专利名称：口蹄疫杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂和试剂盒的制作方法
口蹄疫杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂和试剂盒技术领域
本发明系有关于一种生产抗口蹄疫病毒之单克隆抗体的杂交瘤细胞、其单克隆抗体，及包含此单克隆抗体的免疫检测试剂和试剂盒，特别是关于一种可用于夹心酶连接免疫吸附试验之生产抗口蹄疫病毒非结构蛋白之单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体，以及包含此单克隆抗体的免疫检测试剂和试剂盒。
背景技术：
口蹄疫(FMD ；foot-and-mouth diease)为偶蹄类动物之高度传染性疾病，主要感染的经济动物如牛，猪和绵羊。口蹄疫常以发烧与嘴、舌头、鼻孔、脚和乳头的上皮水泡及腐烂等症状为特征。口蹄疫病毒是一个正股RNA病毒，隶属于Picornaviridae科之 Aphthovirus属，为小的无封套病毒，含有8. 5kbp基因可转译出结构与非结构蛋白(NSPs)。 本病毒含有7种血清型，包括0、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2和SAT 3等分布在全世界，而每个血清型无交叉保护作用，FMDV在各个血清型之间由于具有高的突变速率因此演化的过程也是即为快速，其中于病毒的表面如VPl结构蛋白为主要的中和部位是极具有可塑性 (Plasticity)及高抗原性变异。在1997年，台湾爆发严重的口蹄疫疫情，由血清型0型病毒引起的(命名为0/TAW/97)。此株为非典型的嗜感染猪原型。经试验研究发现该株之非结构蛋白区3A之一段(即93-102)密码子缺损，此片段为决定病毒是否能于试管内牛上皮细胞增殖之主要限制生长因素，故此缺损片段之病毒株证实是造成0/YUN/TAW/97病毒株在牛只体内毒力减弱的原因。在1997年爆发当时，由于控制和贸易限制等而造成国家经济受到严重的影响(估计总值超过60亿美元)。另一病毒株，在金门发现自亚临床感染的动物，病毒基因含有全长的3A非结构蛋白转译区，证实为牛型之强毒株(0/TAW/2/99)。0/ TAW/2/99 口蹄疫病毒为南亚血清0型的地理型(Topotype)，自1999年入侵台湾。当时疾病爆发后，立即采取检疫措施，且在感染牧场中进行筛除，并尽快销毁处置感染的畜体。而预防性筛检疑似感染牧场也同时列入防堵措施。
若以传统不活化病毒生产方法之缺点为(1)由于口蹄疫为高度传染性疾病，藉由空气传染，制备不活化病毒需使用到病毒，不仅实验室必须符合生物安全等级之三级负压实验室，而且实验过程中病毒有可能发生再活化，危险性高。( 不活化病毒无法产生寄主于活体感染状态下自然产生的非结构蛋白，因此检测效能欠佳。发明内容
本案系利用大肠杆菌细胞(E.coli.)来表达口蹄疫病毒之非结构蛋白 (Non-Structural Protein, NSP)，利用亲代细胞与骨髓瘤细胞融合而制成杂交瘤细胞株。 将0/TWA/99病毒株之3ABC基因应用pRSET、pET 32、pET43及pBlueBacHis2等载体系统进行克隆，再应用大肠杆菌及杆状病毒进行蛋白质之表达，以纯化后之NSP作为抗原进行酶结合免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ；ELISA)。特征在于能够专一性辨识动物感染口蹄疫病毒后所产生的NSP抗体，本案所保护之技术标的，包含针对FMDV5NSP的杂交瘤细胞株及其单克隆抗体，以及包含有该单克隆抗体之Sandwich ELISA检测试剂或其试剂盒等。
而本案因应安全性及有效性考虑，不使用病毒而系利用分子生物学技术，以非结构重组蛋白的抗原决定位开发杂交瘤来生产单克隆抗体，此法不需用到病毒，可在二级实验室进行，安全性高，而且该方法可以检测NSP抗体，以正确分辨出活体感染口蹄疫病毒之个体。且经实验发现，其敏感性及特异性皆高于95%以上，显示本案发明对于感染口蹄疫病毒之检体有专一性，并可区别自然感染及疫苗免疫动物产生之抗体。
本发明系提供一种杂交瘤细胞，系由亲代细胞与骨髓瘤细胞融合而制成，其特征如保藏号为PTA-11304之细胞株所示，亲代细胞系由原核细胞所表达之口蹄疫病毒之由 3ABC基因片段所编码之NSP作为抗原免疫至小鼠，并将小鼠体内之脾脏细胞取出而制成， 且杂交瘤细胞株所生产之单克隆抗体能够专一性辨识口蹄疫病毒之3ABC肽片段，且不会与猪水疱病(Swine vesicular disease ；SVD)抗血清产生非特异性反应。
因此，本发明之主要目的为提供一种杂交瘤细胞株，由于其所生产之单克隆抗体对口蹄疫病毒之NSP具有专一性辨识能力，且不会与其它水疱性疾病抗体产生交叉反应， 故可用于发展免疫快速检测试剂之用途。
此外，本发明亦提供一种单克隆抗体，其特征在于其系由保藏号PTA-11304所产生，且可专一性辨识口蹄疫病毒之NSP 3ABC肽片段，且对于猪水疱病抗体无交叉反应。
因此，本发明之主要目的为提供一种单克隆抗体，由于其对口蹄疫病毒之NSP具有专一性辨识能力，且不会与其它水疱性疾病抗体产生交叉反应，故可用于发展免疫快速检测试剂之用途。
又，本发明尚提供一种包含有上述单克隆抗体的免疫检测试剂、免疫检测试剂盒， 以及利用上述抗体之免疫检测方法，由于所使用的单克隆抗体对口蹄疫病毒之3ABC肽具有专一性辨识能力，且不会与其它水疱性疾病抗体产生交叉反应，故可用于发展免疫快速检测试剂之用途。
图1为Sandwich ELISA方法之解析图。
符号说明
固相载体10
单克隆抗体11
样本抗原12
待测检体13
侦测抗体14
讯号产生物质15
受质1具体实施方式
由于本发明系揭露一种杂交瘤细胞株、其单克隆抗体、利用前述单克隆抗体所制作之免疫检测试剂及试剂盒，其中所利用之免疫学原理、细胞培养、染色及蛋白质侦测等相关技术，已为相关技术领域具有通常知识者所能明了，故以下文中之说明，不再作完整描述。同时，以下文中所对照之图式，系表达与本发明特征有关之示意，并未亦不需要依据实际情形完整绘制，合先叙明。
本发明第一实施例系提供一种杂交瘤细胞株，可生产抗口蹄疫病毒之单克隆抗体，其流程如第1图所示，系以Sp2/0骨髓瘤细胞株与自BALB/c小鼠取得之亲代细胞进行制备，此杂交瘤细胞株之保藏号为PTA-11304，且其所生产之单克隆抗体可专一性辨识口蹄疫0/TAW/99病毒株之NSP。
本发明所提供之保藏号PTA-11304所示之杂交瘤细胞株，其亲代细胞系依下列步骤所制备而得
步骤一首先，设计适当引物，利用反转录-聚合酶连锁反应(RT-PCR)，针对口蹄疫0/TAW/99病毒株之NSP 3ABC基因进行扩增。其中，扩增之目标基因片段又以3ABC基因片段中的高度保守区域(Highly conserved region)为佳，其核酸序列如SEQ ID N0:1所示，而其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
步骤二 将步骤中藉由反转录-聚合酶连锁反应所得之3ABC基因片段构建至pET 载体。完成序列确认后，利用限制酶切割，将所得之目标基因片段再构建至PTH 162-B载体，将构建完成后的PTH质粒转到(trangene)原核细胞中，并使其表达pTH 162-B中3ABC 基因片段所编码的重组蛋白。此步骤所使用的原核细胞以大肠杆菌为佳。
步骤三将步骤二中利用原核细胞所表达而得的重组蛋白进行纯化后当作免疫抗原，对BALB/c小鼠重复进行注射，使其产生针对3ABC重组蛋白的免疫反应。再将免疫后的 BALB/c小鼠脾脏细胞取出，作为制备可生产抗口蹄疫病毒NSP单克隆抗体的杂交瘤细胞株之亲代细胞。
将上述步骤所制备而得的亲代细胞与骨髓瘤细胞株进行融合而得到杂交瘤细胞。 利用间接酶结合免疫吸附试验(Indirect ELISA)及^festern印迹法(Western blotting) 筛选出其培养之上清液对于0/TAW/99病毒株之3ABC重组蛋白具有特异性反应的杂交瘤细胞株。
经由上述步骤筛选后所得之杂交瘤细胞株，其生产出的单克隆抗体对于口蹄疫0/ TAW/99病毒株之NSP具有专一性辨识能力，前述之NSP包含有3ABC基因片段的高度保守区域所编码之肽片段。
本发明之第二较佳实施例为单克隆抗体，具有保藏于美国典型培养物保藏 Φ ( ATCC , Patent Deposit Designation, jft tit =Manassas, VA, USA) 1 Ii ^ ^ PTA-11304(保藏日期2010年9月14日)之杂交瘤细胞株所生产的单克隆抗体之特征。由保藏号PTA-11304之杂交瘤细胞株所生产的单克隆抗体，对于口蹄疫病毒中属于血清型0 型的0/TAW/99病毒株的NSP具有专一性辨识能力，特别是对于NSP中3ABC基因中高度保守区域所编码之肽片段具有专一性辨识能力，且对于猪水疱病(SVD)抗体无交叉反应。
此外，由于制备本较佳实施例单克隆抗体之抗原系衍生自口蹄疫病毒0/TAW/99 病毒株中NSP之3ABC基因片段高度保守区域所编码的重组蛋白，因此，经由后续实验结果可得知，本较佳实施例所提供之单克隆抗体，亦可辨识属于血清型如A型、C型、Asia 1型、 SAT 1型、SAT 2型及SAT 3型等的口蹄疫病毒。
又，为了得到高浓度及高纯度的单克隆抗体，除了藉由活体外(In vitro)细胞培CN 102533663 A养技术以大量培养第一较佳实施例所提供的杂交瘤细胞株并收集其培养上清液之外，亦可将第一较佳实施例所提供的杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔内，收集所产生的腹水。无论藉由活体外细胞培养所收集而之上清液，或是自小鼠体内收集而得的腹水，均可藉由适当之纯化过程(例如利用proteinA管柱层析法)，纯化出本较佳实施例之单克隆抗体。
本发明之第三较佳实施例系为一种免疫检测试剂，用于酶结合免疫吸附试验 (ELISA)中，藉以检测待测抗体，其中包含有如第二较佳实施例中所描述的单克隆抗体。由于本较佳实施例之免疫检测试剂中所含有的单克隆抗体系以小鼠脾脏细胞作为亲代细胞而制得，属于小鼠品系之IgG免疫球蛋白，故可配合其他适当的试剂，藉由Sandwich ELISA 以侦测待测之猪只检体中是否含有抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗体。
本发明之第四较佳实施例为一种免疫检测试剂盒，藉由Sandwich ELISA以检测猪只检体中是否带有抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗体。本较佳实施例之免疫检测试剂盒，包含有
(1)单克隆抗体，其特征如同第二较佳实施例所提供之单克隆抗体，对于口蹄疫 0/TAW/99病毒株NSP中3ABC基因片段所编码之肽片段具有专一性辨识能力。此外，单克隆抗体11系以适当浓度涂布于固相载体上。固相载体可以是微孔盘、微球体、杂交膜、或是试纸。
(2)侦测试剂，包含有侦测抗体及讯号产生物质，侦测抗体可直接与讯号产生物质共轭结合。前述的讯号产生物质可以是放射性标记物、磷光标记物、冷光标记物(化学冷光标记物或生物冷光标记物)、荧光标记物，或是酶；适合本较佳实施例的酶可以是过氧化氧酶(Hydrogen peroxidase)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、碱性磷酸 Sl (Alkaline phospatase ；AP)、以及 beta—半乳糖昔醇(Beta—galactosidase)。而在讯号产生物质是酶的状况下，侦测抗体是与生物素(Biotin)共轭结合，另外讯号侦测物质则以酶形式与抗生物素蛋白连接。
(3)样本抗原，系衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株之NSP中3ABC基因高度保守区域所编码之重组蛋白。
此外，本较佳实施例所提供之免疫检测试剂盒，可进一步包含有受质，受质可与酶反应而发生呈色反应。受质的种类与试剂盒中所选用的酶系统有关，例如酶为 HRP 时，受质以 ABTS(2，2 ‘ -azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6_sulfonate)) 为佳；而当酶为AP时，选用的受质则以溶解于DEA (Diethanolamine)缓冲溶液中的 PNPP(Para-nitrophenylphosphate)为{圭。
又，本较佳实施例之免疫检测试剂盒亦可进一步包含有冲洗试剂(Wash reagent)，冲洗未附着于固相载体的单克隆抗体，或是将未与单克隆抗体产生专一性结合的样本抗原、待测样本之杂质、侦测抗体及讯号产生物质冲洗出来，避免上述物质残留而造成检测结果之误差甚至是伪阳性结果的发生。冲洗试剂的组成则可为磷酸盐缓冲溶液 (PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(TBS)、Tween 20，或是上述溶液的任意组合。
本较佳实施例之免疫检测试剂盒亦可进一步包含有阻隔试剂(Blocking reagent)，将固相载体中未结合单克隆抗体之位置加以阻隔，以避免后续添加之样本抗原、 待测样本、侦测抗体及讯号产生物质附着所造成的伪阳性讯号。阻隔试剂则以包含有蛋白质为佳，蛋白质可以是牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)、动物明胶(Gelatin)，或是前述蛋白质的任意组合。此外，亦可直接使用脱脂牛乳做为本较佳实施例之阻隔试剂。
本发明亦提供一种免疫检测方法，如下述第四较佳实施例所示，系利用ELISA来检测待测抗体。请参阅第1图，为本实施例所利用之Sandwich ELISA方法之解析图。免疫检测方法包含有下列步骤
步骤一提供固相载体10。
步骤二 提供单克隆抗体11，具有如第二较佳实施例所提供之单克隆抗体的特征，为保藏于美国ATCC Intent Deposit Designation保藏号为PTA-11304之杂交瘤细胞株所生产，且对于口蹄疫病毒中属于血清型0型的0/TAW/99病毒株的NSP具有专一性辨识能力，特别是对于NSP中3ABC基因中高度保守区域所编码之肽片段具有专一性辨识能力。
步骤三将步骤二所提供单克隆抗体11施加(Applying)至固相载体10上。
步骤四提供样本抗原12，样本抗原12系与步骤二所提供之单克隆抗体11进行专一性结合。样本抗原12则以衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株的NSP为佳，又以衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株的3ABC基因之重组蛋白为更佳。
步骤五提供待测检体13。将待测检体13施加于固相载体10上，且待测检体13 可操作性地与步骤四所提供的样本抗原12进行免疫反应，藉以于固相载体10上与单克隆抗体11及样本抗原12共同形成免疫复合物。
步骤六提供侦测试剂，侦测试剂可操作性地与于步骤五中所形成的免疫复合物进行免疫反应，藉以产生讯号。
步骤七侦测由步骤6中所产生的讯号。
此外，本较佳实施例中，步骤六所提供的侦测试剂，可进一步包含有侦测抗体14 与讯号产生物质15 ；侦测抗体14与讯号产生物质15之特征、相互连结关系，以及选用种类与第四较佳实施例中所述大致相同，在此不再赘述。
本较佳实施例亦可进一步包含提供冲洗试剂之步骤，将步骤三中未附着于固相载体10上的单克隆抗体11，或是将步骤四中未与单克隆抗体11产生专一性结合的样本抗原 12、步骤六中待测检体13所带有之杂质，步骤六中未与形成于步骤五中的免疫复合物进行免疫反应的侦测抗体14及讯号产生物质15冲洗出来，避免上述物质残留而造成检测结果之误差甚至是伪阳性结果的发生。而冲洗试剂可为PBS、TBS、Tween 20，或是上述溶液的任思组合。
此外，若是步骤六所提供的侦测试剂包含有以酶作为其讯号产生物质15，则需要另外加入与所提供酶产生免疫反应的受质16。例如当使用HRP需使用ABTS作为其受质， 而当使用AP时，其受质则以溶于DEA溶剂的PNPP为佳；此外，依据步骤六所使用的酶与受质的种类，需要有不同的侦测方法来侦测这些由不同系统所产生的讯号。例如当使用 HRP作为酶及ABTS作为受质的呈色系统时，检测结果系利用各待测样本在波长为450nm或 460nm下的吸收光谱加以判定；而当使用AP作为酶及PNPP及DEA作为受质的呈色系统时， 检测结果则利用各待测样本在波长为430nm下的吸收光谱加以判定。
本较佳实施例亦可进一步包含提供阻隔试剂之步骤，此步骤之目的在于将固相载体在步骤三之后未结合单克隆抗体之位置加以阻隔，以避免后续于步骤四、五及六中添加之样本抗原、待测检体、侦测抗体及讯号产生物质直接附着于固相载体上所造成的伪阳性讯号。阻隔试剂则以包含有蛋白质为佳，蛋白质可以是BSA、酪蛋白、动物明胶，或是前述蛋白质的任意组合。此外，亦可直接使用脱脂牛乳作为本较佳实施例所提供的阻隔试剂。
本发明另提供下列实验例作为本发明之进一步说明，但并非作为本发明之限制。
实验例1 材料与方法
1. 1 血清
为测试检测之灵敏度，自年龄为8周的猪只且经过口蹄疫病毒0/TAW/97病毒株试验攻毒感染后34天的猪只采集32个口蹄疫阳性(FMD-positive)猪只血清样本。
为比较本发明所提供之夹心ELISA检测试剂盒与其他三种商售之ELISA检测试剂盒，系自32头不带特定致病原(Specific-pathogen-free ；SPF)且经实验性感染口蹄疫病毒0/TAW/97病毒株的猪只采集其血清样本，共计320个。前述320个血清样本的采集时间点为感染病毒后第0、2、4、6、8、10、14、21、28，以及第34天。此外，30个血清样本采集自以口蹄疫0/TAW/97病毒株进行实验性感染后观天的猪只亦并同测试。
为测试专一性，自未感染之猪只采集255个血清样本，以及自施打过疫苗的猪只中采集了 165个血清样本。自未感染之猪只所采集到的255个血清样本其中有96个系自 SPF猪只体内采集而得，其余159个则采集自1997年口蹄疫疫情爆发前未感染之猪只。自施打过疫苗的猪只中所采集到的165个血清样本，系自165未经感染且施打过2次市售0 血清型口蹄疫病毒疫苗的猪只体内所采集而得。
此外，为评估本发明所提供的Sandwich ELISA检测试剂盒对猪水疱病毒(Swine vesicular disease virus ；SVDV)可能发生的交叉反应(Cross-reactivity)，以及为了要证实本发明所提供的Sandwich ELISA检测试剂盒对不同血清型口蹄疫病毒之间的交叉反应，使用 6 个抗 SVDV 的抗血清(Antiserum) (UKG/27/72strain EU SVD reference serum batch 2002)以及6个牛只的抗不同血清型(血清型A、C、Asia USAT USAT 2、SAT3) 口蹄疫病毒的抗血清系来自英国动物卫生研究所(Institute for Animal Health,Pirbright, United Kingdom)产制。
恢复期中的猪只血清是由实验性感染0/TAW/97及0/TAW/99病毒株的猪只，在感染观天后分别取得，其血清中和抗体效价(SN titer)分别为1 256与1 512，作为 Wfestern印迹法(Western blotting)及Sandwich ELISA中所使用的阳性对照组，另阴性对照组系为SPF猪只血清。
1. 2 反转录-聚合酶连锁反应(RT-PCR)引物设计
一引物对(Primer pair)系设计用来自口蹄疫病毒0/TAW/99病毒株基因体扩增其3ABC基因区域的核酸片段(GenBank accession No. AJ539137之第5595号至第6119号核苷酸区域，其详细序列如SEQ ID NO :1所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示)。其正向引物(Forward primer)其序列为5 ‘ -CACCGGATCCTGTCGCGAGACTCGCAAGAGACAGCAG-3 ‘， 其中包含有BamHI限制酶之酶切位点；而其反向引物(Reverse-primer)之序列为5' -CC CGAATTCGCACGTCTTCCCGTCGAGGATGAGCTC-3 ‘，其中包含有 EcoRI 限制酶之酶切位点。
1. 3 反转录-聚合酶连锁反应(RT-PCR)
反转录-聚合酶连锁反应混合物系利用Superscript One-Step RT-PCRSystem 以及Platinum Pfx DNA Polymerase 制备而得，而反应系利用 GeneAmp PCR system MOOthermocycler热循环机中进行；而反应进行温度及时程如下首先将反应样本培育于7/13 页420C中40分钟，接着再于90 95°C中进行50秒的预加热变性(Pre-denaturation)，接着再重复进行30 40次的下列热循环于90 95°C中加热变性(Denaturation) 30秒，于 50 55°C中退火(Annealing) 30秒，于68 72°C中延伸(Extension) —分钟。最后再于 72°C中延伸七分钟，并设定将样本保持于4°C。经上述反转录-聚合酶连锁反应所得之产物系保存于-20°C中，直至后续实验所需。其中10微升(yL)的反转录-聚合酶连锁反应产物系经由2%的琼脂电泳分析，并且利用STORSafe DNA gel stain染剂，于一倍的TAE缓冲溶液中染色，并于UV光中进行显色。
1. 4 口蹄疫病毒3ABC基因之克隆(Cloning)
首先，利用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit实验试剂盒将琼脂凝胶中的产物纯化取出，再利用适当的限制酶(BamHl与EcoRl)进行处理后，与pET vector进行粘接，以制得一完整之表达载体。将前述表达载体导入BL21(DE!3)感受态细胞，并培养于添加 100微克/毫升(μ g/mL)氨苄西林(Ampicillin)的Luria-Bertani琼脂培养皿中。将生长出的阳性菌落挑选出来，并利用Miniprep Kit试验试剂盒萃取各菌落的质粒，且筛选出带有3ABC基因片段的质粒样本。最后，将筛选出的样本进行DNA测序，以确认该质粒样本所带有的3ABC基因片段之核酸序列。
1. 5 口蹄疫病毒3ABC多肽于大肠杆菌中之表达与纯化
将大肠杆菌以所制得的pTH 162-B质粒进行转化，于添加100微克/毫升 (μ g/mL) Ampici 11 in的Luria-Bertani培养液在37 V中剧烈摇晃进行培养。当培养至中对数期(Mid-logarithmic phase)时，于培养液中添加异丙基硫代半乳糖苷 (Isopropylthiogalactoside ；IPTG)，使其最终浓度为一毫摩尔浓度(mM)，并将培养液继续培育4小时，以诱导3ABC多肽之表达。接着利用离心方式收集将大肠杆菌菌体，并加入细菌蛋白萃取试剂或超声波震荡法将菌体裂解。在裂解物中的可溶性的3ABC多肽系利用 His-Tag亲和性层析管柱(Affinity chromatography column)加以纯化，最后定量纯化所得之产物。
1. 6 =SDS胶体电泳与Western印迹分析
经上述实验例1. 5纯化所得之3ABC多肽，系经由12% SDS胶体电泳加以分析； 经过12% SDS胶体电泳之后，再将蛋白质转印于PVDF硝化纤维滤纸之上，利用Western印迹法分析其对于强阳性猪只血清之血清反应性。Western印迹法之步骤系使用的第一抗体为适当稀释之阳性猪只血清，而第二抗体为适当稀释之带有碱性磷酸酶的山羊抗猪(Goat anti-swine) IgG 抗体。最后利用 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)与氮蓝四唑(Nitro blue tetrazolium)作为碱性磷酸酶之受质及呈色物质。
1. 7 病毒中和测试
为确认用来作为阳性血清组经实验性感染猪只的感染情形，感染病毒株的猪只，其血清收集后均依照国际动物卫生组织(Office International Des Epizooties ； OIE)-陆生动物诊断试验及疫苗手册(Manual ofDiagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals)之方法进行病毒中和测试。
1. 8 小鼠免疫与抗3ABC单克隆抗体之制备
生产抗3ABC重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株系经由下列方法制备以皮下注射的方式将200微克经由实验例1. 5所制备而得的3ABC重组蛋白作为抗原来免疫BALB/11c小鼠，免疫间隔为4周。在进行细胞融合之前的3至4天，再将同量的抗原放入磷酸盐缓冲溶液(Phosphate-buffered saline)中以皮下注射方式对小鼠进行补强注射(Boost)。 将免疫后之BALB/c小鼠牺牲后取出其脾脏，并将取得之脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合以制得杂交瘤细胞。经过两周后，利用含有口蹄疫病毒0/TAW/97或0/TAW/99重组蛋白的间接酶联免疫吸附试验(Indirect ELISA)，针对杂交瘤细胞的培养上清液进行筛选；此外，亦利用Western印迹法针对杂交瘤细胞的培养上清液进行筛选，其方法与实验例 1. 6中所述相同。经间接酶联免疫吸附试验分析后，将测试结果阳性/阴性比例(Positive/ negative (P/N)ratio)大于2的杂交瘤细胞株挑选出进行放大培养。经判定为会生产抗 3ABC抗体之杂交瘤细胞株，将其注射入BALB/c小鼠腹腔，收及其产生之腹水。最后利用 Affi-Gel protein A管柱层析法自收集之腹水中纯化出抗体，而纯化所得之抗体浓度最高可至10毫克/毫升(mg/mL)。
1. 9 夹心酶联免疫吸附试验(Sandwich ELISA)
针对口蹄疫病毒株血清型0型的Sandwich ELISA(如图一所示)系建立来对口蹄疫NSP之抗血清进行定量。一般来说，系先在微孔盘(Nunc Maxisorb)上涂布单克隆抗体，并以酸碱值9. 6且0.06摩尔浓度(M)的碳酸/碳酸氢盐缓冲溶液作为涂布缓冲液，涂布后培育于4°C下直至隔夜；单克隆抗体并依棋盘式滴定方式涂布于微孔盘，以决定单克隆抗体(CmA40)对口蹄疫病毒0型NSP之最佳浓度。涂布完成后，将以稀释液进行最佳稀释之口蹄疫病毒0型非结构重组蛋白加入微孔盘中，在37°C中培育一小时。之后，将以阻隔缓冲液适当稀释后的猪只血清取100微升加入微孔盘中，在37°C中培育一小时。将连接有HRP的山羊抗猪IgG抗体(HRP conjugated-goat anti-swine IgG)以阻隔缓冲液稀释后，在微孔盘中各反应孔中加入100微升。之后，使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(3，3，，5， 5，-tetramethylbenzidine ；TMB)作为受质，并在室温中反应呈色10至15分钟。最后，在各反应孔中加入50微升，1. 0摩尔浓度的硫酸以停止呈色反应，测量各反应孔中波长450nm 的OD值。上述各步骤中有在37°C中培育一小时者，之后再以清洗液清洗6次。
1. 10 侦测抗口蹄疫病毒NSP抗体的ELISA试剂盒之比较
本发明亦比较三种市售酶联免疫吸附试验试剂盒与本发明所提供之免疫检测试剂盒，对于抗口蹄疫病毒NSP之抗体侦测能力的差异。Ceditest FMDV-NS检测试剂盒 (Cedi-Diagnostics B. V. , Lelystad,Netherlands)为阻隔型(Blocking)酶连接免疫吸附试验试剂盒，UBI FMD NS EIA检测试剂盒(United Biomedical Inc. , Hauppauge,New York, USA)系为利用人工合成之3B肽的间接酶联免疫吸附试验试剂盒，CHEKIT FMD-3ABC检测试剂盒(IDEXX Laboratories Inc. , ffestbrook, Maine, USA)系为利用大肠杆菌表达 3ABC 多肽的间接酶联免疫吸附试验试剂盒。上述检测试剂盒之使用系依照各试剂盒制造商之使用说明。
实验例2 大肠杆菌表达3ABC重组蛋白
口蹄疫病毒0/TAW/993ABC基因序列系取自美国国家生技资讯中心(NCBI) GenBank 资料库中，GenBank accession No. AJ539137，第 5595 号至第 6119 号核苷酸区域，其详细序列如SEQ ID NO :1所示，其中包含有525个核苷酸长度的编码区域(Coding region)，故其编码之重组蛋白为175个氨基酸长(序列如SEQ ID NO 2所示)。比较近来自亚洲、非洲与欧洲所分离出的泛亚洲(Pan-Asia) 口蹄疫病毒株血清型0型的基因组序列，其基因一致性约在97%至99%。
将上述经由反转录-聚合酶连锁反应所扩增而得之DNA片段，插入pETvector表达载体。将前述表达载体导入大肠杆菌BL21DE3株系感受态细胞，并培养于添加100微克 /毫升Ampicillin的Luria-Bertani琼脂培养皿中，挑选出阳性菌落，并萃取出带有3ABC 基因插入片段的质粒。
将带有3ABC基因插入片段的质粒送入大肠杆菌BL21DE3菌株进行转化，并于添加 100微克/毫升Ampicillin的Luria-Bertani培养液在37°C中剧烈摇晃进行培养。当培养至中对数期时，于培养液中添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度为一毫摩尔浓度，并将培养液继续培育4小时，以诱导3ABC重组蛋白之表达。表达出的3ABC重组蛋白系利用亲合性层析管柱加以纯化，纯化所得之3ABC重组蛋白经由12% SDS胶体电泳及Western印迹法加以分析。Western印迹分析之结果显示，经由上述方法表达之蛋白其大小为40kDa， 且证实会与抗口蹄疫病毒之抗血清产生反应(结果未示)。经定量后，纯化所得之3ABC之重组蛋白浓度约为11. 2毫克/毫升。
实验例3 小鼠免疫与抗3ABC单克隆抗体之制备
生产抗3ABC重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株系经由下列方法制备以皮下注射的方式将200微克经由实验例1. 5所制备而得的3ABC重组蛋白作为抗原来免疫BALB/ c小鼠，免疫间隔为4周。在进行细胞融合之前的3至4天，再将同量的抗原放入磷酸盐缓冲溶液中以皮下注射方式对小鼠进行补强注射。将免疫后之BALB/c小鼠牺牲后取出其脾脏，并将取得之脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合以制得杂交瘤细胞。经过两周后，利用含有口蹄疫病毒0/TAW/97或0/TAW/99重组蛋白的间接酶结合免疫吸附试验，针对杂交瘤细胞的培养上清液进行筛选；此外，亦利用Western印迹法针对杂交瘤细胞的培养上清液进行筛选，其步骤方法与实验例2中所述相同。经间接酶联免疫吸附试验分析后，将测试结果阳性/阴性比值(Positive/negative (P/N) ratio)大于2的杂交瘤细胞株挑选出进行放大培养。经判定为会生产抗3ABC抗体之杂交瘤细胞株，将其注射入BALB/c小鼠腹腔，收及其产生之腹水。最后利用Affi-Gel protein A(Millipore)管柱层析法自收集之腹水中纯化出抗体，而纯化所得之抗体浓度最高可至10毫克/毫升。
实验例4 =Sandwich ELISA 之判读
为确保各测试间品质控制血清测试结果的稳定，各Sandwich ELISA的96孔测试盘中无论阳性血清与阴性血清均做二重复。经统计18个测试之结果，阳性血清测试结果为 0. 90士0. 09，变异系数指标为9. 78%;阴性血清之测试结果为0. 09士0. 02，变异系数指标为 24.33%。共有770个测试血清OD45tlnm之测试结果皆以标准化呈现。阴性猪只血清共计观7 个，其中包含有255件样本由未感染之猪只所采集，而有32件样本由感染后第0天之猪只所采集；前述观7件阴性血清样本与62头实验性感染的猪只共同用来决定本发明所提供之 Sandwich ELISA 结果的决定值(Cut-off value)。
本发明所提供之免疫检测试剂盒的专一性确定测试系测试了 96头SPF猪只体内采集之血清。所有测试样本的OD45tlnm读值最大频度分布均小于0. 15，其中部份测试样本的 OD450nm读值最大频度分布高于0. 06至0. 11。此外，自经疫苗接种免疫之猪只所采集而得之血清样本，其测试结果的OD45tlnm读值均小于0. 22。因此，决定值系定于OD45tlnm读值为0. 22。 亦即，当待测样本测试结果的OD45tlnm读值小于0. 22时，则该测试结果判定为为阴性；而当待测样本测试结果的OD45tlnm读值大于或等于0. 22时，则该测试结果判定为阳性。测试结果如表一所示。
表一
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株，系由亲代细胞与骨髓瘤细胞融合而制成，其特征如保藏号为 PTA-11304之细胞株所示，该亲代细胞系由原核细胞所表达之口蹄疫病毒之由3ABC基因片段所编码之非结构蛋白作为抗原免疫至小鼠，并将该小鼠体内之脾脏细胞取出而制成，且该杂交瘤细胞株所生产之单克隆抗体能够专一性辨识口蹄疫病毒之该3ABC肽，且对于猪水疱病抗血清不会产生非特异性反应。
2.根据权利要求1所述之杂交瘤细胞株，系制备自口蹄疫病毒0/TAW/99病毒株，其分泌的单克隆抗体同时对0/TAW/97病毒株会产生专一性的结合。
3.根据权利要求2所述之杂交瘤细胞株，该非结构蛋白系衍生自该口蹄疫病毒2C、3A、 3AB、;3BC 及 3ABC 基因片段之一高度保守区域(highly conserved region)。
4.根据权利要求3所述之杂交瘤细胞株，该非结构蛋白3ABC基因片段之该高度保守区域具有如SEQ ID NO :1之核酸与氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述之杂交瘤细胞株，该小鼠系为Balb/c品系小鼠。
6.根据权利要求1所述之杂交瘤细胞株，该原核细胞系为大肠杆菌。
7.根据权利要求1所述之杂交瘤细胞株，该单克隆抗体同时对于0型以外的口蹄疫病毒如血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型及SAT 3型等皆有专一性反应。
8.一种单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体系由权利要求1至7中任一项所述之杂交瘤细胞株所产生，且对于口蹄疫病毒之3ABC肽具有专一性辨识能力，而对于猪水疱病之抗血清不会产生非特异性反应。
9.根据权利要求8所述之单克隆抗体，其特征在于该口蹄疫病毒系为血清型0型(0 serotype)。
10.根据权利要求9所述之单克隆抗体，其特征在于该口蹄疫病毒系为0/TWA/99病毒株。
11.根据权利要求8所述之单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体对于口蹄疫病毒血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型或SAT 3型有交叉反应，即可辨识口蹄疫七种血清型。
12.一种免疫检测试剂，系用于酶联免疫吸附试验(ELISA)，藉以检测一待测抗原，其特征在于该免疫检测试剂包含有权利要求9所述之单克隆抗体。
13.如权利要求12所述之免疫检测试剂，该待测抗原系为抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗 # (anti-3ABC antibody)。
14.一种免疫检测试剂盒，系利用夹心酶联免疫吸附试验检测待测检体中的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗体(anti-3ABC antibody)，其特征在于该免疫检测试剂盒包含有如权利要求8所述之单克隆抗体及侦测试剂。
15.如权利要求14所述之免疫检测试剂盒，进一步包含有抗原样本，该抗原样本系衍生自口蹄疫病毒之3ABC肽。
16.如权利要求14所述之免疫检测试剂盒，该侦测试剂包含有侦测抗体及讯号产生物质。
17.如权利要求16所述之免疫检测试剂盒，该侦测抗体与该讯号产生物质系为共轭结I=I O
18.如权利要求16所述之免疫检测试剂盒，该讯号产生物质系选自下列所构成的群组之一放射性标记物、磷光标记物、冷光标记物、荧光标记物及酶。
19.如权利要求18所述之免疫检测试剂盒，该冷光标记物系为化学冷光标记物或生物冷光标记物。
20.如权利要求18所述之免疫检测试剂盒，该酶系选自下列所构成的群组之一过氧化S酶(Hydrogen peroxidase)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phospatase ；AP)、以及 Beta-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase)。
21.如权利要求20所述之免疫检测试剂盒，进一步包含有生物素及抗生物素蛋白，该生物素系与该侦测抗体连接，且该抗生物素蛋白系与该酶连接。
22.如权利要求21所述之免疫检测试剂盒，进一步包含有受质，该受质可与该酶反应而发生呈色反应。
23.如权利要求14所述之免疫检测试剂盒，进一步包含有冲洗试剂，该冲洗试剂系选自下列所构成的群组之试剂及其组合磷酸盐缓冲溶液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(TBS)以及 Tween 20。
24.如权利要求14所述之免疫检测试剂盒，进一步包含阻隔试剂，藉以阻隔固相载体上未结合该单克隆抗体之位置。
25.如权利要求M所述之免疫检测试剂盒，该固相载体系选自下列所构成的群组之一微孔盘、微球体、杂交膜、及试纸。
26.如权利要求M所述之免疫检测试剂盒，该阻隔试剂系包含有蛋白质，该蛋白质系选自下列所组成的群组之试剂及其组合牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)以及动物明胶(Gelatin)。
27.如权利要求M所述之免疫检测试剂盒，该阻隔试剂系为脱脂牛乳。
28.一种免疫检测方法，系利用酶联免疫吸附试验法(ELISA)进行检测，包含有下列步骤提供固相载体(Solid phase carrier)； 提供单克隆抗体，该单克隆抗体具有权利要求8所述之特征； 将该单克隆抗体施加(Applying)至该固相载体； 提供样本抗原，该样本抗原系与该单克隆抗体进行专一性结合； 提供待测检体，该待测检体可操作性地与该样本抗原进行免疫反应，藉以于该固相载体上形成一免疫复合物；提供侦测试剂，该侦测试剂可操作性地与该免疫复合物进行免疫反应，并产生讯号；以及侦测该讯号。
29.如权利要求28所述之免疫检测方法，该抗原样本系衍生自口蹄疫病毒之3ABC基因。
30.如权利要求观所述之免疫检测方法，该侦测试剂包含有侦测抗体与讯号产生物质。
31.如权利要求30所述之免疫检测方法，该侦测抗体系与该讯号产生物质共轭结合。
32.如权利要求30所述之免疫检测方法，该讯号产生物质系选自下列所构成的群组之一放射性标记物、磷光标记物、冷光标记物、荧光标记物及酶。
33.如权利要求32所述之免疫检测方法，该冷光标记物系为化学冷光标记物或生物冷光标记物。
34.如权利要求32所述之免疫检测方法，该酶系选自下列所构成的群组之一过氧化氧酶(Hydrogen peroxidase)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、碱性磷酸 Sl (Alkaline phospatase ；AP)、以及 Beta—半乳糖昔醇(Beta—galactosidase)。
35.如权利要求32所述之免疫检测方法，该讯号产生物质进一步包含有生物素及抗生物素蛋白，该生物素系与该侦测抗体连接，请该抗生物素蛋白系与该酶连接。
36.如权利要求35所述之免疫检测方法，进一步包含有提供受质之步骤，该受质可与该酶反应而发生呈色反应。
37.如权利要求观所述之免疫检测方法，进一步包含有提供冲洗试剂之步骤，该冲洗试剂系选自下列所构成的群组之试剂及其组合磷酸盐缓冲溶液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(TBS)以及Tween 20。
38.如权利要求观所述之免疫检测方法，该固相载体系选自下列所构成的群组之一 微孔盘、微球体、杂交膜、及试纸。
39.如权利要求观所述之免疫检测方法，进一步包含有提供阻隔试剂(Blocking reagent)之步骤，藉以阻隔该固相载体上未结合该单克隆抗体之位置。
40.如权利要求39所述之免疫检测方法，该阻隔试剂系包含有蛋白质，该蛋白质系选自下列所组成的群组之试剂及其组合牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)以及动物明胶。
41.如权利要求39所述之免疫检测方法，该阻隔试剂系为脱脂牛乳。
全文摘要
本发明系提供一种杂交瘤细胞株、其单克隆抗体、包含前述单克隆抗体之免疫检测试剂及试剂盒，以及免疫检测方法。杂交瘤细胞株系由亲代细胞与骨髓瘤细胞融合而制成，其特征如保藏号为PTA-11304之细胞株所示，该亲代细胞系由原核细胞所表达之口蹄疫病毒之由3ABC基因片段所编码之非结构蛋白作为抗原免疫至小鼠，并将该小鼠体内之脾脏细胞取出而制成，且该杂交瘤细胞株所生产之单克隆抗体能够专一性辨识口蹄疫病毒之该3ABC肽，且不会与猪水疱病抗血清产生非特异性反应。
文档编号C12N5/18GK102533663SQ201010588900
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者李璠, 潘居祥, 钟明华, 陈姿菡 申请人:财团法人工业技术研究院