGTACCAAAATTATGTATATGGGCCCTTTTATATGATGTTTGGTAGTGCAATGGTGTAATATGATGGAAAAGCAAGGGCAAAGCTTTTGATAAATGAGTAGAAAACACATGCCCCTGCCCCCACGATTTTTCACACTTTCCTATTTCCCCCATGACTTCTCCACAAGTCCACATATGCCAAAGTTAAATACTAGGATAGAACCACCCATCACAAACTTCTAAGCTTCATAATCACAAGGCTCAGCGTCCTCAGAGAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGGAGA AGAACAACAG GCC
3.如权利要求1所述的植物病原菌诱导型乙烯响应因子基因启动子应用，其特征在 于利用获得的病原菌诱导型启动子，构建获得“启动子-目的基因”的载体，将其瞬时转化 植物，病原菌诱导可以激活下游目的基因的表达，其目的基因是提高植物抗病性的基因。
4.如权利要求3所述植物病原菌诱导型乙烯响应因子基因启动子应用，其特征在于， 利用该启动子构建获得“VpERF4的启动子-GUS”载体，瞬时转化烟草叶片，接种烟草赤星 病，该启动子能够驱动GUS报告基因的特异表达。
全文摘要
本发明涉及了一种植物病原菌诱导型乙烯响应因子基因启动子序列，其核酸全长序列为1583bp，将其瞬时转化烟草叶片，烟草赤星病诱导可以激活GUS基因的表达。应用本发明的启动子，构建获得“启动子-目的基因”载体，利用遗传转化技术将其导入到植物中，可以实现对目的基因的定向操作，获得病原菌诱导表达目的基因的转基因植株；这不仅可以实现目的基因在特定逆境情况下的表达，而且为植物抗病基因的应用提供强有力的工具。
文档编号C12N15/82GK102121006SQ20101058258
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者朱自果, 李慧娥, 王跃进 申请人:西北农林科技大学