专利名称：永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及一种永生化人椎间盘髓核细胞体系的制
备方法。
背景技术：
椎间盘退变是一个极为复杂的生理和病理过程。通过研究探讨椎间盘髓核细胞种 群变化的机理，可以为临床采用组织工程再生的方法修复退变的椎间盘组织、恢复功能提 供基础。然而，髓核细胞本身增殖能力弱，具有容易老化和生长停滞的特性，因此，有必要通 过基因工程技术构建一种永生化的髓核细胞株，以建立标准化的体外髓核细胞研究平台， 为提高退变性椎间盘病的治疗以及整体防治水平提供技术研究基础。细胞自发性永生化的概率很低，啮齿类动物细胞为1E-5 1E-6，而人类细胞则小 于1E-12，因此通常采用基因转染方法达到永生化的目的。目前，对于人髓核细胞，Daisuke 等报道了通过腺病毒转染SV40基因的方法构建了永生化的人髓核细胞株，细胞培养超过5 个月，传20代形态学和功能特性仍保持不变，且无致瘤性，可作为组织工程椎间盘的种子 细胞。然而，这种通过病毒或癌基因、原癌基因的转染方法，主要是通过抑制Ml期(第一死 亡期)机制进行的，细胞在绕过Ml期继续生长、经过20 30群体倍增次数后，进入M2期 (第二死亡期)，细胞会出现退化凋亡。因此，这种方法构建的细胞株，不同于生殖干细胞， 为转化细胞，并非真正意义的永生化，仍然难以满足椎间盘退变病变机理的研究需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种采用外源性人端粒酶反转录酶 (hTERT)转染人髓核细胞激活端粒酶而诱导制备永生化人椎间盘髓核细胞体系的方法，以 构建真正意义上的永生化人髓核细胞系，为进一步研究退行性椎间盘病的病变机理提供标 准细胞株，为提高对退变性椎间盘病的整体防治水平提供新的思路。本发明的目的通过以下技术方案予以实现本发明提供的一种永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法，将外源性人端粒酶 反转录酶转染人髓核细胞激活端粒酶而诱导获得永生化人椎间盘髓核细胞体系。所述外源性人端粒酶反转录酶的核苷酸序列如序列表中序列1所示。所述外源性人端粒酶反转录酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。本发明所述外源性人端粒酶反转录酶可以按照以下方法获得从肝癌组织中提取总RNA，Oligo-dT为引物，以总RNA为模板，在禽源性反转录酶 作用下逆转录获得cDNA ；然后进行PCR反应扩增目的基因，经回收纯化获得目的基因PCR 产物，并与载体T-Easy进行连接获得重组体T_hTERT。其中，所述PCR反应采用的引物为RT-I :5，-tggaaggagttcgatgccgcgcgctccccgctg-3， 力口入 Xmnl 酶切位点RT-2 :5，-caccctcgaggtgagacgctcgg-3，带 Xhol 酶切位点
RT-3 :5，-acctcgagggtgaaggcactgttca-3，带 Xhol 酶切位点RT-4 :5，-cgctcgagctagtccaggatggtcttgaagtct-3， 带 Xhol 酶切位点；并以RT-I和RT-2、RT-3和RT-4引物，分别进行PCR反应。本发明所述重组体T-hTERT通过构建成pGFP-hTERT真核表达质粒转染人髓核细 胞，所述pGFP-hTERT真核表达质粒的构建方法如下a)所述重组体T-hTERT和载体pAAV_MCS质粒DNA进行连接，并转化DH5 α感受 态大肠肝菌，从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定获得的pAAV-hTERT质 粒；b)消化连接pAAV-hTERT质粒和pGFP质粒DNA，并转化DH5 α感受态大肠肝菌，从 含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定，构建成pGFP-hTERT真核表达质粒。本发明具有以下有益效果(1)采用hTERT转染人髓核细胞激活端粒酶的方法构建永生化髓核细胞体系，已 通过了 Ml期和M2期，所获得的永生化细胞同生殖干细胞一样，是真正意义上的永生化，为 进一步研究退行性椎间盘病的病变机理提供了标准细胞株，为提高对退变性椎间盘病的整 体防治水平提供了新的思路。(2) hTERT介导的永生化细胞是正常细胞，并非转化细胞，具有正常生长率、核型， 呈现接触抑制和锚着依赖等安全性，不具有致癌性和软琼脂克隆形成能力。(3)转染hTERT髓核细胞生长速度较正常髓核细胞快，转染hTERT的髓核细胞可以 成功传20代以上，与正常髓核细胞第1代相比，细胞内以及细胞外液II型胶原、糖胺多糖 基因表达量均无明显差异，裸小鼠致瘤实验表明髓核细胞无致瘤性。
下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细描述图1是本发明实施例技术流程框图；图2是RT-PCR扩增目的基因hTERT基因片段结果；图3是pGFP-hTERT真核表达质粒酶切鉴定结果；图4是转染pEGFP-hTERT至正常髓核细胞24小时后荧光显微镜分析结果；图5是永生化髓核细胞第20代荧光照片；图6是转染pEGFP-hTERT后RT-PCR扩增髓核细胞hTERT基因片段结果；图7是转染pEGFP-hTERT后髓核细胞Western blot检测结果；图8是正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞生长曲线比较；图9是正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞内相关生长因子基因 检测结果；图10是正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞外液II型胶原表达 量比较；图11是正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞外液糖胺多糖表达量 比较；图12是永生化髓核细胞第2代II型胶原免疫荧光表达；图13是永生化髓核细胞第20代II型胶原免疫荧光表达；
图14是正常髓核细胞第1代II型胶原免疫荧光表达；图15是正常髓核细胞第4代I型胶原免疫荧光表达；图16是种植永生化髓核细胞所致裸小鼠肿物组织学切片显微镜观察情况之一；图17是种植永生化髓核细胞所致裸小鼠肿物组织学切片显微镜观察情况之二 ；图18是种植正常髓核细胞所致裸小鼠肿物组织学切片显微镜观察情况。
具体实施例方式图1 图18所示为本发明永生化人椎间盘髓核细胞体系制备方法的实施例，其技 术流程如图1所示，通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核 表达质粒的构建、转染hTERT至人髓核细胞并进行表达检测等步骤实现。本实施例通过构 建外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)重组绿色荧光表达载体，成功转染正常髓核细胞激活 端粒酶并在细胞中稳定表达，从而获得永生化人椎间盘髓核细胞体系，并对其生物学特性 和安全性进行测定。具体方法如下—、正常髓核细胞的分离、培养及传代正常髓核组织来自3例脊柱侧弯行矫形的患者，其中2例13岁、1例15岁，可见 到外周白色的纤维环和中心胶冻样的髓核组织。用含双抗(青-链霉素)的生理盐水浸泡 椎间盘10分钟，用刮匙轻轻将髓核组织从椎间盘中分离，双抗生理盐水浸泡冲洗大约3 4 次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成IX IX Imm大小，将正常椎间盘髓核组 织放入盛有IOml 2% II型胶原酶的IOOml烧杯中，磁力搅拌器搅拌约60分钟。待组织完 全溶解后，1000r/min离心10分钟，吸出上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基Iml轻 轻吹散细胞，吸至50ml培养瓶中，加入10%胎牛血清的DMEM培养基6 8ml，静置于37°C、 饱和湿度、5% CO2孵箱中培养3天。3天后倒置显微镜观察细胞贴壁生长情况，隔天换液。 当细胞生长至90%融合状态时，用胰酶消化、传代。二、构建pGFP-hTERT真核表达质粒1、材料RNA试剂盒购于TaKaRa，小提质粒试剂盒、胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4DNA 连接酶、Taq聚合酶均购自MBI公司，western blot试剂盒购于GEHealthcare公司，一抗 hTERT购自abeam公司，二抗mouse-HRP购自博士德公司。2、引物设计RT-I :5，-tggaaggagttcgatgccgcgcgctccccgctg-3RT-2 :5， -caccctcgaggtgagacgctcgg-3，RT-3 :5， -acctcgagggtgaaggcactgttca-3，RT-4 :5，-cgctcgagctagtccaggatggtcttgaagtct-33、目的基因克隆用RNA提取试剂盒从肝癌组织中按试剂盒说明提取总RNA，01igo-dT为引物，以 总RNA为模板，在禽源性反转录酶(M-MULV)作用下逆转录lh，获得cDNA ；然后，以RT-I和 RT-2、RT-3和RT-4引物，分别进行PCR反应，扩增目的基因。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电 泳分离、鉴定，证实扩增产物为1. 9kb和1. 4kb (见图2)，与预期结果一致。按快速凝胶回收 试剂盒说明书方法回收纯化PCR产物，获得目的基因PCR产物，并与载体T-Easy进行连接
加入Xmnl酶切位点 带Xhol酶切位点 带Xhol酶切位点 带Xhol酶切位点获得重组体T-hTERT。4、真核表达质粒中目的基因序列测定从重组体T-hTERT中提取质粒，挑选经初步鉴定的重组体，采用双向测定法测序， 其核苷酸序列如序列表中序列1所示，氨基酸序列如序列表中序列2所示。用DNASIS软件 对所测的基因序列和氨基酸序列与GenBank公布的序列进行同源性比较。5、目的基因真核表达质粒的构建a)应用Xmnl和Xhol分别完全消化T-hTERT和载体pAAV_MCS质粒DNA，1 %琼脂 糖凝胶电泳分离，并回收纯化目的DNA片段，然后进行连接，并转化DH5 α感受态大肠肝菌， 从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定pAAV-hTERT质粒。b)应用Not I完全消化pAAV-hTERT质粒和pGFP质粒DNA，将目的基因pAAV-hTERT 表达盒和PEGFP真核表达质粒从胶中切取，纯化回收，然后进行连接并转化DH5 α感受态大 肠肝菌，从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并BamHl酶切鉴定，构建成pGFP-hTERT 真核表达质粒。酶切鉴定结果如图3所示，证实目的基因在3kb，与预期结果一致。三、转染pEGFP-hTERT至正常髓核细胞及其表达检测用BI0MIGA质粒提取试剂盒提取pEGFP-hTERT，细胞转染按试剂Lipofect-amine 2000操作说明书进行。转染pEGFP-hTERT至正常髓核细胞24h后，基因绿色荧光蛋白转染 效率见图4。换液后，加G418(250yg/mL)的培养液进行筛选，每2天换液1次。待细胞接 近90%融合状态时按前述方法进行细胞传代，获得的永生化髓核细胞第20代荧光照片如 图5所示。转染时，设置转染空载体pEGFP组作空质粒转染对照组检测表达情况。①以Oligo-dT为逆转录引物，以提取的总RNA为模板，在AMV催化下特异反转录 出cDNA。以hTERT的RT-3和RT-4引物扩增目的基因，设定反应条件，进行PCR反应。产 物在1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭5yg/yL)中电泳，凝胶成像系统下观察照相。如图6 所示，质粒pEGFP-hTERT转染细胞后经过RT-PCR证实目的产物在1. 5kb，引用RT-3和RT-4 一对引物完成，内参在370bp，与预期的一致。②western blot, 10% SDS-PAGE胶上样，电压90V，恒压电泳120min，电泳转移到 0.45um 的 PVDF 膜上；加一抗 hTERT (1 500)，二抗 mouse-HRP (1 3000)，洗膜，用 ECL 试 剂反应显影分析，结果如图7所示。四、正常髓核细胞与永生化髓核细胞的生物学特性检测对比1、XTT测定髓核细胞生长曲线待细胞接近90%融合状态时按前述细胞传代方法制备细胞悬液，计数后以 2 XioVml接种96孔培养板，每孔总液量为200 μ 1，以接种时间记为0d，每24h加5mg/L XTT 溶液20 μ 1。继续培养4h后，轻轻吸去培养液，加入150 μ 1的DMSO液，振荡摇勻lOmin，酶 标仪上波长490nm检测OD值，设置6个复孔，取平均值。以培养时间为横轴，OD值为纵轴 作曲线图。取正常髓核细胞第1代、永生化髓核细胞第20代做7天细胞生长曲线测定，结 果如图8所示，永生化髓核细胞从第4天开始，增殖速率明显高于正常髓核细胞。2、细胞内相关生长因子基因检测荧光定量PCR(SYBR Green)技术检测正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20 代细胞内π型胶原、1型胶原、糖胺多糖、81^-2、16 -136 -3、BMP_4、PDGF、bFGF WmRNA表达水平。检测结果见图9，其中1 表示 Type I collagen2 表示 Type II collagen3 表示 Aggrecan4 表示 PDGF5 表示 IGF-I6 表示 TGF- β7 表示 bFGF8 表示 BMP-29 表示 BMP-4* 代表 ρ < 0. 05，H- β -actin = 1结果显示，细胞内II型胶原、糖胺多糖基因在永生化髓核细胞中表达与正常髓核 细胞第1代类似；IGF-1、TGF-B基因在永生化髓核细胞中表达较正常髓核细胞上调了 2 3倍。3、细胞外液II型胶原、糖胺多糖检测(正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第 20代)(1)细胞外液II型胶原ELISA检测加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液lOOul，余孔分别 加标准品或待测样品IOOul ；37°C盖膜孵育反应120分钟；弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔 加检测溶液IOOul ；37°C盖膜孵育反应60分钟；洗板3次，每次浸泡1 2分钟；每孔加检测 溶液IOOul ；37°C盖膜孵育反应60分钟；洗板5次，每次浸泡1 2分钟；每孔加底物溶液 90ul，37°C避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3 4孔有明显的梯度兰色，后 3 4孔梯度不明显，即可终止)；依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，用酶标仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度(0D值)，检测。结果见表1和图10。(2)细胞外液糖胺多糖含量检测a)显色液(PH3. 0)将 DMMB 16mg,甘氨酸 3. 04g、NaCl 2. 37g 和 0. IM HCl 5. Oml 置于同一容器内，加双蒸水定容至1000ml。以上贮备液均经过滤灭菌，所用容器经50%硝 酸浸泡处理。b) Chondroitin Sulfate A 标准曲线按以下方法配制各浓度Chondroitin Sulfate A 1000ug/ml =IOOmgChondroitin Sulfate A 加双蒸水定容至 100ml，然后依次配制 500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、62. 5ug/ml、31. 25ug/ml>15. 6ug/ml、7. 8ug/ml. >3. 9ug/ml 的 Chondroitin Sulfate A 溶液。A525下测定光密度(OD)，绘制标准曲线。c)糖胺多糖含量测定取IOOul细胞上清，加显色剂2. 5ml，混勻后于15s时放入分光光度计内，A525下 测定光密度值(OD)。根据Chondroitin Sulfate A标准曲线将所测OD值换算为样本糖胺 多糖含量，结果见表1和图11。表1髓核细胞外基质中II型胶原和糖胺多糖表达量(μ g/L)
权利要求
1.一种永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法，其特征在于将外源性人端粒酶反 转录酶转染人髓核细胞激活端粒酶而诱导获得永生化人椎间盘髓核细胞体系。
2.根据权利要求1所述的永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法，其特征在于所 述外源性人端粒酶反转录酶的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
3.根据权利要求1或2所述的永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法，其特征在于 所述外源性人端粒酶反转录酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
4.根据权利要求1或2所述的永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法，其特征在于 所述外源性人端粒酶反转录酶按照以下方法获得从肝癌组织中提取总RNA，Oligo-dT为引物，以总RNA为模板，在禽源性反转录酶作用 下逆转录获得cDNA ；然后进行PCR反应扩增目的基因，经回收纯化获得目的基因PCR产物， 并与载体T-Easy进行连接获得重组体T_hTERT。
5.根据权利要求4所述的永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法，其特征在于所 述PCR反应采用的引物为RT-I :5，-tggaaggagttcgatgccgcgcgctccccgctg-3，RT-2 5' -caccctcgaggtgagacgctcgg-3‘RT-3 :5， -acctcgagggtgaaggcactgttca-3，RT-4 :5，-cgctcgagctagtccaggatggtcttgaagtct-3，并以RT-I和RT-2、RT-3和RT-4引物，分别进行PCR反应。
6.根据权利要求4或5所述的永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法，其特征 在于所述重组体T-hTERT通过构建成pGFP-hTERT真核表达质粒转染人髓核细胞，所述 pGFP-hTERT真核表达质粒的构建方法如下a)所述重组体T-hTERT和载体pAAV-MCS质粒DNA进行连接，并转化DH5a感受态大肠 肝菌，从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定获得的pAAV-hTERT质粒；b)消化连接pAAV-hTERT质粒和pGFP质粒DNA，并转化DH5α感受态大肠肝菌，从含卡 那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定，构建成pGFP-hTERT真核表达质粒。加入Xmnl酶切位点 带Biol酶切位点 带Biol酶切位点 带Xhol酶切位点；
全文摘要
本发明公开了一种永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法。本发明采用外源性人端粒酶反转录酶转染人髓核细胞激活端粒酶诱导构建的永生化人髓核细胞系，为正常细胞而非转化细胞，具有正常生长率、核型，呈现接触抑制和锚着依赖等安全性，不具有致癌性和软琼脂克隆形成能力；同生殖干细胞一样，是真正意义上的永生化，为进一步研究退行性椎间盘病的病变机理提供了标准细胞株，为提高对退变性椎间盘病的整体防治水平提供了新的思路。
文档编号C12N9/00GK102093980SQ201010585718
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者叶冬平, 戴丽冰, 梁伟国, 沈雁, 陈鸿辉 申请人:梁伟国