专利名称：产胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌的筛选方法，尤其是涉及一种运用高温失活处理和超滤处理来观察活性保留的变化情况，用以获得具有胞外蛋白活性的杀藻细菌的方法。
背景技术：
水生生态系统中，微型藻类与细菌的关系越来越引起人们的重视。细菌对藻类的影响主要体现在一方面细菌吸收藻类产生的有机物质，并为藻类的生长提供营养盐和必要的生长因子，从而调节藻类的生长；另一方面，细菌也可以通过直接或间接的作用抑制藻类的生长，甚至裂解藻细胞，从而表现为杀藻效应。Middelboe等在研究富营养化的湖水发生的水华时发现，随着水华的发展，水体中细菌的细胞外分泌物的量增加1倍以上，而细菌胞外酶的活性也有显著增强。这表明细菌可能是通过细胞外分泌物和特殊的胞外酶而杀藻的。Loveioy等在澳大利亚分离到 1株Pseudoalteromonas属细菌，该菌在3h内能导至文赤潮藻Gymnodinium catenatum、 Chattonella marina和Heterosigma akashiwo细胞裂解，进一步研究表明，该菌是通过向海水培养基释放活性物质而起作用。Doucette等分离到1株细菌Cytophaga 41-DBG2能产生一种溶解性杀藻复合物从而有效地杀死G. breve.铜绿假单胞菌可产生大量的抗生素类物质如扩散性吩嗪色素物质，对其它细菌和藻类的生长都有抑制作用。Imai等在日本Hiroshima海湾发现4株Alteromonas属的细菌也可以杀死Chattonella antiqua 从Pseudomonas stutzer中提取出的“甲藻生长抑制剂(Dinoflagellate Growth Inhibitor, DGI) ”活性较高，且毒性较稳定(4°C时3个月保持不变)，并且对鱼类无害，是比较理想的杀藻物质。关于杀藻机理，一股认为它通过作用于生理过程如阻断呼吸链，抑制细胞壁合成，抑制孢子的形成等方面，以达到抑制藻细胞生长或杀灭藻细胞的结果。Lee 等([1]Lee, S. 0. , Kato, J. , Takiguchi, N. , Kuroda, A. , Ikeda, T. ,Mitsutani, A. , Ohtake, H. Involvement of an extracellμ Lar protease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.strain A28[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66 (10) :4334-4339)从 1 株能杀死硅藻(Skeleonema costatum)的Pseudoalteromonas sp. A28的培养液中提取并纯化到一种蛋白酶,该酶具有杀藻活性，进一步研究表明，该酶分子量大约50kDa，其最适pH和温度分别为8. 8和 30°C。袁峻峰等([2]袁峻峰，孟智芳，陈德辉，葛东凌，章宗涉.中性柠檬酸菌对几种常见藻类生长的他感作用[J]·淡水渔业，1999, ) 12-15.)从绿裸藻(Euglena viridis) 水华中分离的优势菌种之一中性柠檬酸菌(CitrcAacter intermedius)的分泌物对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、粉核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、羊角月牙藻(Selenastrum capricormutum)、/K华鱼月星藻(Anabaena flos-aquae)禾口易变鱼月星藻 (Anabaena vqriabilis)的生长有促进作用；对银灰平裂藻(Merismopedia glauca)、莱茵衣藻(Chlamydononas reinhardii)禾口铜绿微囊藻(Microcystis aerugiuosa)的生长具有抑制作用。中性柠檬酸菌的胞外分泌物能促进粉核小球藻细胞个体的生长，对其它藻类主要是景i口向细胞的大小。Kodani 等([3]Kodani, S. ，Imoto, A. ，Mitsutani，A. ，Murakami, Μ.Isolation and identification of the antialgal compound, harmane(1-methyl-b eta-carboline), produced by the algicidal bacterium, Pseudomonas sp. K44-1[J]. Journal of Applied Phycology, 2002,14(2) :109-114)从日本东京 Shinobazu 池塘中分离到12株具有杀藻活性的细菌，9株属于I^seudoalteromonas sp.，其中K44-1的甲醇提取物具有明显的杀藻活性，进一步从中提取到1-甲基-β咔啉，当浓度在30 μ g disc—1时能抑制几种蓝藻的生长。由于细菌和藻类之间这些错综复杂的关系，使人们在研究浮游植物水华和赤潮的发生、发展、衰落与消亡机理时，不能不考虑细菌的重要性，其中细菌杀藻现象更为利用微生物防治赤潮提供了可能的途径。总之，细菌资源丰富且室内培养的便利使人们越来越重视研究其与微藻的关系，试图探索一条控制赤潮爆发的新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供产胞外杀藻蛋白海洋细菌。本发明的另一目的在于提供产胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法。所述产胞外杀藻蛋白海洋细菌为假单孢交替菌DHQ25 (Pseudoalteromonas sp. DHQ25)，假单孢交替菌 DHQ25 (Pseudoalteromonas sp. DHQ25)已于 2010 年 8 月 30 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2010210，中国典型培养物保藏中心的地址为中国武汉武汉大学。所述胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法包括以下步骤1)将从长江口分离获得的13株能够杀灭有毒赤潮藻Alexandrium tamarense的细菌作为出发菌株，培养到稳定期，离心获得培养上清液；2)取步骤1)所得的部分培养上清液孵化后进行杀藻活性检测，得到6株具有杀藻活性的细菌，分别记为 HH2、DHY3、DHY11、DHY20、DHY36、DHQ28 ；在步骤2、中，所述孵化的条件可为在100 110°C下孵化30 40min。3)取步骤1)所得的另一部分培养上清液经超滤，取超滤后的上清液进行杀藻活性检测，得到6株具有杀藻活性的细菌，分别记为HH5、DHY3、DHY28, DHQ5、DHQ19、DHQ25 ；在步骤幻中，所述超滤可采用超滤离心管超滤，所述超滤离心管可选用3kD超滤离心管。4)挑选出具有杀藻活性的细菌DHQ25，即为假单孢交替菌 DHQ25(Pseudoalteromonas sp. DHQ25)。由于DHQ25在高温处理后失去了杀藻活性，而在超滤处理后保留了杀藻活性，超滤液在蛋白质特征反应中呈阳性特性，表明DHQ25是一株能产胞外杀藻活性蛋白的海洋细菌,命名为假单孢交替菌 DHQ25 (Pseudoalteromonas sp. DHQ25)。本发明以一株有毒无菌甲藻——塔玛亚历山大藻(ATCD98-006)为实验对象，以从长江口海域分离到能杀死塔玛亚历山大藻的13株海洋细菌为出发菌株，综合运用双筛选体系，即培养上清液的高温(100°C)灭活处理和超过滤处理(截留膜规格3kD)以观察各菌的杀藻活性变化情况，其中HH5，DHY28, DHQ5和DHQ19在两种处理后都保留了杀藻活性；
4DHY31，DHQ4和DHQ17在两种处理后都失去了杀藻活性；HH2，DHYl 1，DHY20, DHY36和DHQ^ 在高温处理后保留了杀藻活性，而在超滤处理后失去了杀藻活性；DHQ25在100°C高温处理后失去了杀藻活性，而在超滤处理后其杀藻活性仍就保留；DHQ25培养上清的超滤处理液在蛋白质特征反应(茚三酮反应)呈阳性特征；以上实验结论表明DHQ25是一株能产胞外杀藻活性蛋白的细菌菌株。
图1为超滤后的上清液的杀藻活性显微镜图。图2为高温灭活后上清液的杀藻活性显微镜图。 图3为假单孢交替菌DHQ25不同生长阶段与杀藻率关系图。在图3中，横坐标为时间Time (h)，左纵坐标为吸光值OD (640nm)，右纵坐标为杀藻率Algicidal actiyvity(% )； 柱状图为假单孢交替菌DHQ25不同生长阶段的OD值；·表示杀藻率。图4为不同上清液加入量与杀藻率的关系图。在图4中，横坐标为时间Time(h)， 纵坐标为杀藻率Algicidal actiyvity(%) ；▲为加入0. 2mL上清液时的杀藻率，■为加入 20 μ L上清液时的杀藻率， 为加入2 μ L上清液时的杀藻率。图5为潜伏期的塔玛亚历山大藻与杀藻率的关系图。在图5中，横坐标为时间 Time (h)，纵坐标为杀藻率Algicidal actiyvity(%) ；·为加入0. 3mL上清液时的杀藻率， 为加入30 μ L上清液时的杀藻率。图6为对数期的塔玛亚历山大藻与杀藻率的关系图。在图6中，横坐标为时间 Time (h)，纵坐标为杀藻率Algicidal actiyvity(%) ；·为加入0. 3mL上清液时的杀藻率， 为加入30 μ L上清液时的杀藻率。图7为稳定期的塔玛亚历山大藻与杀藻率的关系图。在图7中，横坐标为时间 Time (h)，纵坐标为杀藻率Algicidal actiyvity(%) ；·为加入0. 3mL上清液时的杀藻率， 为加入30 μ L上清液时的杀藻率。
具体实施例方式实施例1胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选1)将从长江口海域海水样品中(包括表层、中层和底层)分离获得的13株能够杀灭有毒赤潮藻Alexandrium tamarense的细菌作为出发菌株，培养14 18h到稳定期， 离心获得培养上清液；采用的培养基0216E)的配方为蛋白胨(Peptone) 5g，酵母提取物 (Yeast Extract) lg，磷酸高铁0. Ig,琼脂粉IOg (固体培养基)，pH7. 6-7. 8，陈海水定容到 1L。2)取步骤1)所得的部分培养上清液孵化后进行杀藻活性检测，得到6株具有杀藻活性的细菌，分别记为HH2、DHY3、DHYl 1、DHY20、DHY36、DHQ^ ；所述孵化的条件为在100 110°C 下孵化 30 40min。进行杀藻活性检测的藻株Alexandrium tamarense (AT)购自暨南大学水生生物研究所，经本申请人无菌藻技术除菌得到的塔玛亚历山大藻无菌株(参见中国专利 CN1887353)。藻类所用培养液为f/2培养液。藻类置于室内三角瓶中培养，温度为20士 1°C， 光照条件为1 !光照，12h黑暗。
3)取步骤1)所得的另一部分培养上清液经超滤，取超滤后的上清液进行杀藻活性检测，得到6株具有杀藻活性的细菌，分别记为HH5、DHY3、DHY^、DHQ5、DHQ19、DHQ25 ；所述超滤采用超滤离心管5000g下超滤离心1.证，所述超滤离心管选用3kD超滤离心管(参见表1)。4)挑选出具有杀藻活性的细菌DHQ25，即为假单孢交替菌 DHQ25(Pseudoalteromonas sp. DHQ25)。DHQ25在超滤处理后保留了杀藻活性(参见图1)，在100°C高温处理后失去了杀藻活性(参见图幻，而超滤液在蛋白质特征反应(茚三酮试剂反应)中呈阳性特性，显示是蛋白/多肽/氨基酸类物质，表明DHQ25是一株能产胞外杀藻活性蛋白的海洋细菌。表 1
菌株上清液100°C处理的上清液超滤处理的上清液(3kD)HH2++HH5++DHY3++DHYll++DHY20++DHY28++DHY31+DHY36++DHQ4+DHQ5++DHQ17+DHQ19++DHQ25++DHQ28++DHQ25培养液杀藻活性的检测如下荧光素双醋酸酯(FDA)配成浓度为5mg/mL的溶液，置于4°C冰箱中避光保存。染色时，取200 μ L样品(不同处理均勻藻细胞培养液)于1.5mL离心管中；加入荧光素双醋酸酯FDA 4 μ L，使其终浓度为100 μ g/mL，室温静置染色5min后，放入冰盒避光待镜检；染色样品混勻后，取20 μ L于藻细胞计数板，用荧光显微镜在蓝光激发光下G95nm)和可见光下分别进行观察计数，发出亮绿色荧光的细胞为活细胞，发出红色荧光的细胞为死细胞，计数活细胞3次，取平均值。根据以下公式计算杀藻效率杀藻率(％) = (Nc-Nt)/NeX 100其中，Nc表示加入2216E对照组的活藻细胞数，Nt表示加无菌滤液对照组或不同处理方式无菌滤液实验组的活藻细胞数。实施例2菌不同培养时期对杀藻效果的影响在细菌培养过程中，每隔池取上清样(0. 4mL加入到40mL藻液)，以0. 4mL灭菌后 2216E培养基为对照分别进行杀藻活性检测。从细菌开始生长到稳定后期(3 )，每隔池取样检测杀藻率，上清液与藻培养液的体积比(1 100)，从图3中看出在潜伏期(0 6h)细菌上清液几乎没有杀藻效果，到 9 15h，杀藻率快速上升，18 21h杀藻效果最为明显，24h后杀藻率有所降低，但此后杀藻率变化不大，基本维持在一个水平上。实施例3上清液加入量对杀藻效果的影响分别取0. 2mL, 20 μ L，2 μ L的上清液加入到30mL培养至稳定期的藻液中，以0. 2mL 灭菌后2216E培养基为对照进行杀藻检测。0. anl，20l·! L，2y L细菌培养上清液加入到30mL藻液，以0. 2mL无菌培养基为空白对照进行杀藻检测。当藻培养到稳定期时，从图4中得出DHQ25在0. 2ml的实验组中表现出杀藻效果，而在20 μ L和2 μ L两个实验组中，杀藻效果不显著，杀藻率比起0. 2ml处理下的杀藻率明显降低。实施例4藻的生长期对杀藻效果的影响取0. 3mL和30 μ L细菌上清液分别加入到45mL不同培养期(延滞期，培养至第6d，藻细胞浓度为3. OX IO3 3. 3X IO3ceIls mL—1 ；指数后期，培养至15d，藻细胞浓度为1.6X104 1.8X IO4Cells mL—1 ；稳定期，培养至第22d，藻细胞浓度为1.8X104 2. OX IO4Cells mL—1)的未无菌化处理的藻液和无菌处理后的藻液中，以0. 3mL灭菌后 2216E培养基为对照进行杀藻检测。在藻的治理过程中引入杀藻剂的最佳时机还不得而知，藻在稳定期时产毒量达到最高，藻的生理也处于旺盛的状态，一股认为杀藻剂这时候能体现出比较好的杀藻效果，则对任何一个时期的藻都有较好的杀藻能力，实际上若能选择藻的一个相对脆弱的生长阶段投入杀藻剂进行杀藻作用，则往往能大大提高杀藻效率。于是本发明给出了不同藻的生长期对杀藻效果的影响。0. 3mL和30 μ L的上清液分别加入到45mL不同生长期的藻培养液， 进行杀藻检测。从图5 7中得知，当藻在潜伏期和稳定期时，0. 3mL上清液表现出良好的杀藻效果。而当藻在对数期时，由于藻细胞数量的剧增，DHQ25上清液的杀藻能力会有一定程度的滞后性，这对于实际的运用有良好的指导作用。
权利要求
1.产胞外杀藻蛋白海洋细菌，其特征在于为假单孢交替菌DHQ25(Pseud0alter0m0nas sp. DHQ25)，假单孢交替菌DHQ25(Pseudoalteromonas sp. DHQ25)已于 2010 年 8 月 30 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2010210。
2.如权利要求1所述的胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤1)将从长江口分离获得的13株能够杀灭有毒赤潮藻Alexandriumtamarense的细菌作为出发菌株，培养到稳定期，离心获得培养上清液；2)取步骤1)所得的部分培养上清液孵化后进行杀藻活性检测，得到6株具有杀藻活性的细菌，分别记为 HH2、DHY3、DHY11、DHY20、DHY36、DHQ28 ；3)取步骤1)所得的另一部分培养上清液经超滤，取超滤后的上清液进行杀藻活性检测，得到6株具有杀藻活性的细菌，分别记为HH5、DHY3、DHY^、DHQ5、DHQ19、DHQ25 ；4)挑选出具有杀藻活性的细菌DHQ25，即为假单孢交替菌DHQ25(Pseudoalteromonas sp. DHQ25)。
3.如权利要求2所述的胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法，其特征在于在步骤2)中， 所述孵化的条件为在100 110°C下孵化30 40min。
4.如权利要求2所述的胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法，其特征在于在步骤3)中， 所述超滤是采用超滤离心管超滤。
5.如权利要求2所述的胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法，其特征在于在步骤3)中， 所述超滤离心管为3kD超滤离心管。
全文摘要
产胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法，涉及一种细菌的筛选方法。产胞外杀藻蛋白海洋细菌为假单孢交替菌DHQ25，DHQ25已保藏于中国典型培养物保藏中心。将从长江口分离获得的13株能够杀灭有毒赤潮藻Alexandrium tamarense的细菌培养到稳定期，离心获得培养上清液；取部分培养上清液孵化后进行杀藻活性检测，得6株具有杀藻活性的细菌HH2、DHY3、DHY11、DHY20、DHY36、DHQ28；取另一部分培养上清液经超滤，取超滤后的上清液进行杀藻活性检测，得6株具有杀藻活性的细菌HH5、DHY3、DHY28、DHQ5、DHQ19、DHQ25；挑选出具有杀藻活性的假单孢交替菌DHQ25。
文档编号C12R1/38GK102168039SQ201010585740
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者王宾香, 郑天凌 申请人:厦门大学