专利名称：一种目的基因的漂移处理检测方法
技术领域：
本发明涉及一种目的基因的漂移处理检测方法，具体涉及一种转hBD-3基因克隆 牛或羊生产过程中目的基因的漂移处理检测方法。
背景技术：
转基因细胞和胚胎内含有外源目的基因，在细胞培养和核移植等操作过程中目的 基因的漂移是转基因安全评价的一个重要环节。它不能有其他外源基因的漂移，否则目的 基因的漂移是不安全的。目的基因的漂移是指目的基因经过聚合酶链式反应的过程。其中， 目的基因_hBD3基因定位于人的第8号染色体的p22 23区域内，包括2个外显子和1个 内含子，全长1156bp ；聚合酶链式polymerase chain reaction(PCR)是指模板基因序列先 经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条 引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退货而相互结合，接着在DNA聚合 酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退 火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。为了检测目的基因的漂移，收集转基因细胞培养液、核移植操作液和胚胎培养液 等可能含有外源基因的液体，通过对这些可能含有外源基因的液体进行一系列的检测，来 判断目的基因的漂移是否有外源基因的漂移参与。现阶段，这种目的基因的漂移方法中很 难做到无还外源基因的漂移参与，这对整个转基因动物生产过程中的环境安全构成严重威 胁。
发明内容
本发明的目的在于提供一种目的基因的漂移处理检测方法，其解决了背景技术中 难以做到无还外源基因的漂移参与的技术问题。本发明的技术解决方案是一种目的基因的漂移处理检测方法，其特殊之处在于，该方法包括1)样品的收集和处理1. 1)将培养的转基因细胞废液、细胞冷冻解冻后的冻存液，以及核移植过程中的 操作液和胚胎培养过程中的培养液收集起来；1. 2)对收集的废液在121. 50C的温度下进行高压处理30min，压力在103. 4kPa ；1. 3)经高压处理后的收集液，取4个1. 5ml的离心管，每离心管装Iml ；1. 4)高速离心机上3000rpm离心lmin。1. 5)离心液采用微量DNA提取试剂盒进行提取并浓缩；2) PCR 反应以转基因质粒和未经高压处理的收集液作为阳性对照，非转基因细胞培养液经过 同样处理后作为阴性对照，以水代替DNA模板作为空白对照；PCR反应体系见表1，每个反应 体系设置两个平行反应；
表IPCR反应体系
权利要求
1. 一种目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，该方法包括1)样品的收集和处理1.1)将培养的转基因细胞废液、细胞冷冻解冻后的冻存液，以及核移植过程中的操作 液和胚胎培养过程中的培养液收集起来；·1. 2)对收集的废液在121. 5°C的温度下进行高压处理30min，压力在103. 4kPa ； 1. 3)经高压处理后的收集液，取4个1. 5ml的离心管，每离心管装Iml ； 1. 4)高速离心机上3000rpm离心lmin。 1. 5)离心液采用微量DNA提取试剂盒进行提取并浓缩；2)PCR反应以转基因质粒和未经高压处理的收集液作为阳性对照，非转基因细胞培养液经过同样 处理后作为阴性对照，以水代替DNA模板作为空白对照；PCR反应体系见表1，每个反应体系 设置两个平行反应； 表1 PCR反应体系
2.根据权利要求1所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，该方法还包括 PCR产物电泳检测步骤；具体是1)将适量的琼脂糖加入IXTAE缓冲液中，加热溶解，配制成w/v浓度为1.0%的琼脂 糖溶液；2)按每IOOmL琼脂糖溶液中加入5μ L EB溶液的比例加入EB溶液，混勻，3)将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入IXTAE缓冲液中，垂直向 上拔去梳板；4)吸取5μ L的PCR产物与适量的加样缓冲液混合后加入点样孔中，在其中一个点样孔 中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm条件下电泳。
3.根据权利要求2所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，该方法还包括凝 胶成像分析步骤；具体是1)电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像；2)根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相 系统拍照。
4.根据权利要求1 3任一所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，该方法还 包括提取物浓度测定步骤；具体是紫外分光光度法检测，样品DNA用核酸蛋白分析仪测定^Onm和^Onm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓 度，计算公式如式(1)、式O)DDNA 纯度=OD260/OD280,比值为 1. 8-2. 0 ；2)双链 DNA 浓度(μ g/mL) = 50 X OD280。
5.根据根据权利要求4所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，所述PCR反应 试剂dNIPs为浓度为lOmmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸的等体积 混合溶液。
6.根据根据权利要求5所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，所述50X TAE 缓冲液为称取242. 2g Tris，用500mL水加热搅拌溶解，加入500mmol/L EDTA溶液lOOmL， 用冰乙酸调pH至8. 0，然后加水定容至IOOOmL ；所述50XTAE缓冲液使用时用水稀释成 1XTAE。
7.根据根据权利要求6所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，所述琼脂糖； 溴化乙锭(EB)溶液10mg/mL ；所述加样缓冲液6 X Ioadingbuffer。
8.根据根据权利要求7所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，所述TE缓冲 液分别加入 lmol/L pH 8. 0 的 Tris-HCl IOmL 和 500mmol/L pH8. 0 的 EDTA 溶液 2mL，加 水定容至1000mL。
9.根据根据权利要求8所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，所述PCR反应 的引物hBD3-F :5’ -AGCAGCTATGAGGATCCATTATCTT-3，hBD3-R :5，-TCTAGATTTTATTTCTTTCTTCGGCATT-3，。
10.根据根据权利要求9所述目的基因的漂移处理检测方法，其特征在于，所述PCR反 应的引物溶液用PH8. 0的TE缓冲液将上述引物稀释到lOumol/L。
全文摘要
一种目的基因的漂移处理检测方法，包括收集转基因细胞培养液、核移植操作液和胚胎培养液等可能含有外源基因的液体，对其进行高压处理，然后对液体进行浓缩；针对外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增外源基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断在转基因细胞筛选过程中以及胚胎生产和培养过程中所产生的液体经处理后是否还有外源基因的存在。本发明这种处理检测方法完全可以避免外源基因的漂移，保证了转基因动物生产过程中的环境安全。适用于来源于人的防御素-3基因的转基因奶牛和山羊的生产过程中的基因漂移的检测。
文档编号C12Q1/68GK102086475SQ20101059275
公开日2011年6月8日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者刘军, 华松, 张涌, 张辉, 权富生, 王勇胜, 鲁成龙 申请人:西北农林科技大学