专利名称：玉米愈伤组织特异性启动子及其克隆方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物启动子、其克隆方法及其应用，特别是涉及一种玉米愈伤组织特 异性启动子、其克隆方法及其在培育安全性转基因植物中的应用。
背景技术：
筛选标记基因在植物基因工程中具有重要作用，利用筛选标记基因可以在植物转 基因过程中从大量未转化的细胞中筛选出转化细胞。然而，转基因植物中的筛选基因又引 起了人们对一系列生物安全方面的担心，如选择标记基因是否编码有毒的物质和过敏源， 是否不利于植物代谢的改变，是否会降低治疗性药物的疗效，以及是否会在相近的物种和 病原体间迁移等。如何从转基因植物中剔除筛选标记基因已经成为人们关心的问题。目前， 主要有两种具有潜在的应用价值的剔除筛选标记基因的技术一种是目的基因和筛选标记 基因共转化技术，它可以使目的基因和筛选标记基因通过基因自由分离的原则在后代中剔 除筛选标记基因而保留目的基因；另一种是通过位点特异性重组来剪除筛选标记基因的技 术；此外，还有转座子介导的筛选标记基因剔除技术和同源重组介导的筛选标记基因剔除 技术等。但上述从基因水平上剔除筛选标记基因具有繁琐复杂，转化周期长的缺点。
发明内容
本发明提供了一种在玉米愈伤组织中特异性表达的启动子。本发明所提供的玉 米愈伤组织特异性启动子，名称为ZMW，来源于玉米属玉米(Zea mays L.)。该启动子大小 2880bp。本发明所涉及的设计方案为，一种玉米愈伤组织特异性启动子，通过生物信息学 的方法初步确定，在玉米B73自交系中扩增该启动子，通过在水稻中验证在愈伤中特异性 表达的启动子，具有序列表中<400>1下的序列。一种上述玉米愈伤组织特异性启动子的克隆方法，利用生物信息学筛选候选基 因，然后与基因组序列进行比对分析，设计引物，上游引物5’_ CCG AAG CTT ATG ACA AGA GAA GTT GGA CAA G _3，，下游引物5，- GCG AGA TCT TCA GAT CGA CCT CCT AGC TCT A -3’扩增该基因上游5’区域DNA序列，然后与GUS基因连接，通过转基因水稻验证启动子功 能。根据上述玉米愈伤组织特异性启动子在植物愈伤组织基因功能研究和基因表达 调控中的应用。本发明提供的一个玉米愈伤组织特异性启动子ZMW在水稻的愈伤组织中特异表 达，能指导外源基因在植物发育过程中特定时空的表达，用该方法筛选转基因水稻具有阶 段性强、灵敏度高的优点，而且由于筛选基因只会在愈伤阶段表达，在其他时期不会表达， 它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，而且也避免了植物营 养的不必要浪费，具有较大的实际应用价值。
图1为转基因植株的⑶S染色结果(该启动子特异性的在愈伤组织中呈蓝色)。A为愈伤；B为根；C为叶；D为花粉；E为茎；F为颖壳；G为未成熟的种子；H为成 熟的种子；I为子房。染色结果显示⑶S基因在愈伤中特异性表达，其他部位均不表达，A图中的蓝色部 分即为染上部位。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海捷瑞生物 工程有限公司合成，测序由hvitrogen公司进行，PCR试剂盒、连接试剂盒和载体构建过程 中的核酸内切酶均购自于自宝生物工程有限公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于 全式金生物技术有限公司，方法均参照试剂盒说明书进行。一、玉米愈伤组织特异性表达的基因wrky的获得
首先在NCBI网站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中以关键词“wrky”搜索基因，获 得拟南芥wrky基因的蛋白序列。建立玉米蛋白本地数据库，使用“DNAT00LS 6.0”软件对 获得的拟南芥wrky基因的蛋白序列进行BlaStP(E-value=0. 001)序列比对，筛选出同源性 最高的玉米候选蛋白序列。接着使用“DNAT00LS 6.0”软件对获得的玉米全基因组DNA序 列数据建立本地数据库，以获得的玉米蛋白序列进行BlastN (E-value=0. 001)序列比对， 筛选出同源性最高的候选基因。对转基因植株进行⑶S组织染色，但在拟南芥的愈伤中检测到⑶S的表达，推测 ⑶S可能在水稻的愈伤中表达。二、玉米愈伤组织特异性启动子wrky的克隆
将启动wrky表达的启动子命名为ZMW，根据wrky上游长度为^12bp的核苷酸序列设 计PCR扩增该片段的引物，上游加HindIII (AAGCTT)酶切位点，下游加BglII (AGATCT)酶切 位点
引物序列如下
引物 1(上游引物):5，-CCG AAG CTT ATG ACA AGA GAA GTT GGA CAA G-3， 引物 2 (下游引物)5，-GCG AGA TCT TCA GAT CGA CCT CCT AGC TCT A-3， 提取玉米基因组DNA并以此为模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增，PCR反 应体系为
ddH20 39. 6μ LIOX PCR Buffer 5 μ L ；IOmM dNTP luL；IOuM引物1 luL；IOuM引物2 luL；玉米B73基因组DNA IOpg ；DNA Polymerase(2U/ul):0. 4μ L ；PCR反应条件为预变性94°C 5分钟， 变性94 0C 30秒，
退火55 40秒，34个循环
延伸72 °C 2分钟； 」
最后72 °C, 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化^12bp的目 的片段，将其克隆到载体PMD18-T Vector (宝生物公司)，再转化到Trans5a化学感受态细 胞(全式金生物技术有限公司)中，PCR筛选阳性克隆，进行测序，测序结果表明wrky具有 序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列，序列表中的SEQ ID Ns :1由观12个碱基组成，将含有 ZMW DNA序列的重组质粒载体命名为PMD18-ZMW。三、WRKY基因启动子ZMW表达载体的建立
将用PCR扩增得到并克隆于PMD18-T载体上的wrky片段用Hind III和Bgl II酶切下来， 与用相同酶切PCAMBIA1301的载体连接，构建载体p_ZMW。其载体构建图具体是hpt 潮霉 素抗性基因，在该基因上游有一 nos启动子；wrky 启动子ZMW ；gus :glucoronidase基因， 即GUS报告基因；nos 终止子，在其下游是GUS报告基因。取纯化后1 μ g的过量表达载体质粒DNA加入到200 μ L ΕΗ105感受态细胞中， 混勻；冰浴5分钟后转入液氮中速冻1分钟，接着移至37°C水浴5分钟，加入1 mL YEP液 体培养基，28°C，250 rpm预表达4-5小时；10000 rpm离心30秒，弃上清，加入0. ImL YEP 液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含100 μ g/mL Kan和50 μ g/mL利福平的YEP固体平 板上，培养约48小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于含100 μ g/mL Kan和50 μ g/ mL利福平的YEP液体培养基中，最后提取质粒。先用PCR方法初步鉴定(引物为引物1和 引物2)；接着用Hind III和Bgl II酶切验证。四、农杆菌介导水稻转化
通过农杆菌感受态的方法将含目的基因的ZMW表达载体p-ZMW质粒导入农杆菌菌 株EH105中，经PCR筛选出阳性克隆，然后用共培养法将含有目的基因的农杆菌导入植物受 体材料转化水稻。(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养与继代培养
去壳的水稻成熟种子先用ddH20洗4-5次，再用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用含有 1/1000吐温的20%次氯酸钠浸泡30分钟，期间不停的摇晃，从而进行表面灭菌，之后用无菌 水冲洗3-4次，再将成熟种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在愈伤诱导培养基上，弱 光培养。约10-15天后，将愈伤组织转入继代培养基上，在相同条件下继代培养。每两周继 代培养一次，继代两次后挑选继代培养5-7天，将色泽淡黄的愈伤组织用于共培养。(2)用于转化水稻的农杆菌菌液的准备
将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEP液体培养基(含有100 μ g/mL Kan和50 μ g/ mL利福平)中，28°C振荡培养至OD6tltl=O. 6-1. 0 ；室温下5000 rpm离心5分钟收集菌体，随后 将其悬浮于液体共培养基中，调整菌体浓度至OD6tltl=O. 4，即为共培养转化水稻用的农杆菌 悬浮液。(3)农杆菌侵染水稻愈伤组织挑选状态较好(继代培养5-7天、色泽淡黄)的愈伤组织放入25 mL无菌三角瓶中，加 入适量农杆菌悬浮液以保证有足够的菌液与材料接触，28°C 150 rpm摇床上培养20-30分 钟。之后倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤 纸的固体共培养基上，22°C暗培养2-3天。(4)抑菌处理
用ddH20清洗愈伤3-4次至清洗液清亮，弃去清洗液，用无菌滤纸吸干，转入含有头 孢霉素(500mg/L)和羧苄青霉素(200mg/L)的溶液中振荡灭菌半个小时以上，用无菌滤纸 吸干，转至铺两层无菌滤纸的培养皿中干燥处理M-72小时；将愈伤转移至加有头孢霉素 (500mg/L)和潮霉素(50mg/L)筛选培养基上，28°C光照培养约30天。(5)抗性愈伤组织的分化
从筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的潮霉素抗性愈伤转至含有50mg/L 潮霉素(或20mg/L PPT)的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至30°C全光照条件下 培养，一般经过15-20天左右，有绿点出现。30-40d后进一步分化出小苗。(6)生根、壮苗和移栽
抗性愈伤组织分化出的小苗高度大于3cm时，移到生根培养基上，培养2-3周。选择高 15cm以上、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为 度，晴天需要遮荫到小苗成活(以吐水为准)。待转基因小苗生长健壮后移入田中生长。五、转基因水稻的的鉴定
为了检测转基因水稻，一般以提取的转基因水稻总DNA为模板，用中间载体抗性筛选 基因潮霉素的上游引物和下游引物配对扩增相应基因，初步鉴定转基因植株。用于检测潮霉素抗性基因的引物序列 引物 3 (上游引物)5’ -ACTCACCGCGACGTCTGT-3’ 引物 4 (下游引物)5，-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3’ ；
初步鉴定为转基因植株后，接着对转基因植株进行GUS组织染色。取转基因水稻 的茎、根、叶、花粉、颖壳，愈伤、未成熟的种子、成熟的种子以及子房等待检测的植物组织与 小离心管中，加入⑶S缓冲液浸没组织块，再加入5% (ν/ν)用量的⑶S染色液，混勻后37°C 下保存16-24小时。叶片等绿色材料转入70%乙醇溶液中脱色2-3次，直至阴性对照材料 呈白色。肉眼或显微镜下观察，白色背景下的蓝色小点即为GUS表达载体如图所示(A为愈 伤；B为根；C为叶；D为花粉；E为茎；F为颖壳；G为未成熟的种子；H为成熟的种子；I为子 房)。在转基因植株的正常器官中都没有检测到GUS基因的表达，而只在愈伤中检测到GUS 基因的表达，从而证明wrky仅在水稻愈伤组织中特异性表达。
权利要求
1.一种玉米愈伤组织特异性启动子，其特征在于通过生物信息学的方法初步确定， 在玉米B73自交系中扩增该启动子，通过在水稻中验证在愈伤中特异性表达的启动子，具 有序列表中<400>1下的序列。
2.一种根据权利要求1所述的玉米愈伤组织特异性启动子的克隆方法，其特征在于 利用生物信息学筛选候选基因，然后与基因组序列进行比对分析，设计引物，上游引物5’_ CCG AAG CTT ATG ACA AGA GAA GTT GGA CAA G _3，，下游引物5，_ GCG AGA TCT TCA GAT CGA CCT CCT AGC TCT A _3’扩增该基因上游5’区域DNA序列，然后与⑶S基因连接，通过 转基因水稻验证启动子功能。
3.根据权利要求1所述的玉米愈伤组织特异性启动子在植物愈伤组织基因功能研究 和基因表达调控中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种玉米愈伤组织特异性启动子及其克隆方法与应用。本发明利用生物信息学分析获得一个WRKY基因，通过与基因组进行序列比较，设计引物进行PCR获得该基因5′上有的启动子区域，该启动子长2880bp，具有序列表中1项下的序列，通过对启动子的分析，其含有多个顺式作用元件，把该启动子亚克隆到含GUS基因载体，启动GUS基因表达，把载体转化到水稻中去，对水稻的各个组织进行染色检测，发现该启动子特异性的在愈伤组织中表达，该启动子在基因工程以及基因功能研究中具有重要的应用价值。
文档编号C12N15/113GK102094021SQ20101058704
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者唐秀丽, 朱苏文, 王莹, 程备久, 项艳 申请人:安徽农业大学