专利名称：一种小菜蛾天蚕素基因、编码的蛋白、相应的表达系统和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种小菜蛾天蚕素基因、编码的蛋白、相 应的表达系统和应用。
背景技术：
抗菌肽是一类不易导致微生物耐药性的新型抗感染多肽。世界上发现的第一种 抗菌肽是天蚕素，1980年由瑞典科学家Boman等用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天 蚕蛹产生出抗菌活性的多肽物质，定名为天蚕素(cecropins)。天蚕素是第一种被发现的 昆虫抗菌肽，广泛存在于昆虫中，现在已经从鳞翅目的蛾类、蝴蝶及双翅目的蝇类中分 离纯化出20多种天蚕素类似物。随后又在其他生物体内陆续发现了多种菌肽，如蛙皮素 (magainins)、蜂毒素(melittins)、防御素(defensins)等。目前世界上已知的抗菌肽共有 1200多种。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为抗 菌肽。随着研究工作的深入开展，发现某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具 有很强的杀伤作用。抗生素抗菌机制是抗生素与病原体特定部位的受体结合从而使病原体的正常结 构遭到破坏或使某些生物合成受阻，以达到抑菌或杀菌的作用。当其作用的靶位点发生改 变时，抗生素就会失去其抗菌作用，这是微生物易于对抗生素产生耐药性的根本。目前认为 天蚕素抗菌肽的抗菌机制为抗菌肽以物理的方式作用于细菌的细胞膜，使细胞膜穿孔、细 胞质外溢而将细菌杀死。由于天蚕素类抗菌肽均具有疏水和亲水的两亲性特征，带正电荷 的分子与细胞膜磷脂分子上的负电荷形成静电吸附而结合在细胞的磷脂膜上，随后天蚕素 抗菌肽分子的疏水端插入细菌细胞膜的脂质膜中，进而牵引整个分子进入质膜，扰乱质 膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，再通过天蚕素抗菌肽分子间的相互位移而聚合形成跨 膜离子通道，细胞质外流，细胞内离子大量丢失，细菌不能维持正常生命活动所需的胞内渗 透压而死亡。抗菌肽的抗菌谱较传统抗生素宽，传统抗生素通常只对细菌有效，而对真菌、病毒 等病原体无效。抗菌肽既有抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的作用，又有抗真菌、抗病毒作 用。抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性，不同天蚕素抗菌肽与传统抗生素联用，还可提高 各自的药物疗效，甚至拓宽传统抗生素的抗菌谱，这也是近年来对天蚕素抗菌肽研究中 的一个新发现。昆虫抗菌肽是一类具有免疫效应的小分子多肽，它具有热稳定、抗菌谱广、无免 疫原性、作用机制独特等特性，是昆虫能够抵御自然界中有害微生物侵染的重要因素。近 年来，随着有关抗菌肽作用机理及功能研究的深人，其在医药领域的研究越来越引起人 们的关注。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供一种小菜蛾天蚕素基因。本发明另一目的在于提供上述小菜蛾天蚕素基因编码的蛋白。本发明另一目的在于提供上述小菜蛾天蚕素基因的克隆方法。本发明另一目的在于提供上述小菜蛾天蚕素的制备方法。本发明还有一个目的在于提供上述小菜蛾天蚕素的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明应用基因工程手段克隆了小菜蛾幼虫体内的cecropin基因，并在原核系统中 得到了高效表达，重组的小菜蛾抗菌肽cecropin不仅对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌有较 强的抑制作用，而且对多种病原真菌也有较强的抑制作用，有望发展成为新型的肽类抗生
ο本发明所述的小菜蛾天蚕素(Cecropin)抗菌肽，它具有如下SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的序列
(1)SEQ ID NO 1 的信息
(a)序列特征 * 长度:480 bp *类型核酸
*链型双链 *拓扑结构线性
(b)分子类型DNA
(c)假设否
(d)反义否
(e)最初来源小菜蛾幼虫(Plutellaxylost el la L.)
(f)序列描述:SEQID NO 1
(2)SEQ ID NO 2 的信息
(a)序列特征 *长度65
*类型氨基酸 *链型单链 *拓扑异构线性
(b)分子类型肽
(c)序列描述SEQID NO 2
本发明的小菜蛾天蚕素cDNA的克隆方法如下
(1)用OD值为0.8-1. 0大肠杆菌注入小菜蛾4龄幼虫体内进行诱导，利用诱导M小时 的小菜蛾幼虫提取总RNA，然后将总RNA反转录合成cDNA ；
(2)根据天蚕素的表达序列标签序列(EST)设计3'末端快速扩增反应(RACE)的特异 引物
正向引物=SEQ ID NO 3
反向引物寡聚脱氧胸腺核苷酸[Oligod (T) 18](3)通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；
(4)将扩增产物纯化，取纯化产物克隆到pMD18-T载体，转化DH5α细胞，平板过夜培 养，抽提质粒，经酶切和测序鉴定得到一个420bp大小的DNA片段。上述小菜蛾天蚕素cDNA的克隆方法具体操作如下 从小菜蛾幼虫，采用RNA kit提取总RNA。然后利用5 10微克总RNA或mRNA反转录合成cDNA。cDNA第一链合成5 10微 克总RNA, 10微升的缓冲液，4微升寡聚脱氧胸腺核苷酸，10微升10微摩尔脱氧核苷酸混合 物，3. 2微升RNA酶抑制剂，2微升M-MLV逆转录酶，12. 8微升的无RNA酶的蒸馏水，70°C反 应5分钟，42 °C反应60分钟终止反应。链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件如下 首先将下列试剂混合在一起
IOxTaq DNA聚合酶缓冲液 5微升(μ )
模板 cDNA2μ1
正向引物(1. 25μβ/μ1)2μ1
反向引物(1. 25μβ/μ1)2μ1
脱氧核苷酸混合物(dNTP )4μ1
Taq DNA 聚合酶0. 5μ1
灭菌水34. 5μ1
总体积50μ1
链式聚合酶PCR反应条件为首先94°C变性5分钟，然后进入下列循环94°C 30秒， 45 0C 30秒，72°C 50秒，共进行35个循环，最后72 °C延伸10分钟。结果扩增到了 420bp的一条带。将扩增产物纯化，取10μ1纯化产物克隆到pMD18_T 载体(TaKaRa)，转染DH5ci细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取6个白斑，提取 质粒，用于序列测定。序列拼接后，结果得到了 480bp的DNA片段，开放阅读框(ORF)为 198bp，由此推得编码65个氨基酸的一段序列，将此序列与已发表的抗菌肽的序列比较，结 果与鳞翅目昆虫的天蚕素氨基酸序列具有相似性，因此可以确定该基因为一种新的抗菌肽 基因。本发明所述的制备上述具有杀菌功能的小菜蛾天蚕素的方法，包括以下步骤
(1)根据小菜蛾天蚕素成熟肽的编码，设计引物PF和ra，
(2)进行常规链式聚合酶反应扩增小菜蛾天蚕素成熟肽的CDNA；
(3)在适于表达的载体中克隆小菜蛾天蚕素成熟肽的cDNA；
(4)表达质粒pET-3^i-PX-cecl在原核细胞中的高效表达；
(5)在适于表达该cDNA片段的条件下培养宿主细胞，并从中回收所需的产物。(6)在适于纯化的条件下纯化重组蛋白。上述步骤(1)中所述的设计引物PF: SEQ ID N0:4 ；PR: SEQ ID N0:5。作为一种优选方案，步骤(2)具体为
将混合液在94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C、40秒，50°C、40秒，72°C、50 秒，共进行35个循环，最后72°C延伸7分钟，扩增完毕后置4°C终止反应。所述混合液组成如下含 20 mM Mg2+ 的 10XPCR 缓冲液5 μ 1 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度
各为2. 5 mM的dNTP混合物4 μ 1
浓度为10 μ M的引物PF4μ 1
浓度为10 μ M的引物PR4μ 1
浓度为5U/ μ 1的高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1
灭菌水32. 5μ1。作为一种优选方案，步骤(3)中所述的载体为pET_32a ；在一个更优选的实施例 中，步骤(3)具体包括
(a)杀菌活性肽的获得。为了在杀菌活性肽I^x-cecl氨基端不引入其它氨基酸序列，在 设计PF和冊引物时，在上游引入了 Afc0 I酶切位点，下游引入损ol酶切位点，这样得到的 成熟肽cDNA片段与载体连接保证了正确的插入方向。且表达的融合蛋白经肠激酶切割后 释放出具有天然N端的天蚕素。(b)将杀菌活性肽的cDNA进行Nco I和)(h0 I双酶切，胶纯化回收后，与经同样酶 切回收的质粒pET-3h体外连接，构建表达质粒pET-3h-Px-cecl。作为一种优选方案，步骤(4)具体包括
将宿主细菌BL21(DE3)按1 50体积比接种于新鲜的LB加富培养基(含100 μ g/ml Amp+)中，37°C剧烈振荡放大培养至OD6tltl =0.8时，加入终浓度为0.4 mM IPTG，同时加入 终浓度为0. 的葡萄糖，降低本底的表达。在25°C诱导表达9小时，4 0C,12, OOOg离心 2min，收集菌体备用。作为一种优选方案，步骤(5)具体包括将收集的菌体，经超声波细胞粉碎机，以 300W的功率，冰浴下超声4-5个循环(超声如，间歇如，重复90次为一个循环)破碎细菌 细胞，4°C、12，OOOg离心30min后取上清液。经Ni2+金属亲和层析HisTrap HP纯化融合蛋 白，纯化的融合蛋白经肠激酶(EK)酶切，酶切产物先用HisTrap HP (5 ml)进行纯化，收集 流出液，流出液再进行第二次HisTrap HP (5 ml)柱纯化，收集流出液，进一步用截留分子 量为10.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去10.0 kDa以上的大蛋白， 进一步用截留分子量为2.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去2.0 kDa 以下的小蛋白，除去滤过液，冷冻干燥处理，-80°C保存备用。本发明的关键技术是克隆得到小菜蛾天蚕素的全长基因及得到有杀菌活性的重 组天蚕素。
具体实施例方式下面结合实施例及附图
对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1小菜蛾抗菌肽Cecropinl基因的克隆方法
有实验室饲养小菜蛾G0AzteWa Xj^o1SteWa)幼虫，用大肠杆菌(fecAericAia coli)、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus auceus )禾口出芽短梗霄菌{Aureobasidium pullulans ) 作为供试菌种。1.总RNA提取用OD值为0. 8-1. 0的大肠杆菌刺激小菜蛾4龄幼虫，进行抗菌肽的诱导。取经M小时诱导后的小菜蛾0. 5-1克，液氮中研磨，用异硫氰酸胍法提取总RNA
2.cDNA第一链合成按照CL0NTECH公司RACE试剂盒说明书进行，10微克总RNA，加反 应液20微升42 V反应90分钟。72°C 10分钟终止反应。反应液组成50毫摩尔氯化钾，3 毫摩尔氯化镁，10毫摩尔Tris-HCL pH8. 3，1毫摩尔DTT，5微摩尔d NTP, 25单位RNA酶 抑制剂，8单位AMV逆转录酶
3.PCR反应链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件 首先将下列试剂混合在一起
IOxTaq DNA聚合酶缓冲液 5微升(μ )
模板 cDNA2μ1
正向引物(1. 25μβ/μ1)2μ1
反向引物(1. 25μβ/μ1)2μ1
脱氧核苷酸混合物(dNTP )4μ1
Taq DNA 聚合酶0. 5μ1
灭菌水34. 5μ1
总体积50μ1
正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物为寡聚脱氧胸腺核苷酸Oligo d (T)lgoPCR反应条件为首先94°C变性5分钟，然后进入下列循环94°C 30秒，65°C 30 秒，72 0C 50秒，共进行35个循环，最后72 °C延伸10分钟。4.反应产物纯化利用OMEGA ΒΙ0-ΤΕΚ公司产品(Gel Extraction Kit)操作步骤 按产品说明书进行。5.抗菌肽基因克隆取纯化产物5微升，连接与pMDIS-T载体(TaKaRa)。转化到大 肠杆菌DH5 α菌株，在还有氨苄青霉素(100毫克/毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG0. 1 摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取6个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100毫克/毫升 氨苄青霉素)过夜培养。6.质粒纯化收取过夜培养菌液1-2毫升，离心(10000转，1分钟)收集细胞。用 微量DNA纯化试剂盒(OMEGA ΒΙ0-ΤΕΚ)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。序列测序与同源检索取500微升菌液，送华大基因进行测序。将所得序列拼接并 与基因库序列比较。实施例2制备有杀菌功能的小菜蛾天蚕素的方法
1.扩增小菜蛾天蚕素成熟肽编码的引物
PF: 5' -5' -GCG ^r^AGCCGTTTAAAAAATTGG4-3'，ccai^·表示引入的酶切位点为 Nco I，
PR: 5' - ggAcic^TCATTTGCCAGTAGGTCTGGCTA-3‘，cic^a^ 表示引入的酶切位点为 Xhol.
2.小菜蛾天蚕素成熟肽编码的PCR扩增
以小菜蛾4龄幼虫的cDNA为模板，反应条件如下 所述混合液组成如下
含 20 mM Mg2+ 的 10XPCR 缓冲液5 μ 1
dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5 mM的dNTP混合物4 μ 1
浓度为10 μ M的引物PR4μ 1
浓度为10 μ M的引物PF4μ 1
浓度为5U/ μ 1的高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1
灭菌水32. 5μ1。将混合液在94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C、40秒，55°C >40秒，72°C、 50秒，共进行35个循环，最后72°C延伸7分钟，扩增完毕后置4°C终止反应。3.小菜蛾天蚕素成熟肽在原核细胞中的表达
将PCR扩增得到的小菜蛾天蚕素的cDNA进行Nco I和Bio I双酶切，胶纯化回收后， 与经同样酶切回收的质粒pET-3h体外连接，构建表达质粒pET-3h-Px-cecl ；将测序鉴定 正确的重组质粒pET-3h-PX-cecl转化表达宿主菌BL21，构建工程菌株。挑取工程菌株单 菌落接种于LB液体加富培养基(含100 μ g/ml Amp+)中，37°C剧烈振荡培养16小时，作为 种子菌。取种子菌按1 50体积比接种于新鲜的LB加富培养基(含100yg/ml Amp+)中， 37°C剧烈振荡放大培养至0D_ =0.8时，加入终浓度为0.4 mM IPTG，同时加入终浓度为 0. 的葡萄糖，降低本底的表达。在25°C诱导表达9小时，4 0C >12, OOOg离心aiiin，收集 菌体备用。并预留Iml菌液用于SDS-PAGE分析。用预冷的TE缓冲液(pH 8.0)洗涤菌 体后，再用预冷的溶液I (300 mM KCl (pH8. 0)，50 mM KH2PO4，5 mM咪唑)重悬菌体。采用 JY92-II型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所研制)以300W的功率，冰浴下超声4-5 个循环(超声4s，间歇如，重复90次为一个循环)破碎细菌细胞，4°C、12，OOOg离心30min 后取上清液进行SDS-PAGE分析检测重组蛋白质的表达情况。4.重组小菜蛾抗菌肽天蚕素的纯化
将破碎菌体离心后收集的上清液，经Ni2+金属亲和层析HisTrap HP纯化融合蛋白，纯 化的融合蛋白经肠激酶(EK)酶切，酶切产物先用HisTrap HP (5 ml)进行纯化，收集流出 液，流出液再进行第二次HisTrap HP (5 ml)柱纯化，收集流出液，进一步用截留分子量为 10.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去10.0 kDa以上的大蛋白，进一 步用截留分子量为2.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去2.0 kDa以 下的小蛋白，除去滤过液，冷冻干燥处理，_80°C保存备用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种小菜蛾天蚕素基因，其特征在于该基因为480bp的双链线性DNA，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO :1 所示。
2.权利要求1所述小菜蛾天蚕素基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白有65个氨基酸， 其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.权利要求1所述小菜蛾天蚕素基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤(1)用OD值为0.8-1. 0大肠杆菌注入小菜蛾4龄幼虫体内进行诱导，利用诱导24小时 的小菜蛾幼虫提取总RNA，然后将总RNA反转录合成cDNA ；(2)根据天蚕素的表达序列标签序列(EST)设计3'末端快速扩增反应的特异引物，正 向引物序列如SEQ ID N0:3所示，反向引物为寡聚脱氧胸腺核苷酸Oligo d (T)18;(3)通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；(4)将扩增产物纯化，取纯化产物克隆到pMD18-T载体，转化DH5α细胞，平板过夜培 养，抽提质粒，经酶切和测序鉴定得到小菜蛾天蚕素基因。
4.权利要求2所述小菜蛾天蚕素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据小菜蛾天蚕素的氨基酸序列，设计引物，引物序列如SEQID Ν0:Γ5所示；(2)PCR扩增小菜蛾天蚕素的cDNA ；(3)在载体中克隆小菜蛾天蚕素的cDNA；(4)将表达质粒在宿主细胞中表达；(5)培养宿主细胞，回收小菜蛾天蚕素。
5.根据权利要求4所述小菜蛾天蚕素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于步骤 (4)中所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
6.根据权利要求4所述小菜蛾天蚕素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于步 骤(5)中所述回收方法是将宿主细菌按1 50体积比接种于新鲜的LB加富培养基 (含100yg/ml Amp+)中，37°C剧烈振荡放大培养至OD6tltl =0.8时，加入终浓度为0.4 mM IPTG，同时加入质量终浓度为0. 2%的葡萄糖，降低本底的表达，在25°C诱导表达9h，4 °C、 12，OOOg离心2min，收集菌体，将菌体冰浴下经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清， 经层析纯化、酶切、过滤，经冷冻干燥处理，得到小菜蛾葛佬素。
7.根据权利要求6所述小菜蛾天蚕素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于所述超 声破碎细胞是以300W的功率，超声4 5个循环，每个循环是超声4s，间歇4s，重复90次。
8.根据权利要求6所述小菜蛾天蚕素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于所述离 心是 40C、12，OOOg 离心 30min。
9.根据权利要求6所述小菜蛾天蚕素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于所述层 析纯化、酶切、过滤包括如下步骤经Ni2+金属亲和层析HisTrap HP纯化融合蛋白，纯化的 融合蛋白经肠激酶酶切，酶切产物先用5 ml HisTrap HP进行纯化，收集流出液，流出液 再进行第二次5 ml HisTrap HP柱纯化，收集流出液，进一步用截留分子量为10. 0 kDa的 超率装置对重组蛋白进行纯化，除去10.0 kDa以上的大蛋白，进一步用截留分子量为2.0 kDa的超率装置对重组蛋白进行纯化，除去2.0 kDa以下的小蛋白，除去滤过液。
10.权利要求2所述小菜蛾天蚕素在食品保鲜或饲料防腐中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小菜蛾天蚕素基因、编码的蛋白、相应的表达系统和应用。本发明小菜蛾天蚕素基因为480bp的双链线性DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码的蛋白有65个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明小菜蛾天蚕素，通过基因重组技术在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌功能的小菜蛾天蚕素。所述的具有杀菌功能的小菜蛾天蚕素在医药、食品保鲜及饲料防腐添加中有广阔的应用价值。
文档编号A23L3/3526GK102094024SQ20101058939
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者任顺祥, 许小霞, 金丰良 申请人:华南农业大学