专利名称：一种长穗偃麦草e组染色体特异rapd-scar分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种长穗偃麦草E组染色体特异RAPD-SCAR分子标记，尤其涉及一种 检测小麦E组染色体的试剂盒及其应用。
背景技术：
偃麦草属是小麦的一个近缘种属，它具有普通小麦缺少的许多优良性状，如分蘖 能力强，根系发达，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐盐碱力强，多花、大穗、多实，籽粒蛋白含量高以及 优良的烘烤品质，抗多种病害能力强，对小麦条锈病、叶锈病、杆锈病、白粉病、黄矮病、条纹 花叶病及腥黑穗病高抗至免疫，是小麦遗传育种的重要亲本之一。长穗偃麦草(Agropyron elongatum)是小麦的一个重要近缘种，具有蛋白质含量高、抗多种真菌和病毒病害、耐旱、 耐寒、大穗多花等优异性状，是在小麦品种改良中应用最广泛的野生种之一。在自然界，长穗偃麦草有二倍体、四倍体和十倍体3种倍性类型。其中二倍体长穗 偃麦草(Thinopyrum elongatum) E组染色体是组成偃麦草属(Elytrigia)多倍体物种的基 本染色体组，携带有对小麦遗传育种有益的基因，但对于四倍体和十倍体类型的染色体组 构成，一直没有一致的结论。通过远缘杂交及染色体工程的方法从普通小麦野生近缘种属 转移优良基因的方法已被实践证明是一条卓有成效的途径。目前，国外从长穗偃麦草中成 功转移了 Sr24 (3DL)，Sr26 (6AL)，Sr25 (7DL, 7AL)，Lrl9, Lr24 等基因。国内从小麦与长穗 偃麦草杂种后代中育成了小偃4号、5号、6号、小偃107等小麦品种。通过杂交和渐渗的方式是将外源染色体的优良性状和优异基因导入小麦的一种 有效的方法，但是，在重组的小麦中，源于小麦-长穗偃麦草杂交后代的外源E组染色质或 染色体的检测成为至关重要的问题，虽然通过农学上的重要特性以及生化分析已将有价值 的基因绘图在长穗偃麦草染色体上，但这些实验的检测手段是不稳定的，而且不适合进行 重要的农学性状的检测。有一些遗传学手段，如染色体分带、原位杂交等技术，已经将其用 于小麦遗传背景下外源遗传物质的检测，但这些技术费时、费力，对技术的要求也很高，而 且用这些实验手段进行大规模的后代快速筛选依然存在一定的局限。所以，迫切要求开发 一种可以在小麦遗传背景下快速、准确、大规模的鉴定长穗偃麦草外源染色质或染色体的 分子标记技术。随着分子生物学的发展，DNA分子标记已经广泛应用于小麦遗传育种的研究，限制 片段长度多态性(RFLP)是首次被使用的分子标记，在植物遗传研究中获得很大的应用价 值，但是，RFLP技术需要大量纯化的DNA，而且实验本身费时，对技术要求也很高，它不适合 进行育种系统的大规模的筛选，因此，育种学家已经开始进行普通PCR的研究，期望在小麦 育种系统中找到一种更简单的方式鉴定外源染色质，许多基于PCR的DNA分子标记技术已 经被开发，如 RAPD，AFLP，EST，SSR等。在这些标记中，RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)技术相对简单，而且它不需要知道有关序列方面的信息，同时在指纹图谱和系统发生 学研究领域的应用是高效的。但它的重复性和稳定性却很差，如果将其转化为SCAR标记， 其特异性和稳定性大幅度提高，可以更方便快捷地应用于异源染色体的检测。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测植物E组染色体的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括如下引物对所述引物对中的一条引物为序列表中的 序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。所述植物为含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物，所述含有长穗偃 麦草E组染色质或染色体的小麦属植物具体为“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加系和“中 国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。本发明的另一个目的是提供一种检测植物E组染色体的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由如下引物对、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶和PCR缓冲液组 成所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另 一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5 μ M ；所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR试 剂中的浓度为0. 06υ/μ 1 ；所述氯化镁在所述的PCR试剂中的浓度为0. ISmM ；所述植物为含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物。所述含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物为“中国春”-长穗偃麦草 3Ε 二体附加系和“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代和/或所述F1 代自交得到的F2代。所述引物对或所述的PCR试剂或所述的试剂盒在检测长穗偃麦草E组染色体中的 应用，也是本发明保护的范围。PCR缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号R10T1。本发明的第三个目的是提供一种辅助检测待测植物中是否含有E组染色体的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述试剂盒中的引物对或所述的PCR试剂 对待测植物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产 物中含有大小为807bp的片段，则所述待测植物中候选含有E组染色体，若所述PCR扩增产 物中不含有大小为807bp的片段，则所述待测植物中候选不含有E组染色体。所述PCR扩增中，以待测植物的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为57°C。所述PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第观7_1093位核苷酸。所述检测所述PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。本发明的实验证明，本发明开发的SCAR分子标记为快速、准确地鉴定小麦遗传背 景下的外源长穗偃麦草E组染色质或染色体奠定基础。小麦外源E组染色质的检测是鉴定 小麦-长穗偃麦草重组系、渐渗系的关键，大量杂交后代的筛选和鉴定工作非常繁杂，本发 明获得的E基因组特异SCAR标记，即SCAR8tl7,将为小麦-长穗偃麦草重组系E组染色质的 快速检测和准确鉴定以及分子标记辅助育种提供新的途径和方法。
图1为RAPD引物0PF03在普通小麦“中国春”、“中国春”-2C 二体附加系、二倍体
长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草中的扩增结果图2为RAPD-SCAR引物在CS-1E 7E 二体附加系，CS-2C 二体附加系，二倍体长
穗偃麦草，四倍体长穗偃麦草中的扩增结果图3为SCAR8tl7引物在CS-3EXCS-2C的F1, F2代中的扩增结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。供试材料为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系(Endo TR. Allocation of a Gc chromosome of Aegilops cylindrica to wheat homoeologous group 2. Genes Genet Syst，1996，71 J43-M6，公众可从哈尔滨师范大学获得)，二倍体长穗偃麦草(Knott D R.The inheritance of rust resistance. VI. The transfer of stem rust resistance from Agropyron elongatum to common wheat. Canadian Journal of Plant Science, 1961,41 :108-123,公众可从哈尔滨师范大学获得)、“中国春”-长穗偃麦草二体附加 系(1E-7E)(Dvorak J，Knott DR. Disomic and diteleosomic additions of diploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J Genet Cytol,1974, 16 :399-417,公众可从哈尔滨师范大学获得)来自于日本国家生物资源计划小麦中心；四 倍体长穗偃麦草(Heneen W K，Runemark H. Cytology of Elym us (Agropyron) elongata complex. Hereditas，1972，70 (2) :155_164，公众可从哈尔滨师范大学获得)来自于中国 农业科学院；普通小麦“中国春”(Miller TE，Hutchinson J，Chapman V Investigation of a preferentially transmitted Aegilops sharonesis chromosome in wheat. Theor Appl Genet, 1982,61 :27-33.，公众可从哈尔滨师范大学获得)、“中国春”-长穗偃麦草 3E 二体附力口系(Dvorak J，Knott DR. Disomic and diteleosomic additions of diploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J Genet Cytol, 1974, 16 :399-417,公众可从哈尔滨师范大学获得)与“中国春”_杀配子染色体2C 二体附加系杂 交获得的Fp F2代来自于哈尔滨师范大学。 实施例1、长穗偃麦草E组染色体特异RAPD-SCAR分子标记0PF03的获得1、长穗偃麦草E组染色体特异RAPD-SCAR分子标记0PF03的筛选与克隆利用36条RAPD引物，对普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附 加系、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草等材料进行扩增筛选，分离和克隆E基因组特 异扩增片段。PCR扩增体系Template DNA50ngIOx buffer2. 5 μ 11. 5mMMgCl222. 5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM)1· 5 μ 1
RAPD Primer (10 μ Μ)1 μ 1r Taq polymerase (5U/μ 1) 0. 25 μ 1_Distilled sterile water up to 20 μ 1PCR反应程序94°C预变性5分钟，45个循环包括94°C变性30秒，36°C退火45秒， 72°C延伸1分钟，45个循环，之后72°C延伸10分钟。4°C保存。RAPD扩增产物均在含有lmg/ml EB的1. 2%琼脂糖上电泳检测，在紫外成像系统 (Gel Doc-2000, Bio-Rad, USA)下观察并照相记录结果。PCR扩增结果如图1所示，其中1.为普通小麦“中国春”;2.为“中国春”-杀 配子染色体2C 二体附加系；3.为二倍体长穗偃麦草；4.为四倍体长穗偃麦草；M.为 DL2000marker，从图中看出，引物0PF03 5，-CCTGATCACC-3，(序列1)在二倍体长穗偃麦草、 四倍体长穗偃麦草中能扩增出一条HOObp左右的片段，此产物在普通小麦“中国春”中没 有出现，在中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系中没有出现目的片段；表明这个片段是长 穗偃麦草E基因组所特有的。回收从二倍体长穗偃麦草中得到的特异片段，送去测序。经测序结果可知，该PCR 产物具有序列表中序列2所示的核苷酸，序列表的序列2由1407个核苷酸组成，将PCR产 物命名为0PF0314Q7。在GeneBank中将其进行Blast同源性搜索，0PF0314(17未找到与其具有同源性的序 列，所以可以初步证明该片段是长穗偃麦草E基因组所特有的。也可人工合成序列2。2、长穗偃麦草E组染色体特异RAPD-SCAR分子标记的建立与定位根据序列表中序列2的序列，利用I^rimer Premier 5. 0软件，设计了 1对SCAR引 物。SCAR807 上游引物5，-GGCACGGTAAGTGTCAAG-3，(序列 3)SCAR807 下游引物5，-GATACGTTGCCACAGTCC-3，(序列 4)反应体系为20μ 1，将RAPD扩增条件调整为正反向引物各0.5μ 1，退火温度为
57°C, 35个循环外，其他同RAPD分析。PCR扩增体系Template DNA50ngIOx PCR buffer2. 5 μ 11. 5mMMgCl2 (终浓度为 0. 18mM)2. 5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM,终浓度为 0. 18mM)1· 5 μ 1SCAR807 上游引物(10 μ Μ,终浓度为 0. 5 μ Μ)0. 5 μ 1SCAR807 下游引物(10 μ Μ,终浓度为 0· 5 μ Μ)0. 5 μ 1
r Taq polymerase (5U/ μ 1，终浓度为 0. 06U/ μ 1)0. 25 μ 1
Distilled sterile waterup to 20 μ 1IOx PCR buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号RlOTl。分别以二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草、普通小麦“中国春”和“中国春”-杀 配子染色体2C 二体附加系的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
结果如图2所示，其中，1-7分别为“中国春”-长穗偃麦草二体附加系(1E-7E) 1.为CS-IE 二体附加系；2.为CS-2E 二体附加系；3.为CS-3E 二体附加系；4.为CS-4E 二 体附加系；5.为CS-5E 二体附加系；6.为CS-6E 二体附加系；7.为CS-7E 二体附加系；8.为 普通小麦“中国春”CS ;9.为二倍体长穗偃麦草；10.为四倍体长穗偃麦草；11.为“中国 春”-杀配子染色体2C 二体附加系；M.为DL2000marker。从图中看出，在“中国春”-长穗 偃麦草二体附加系(1E-7E)、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草中都能扩增出807bp片 段，而在“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系中没有此片段。测序807bp的 片段，结果为该片段具有序列表序列2自5’末端第观7-1093位核苷酸，表明该片段为长穗 偃麦草E基因组所特有。同时还利用一套“中国春”-长穗偃麦草二体附加系(1E-7E)将该对SCAR引物进 行初步定位分析，结果显示，SCAR807标记分布于长穗偃麦草E基因组所有染色体上。实施例2、长穗偃麦草E组染色体特异RAPD-SCAR分子标记的应用用SCAI 8(17上游引物和SCAI 8(17下游引物对“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加系 与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交后代F1和F1自交得到的F2代进行了鉴定。 以普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、二倍体长穗偃麦草、四倍体 长穗偃麦草为对照。结果如图3所示，其中1-9为“中国春”-长穗偃麦草3E二体附加系和“中国春”-杀 配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代；10-19为F1代自交获得的F2代；20为普通小 麦“中国春”;21为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系；22为二倍体长穗偃麦草；23 为四倍体长穗偃麦草；M为DL2000marker。从图中可以看出，SCAR8tl7标记在F1代均表现为阳性结果(得到807bp的片段)。为 了在后代中进行易位系的初步筛选和鉴定，选取76株“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加 系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系的自交F2代进行上述PCR鉴定，结果为阴性、 阳性结果同时存在，有4株2n = 42的后代在SCAR8tl7标记中出现了阳性结果(得到807bp 的片段)，所以可以初步判断这些植株为易位系，易位的几率约为5. 26% (杀配子染色体2C 是一种可以诱导染色体产生畸变的特殊染色体，它可以使不含有它的配子产生致死或半致 死的效应，半致死的效应就包括如染色体的易位、缺失等染色体畸变，达到创制易位系或缺 失系的目的，这是一种诱导染色体产生畸变的一种方式，但2C产生的这些畸变行为完全是 随机的。目前有实验证明此种诱导染色体产生畸变的频率一般在5% 10%左右，因此本 发明的易位的几率在理论值范围内)。利用SCAR8tl7分子标记能够快速、准确地鉴定小麦遗传背景下的外源长穗偃麦草E 组染色质或染色体，这样可以大大提高育种速度，缩短育种周期，实现了利用分子标记辅助 选择育种的目的。
权利要求
1.一种检测植物E组染色体的试剂盒，包括如下引物对所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条 引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述植物为含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物，所述含有长穗偃麦草 E组染色质或染色体的小麦属植物具体为“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加系和“中国 春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
3.一种检测植物E组染色体的PCR试剂，由如下引物对、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶和 PCR缓冲液组成所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条 引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5μΜ ；所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中 的浓度为0. 06U/y 1 ；所述氯化镁在所述的PCR试剂中的浓度为0. ISmM ；所述植物为含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物。
5.根据权利要求3或4所述的PCR试剂，其特征在于所述含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物为“中国春”-长穗偃麦草3Ε 二体附加系和“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代和/或所述F1代自 交得到的F2代。
6.权利要求1或2所述试剂盒或权利要求3-5中任一所述的PCR试剂在检测长穗偃麦 草E组染色体中的应用。
7.一种辅助检测待测植物中是否含有E组染色体的方法，包括如下步骤用权利要求1 或2所述试剂盒中的引物对或权利要求3或4中所述的PCR试剂对待测植物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小为807bp的片 段，则所述待测植物中候选含有E组染色体，若所述PCR扩增产物中不含有大小为807bp的 片段，则所述待测植物中候选不含有E组染色体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中，以待测植物的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为57°C。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第观7-1093位核苷酸。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述检测所述PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种长穗偃麦草E组染色体特异RAPD-SCAR分子标记。提供了一种检测植物E组染色体的试剂盒，包括如下引物对所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。小麦外源E染色质的检测是鉴定小麦-长穗偃麦草重组系、渐渗系的关键，大量杂交后代的筛选和鉴定工作非常繁杂，本发明的实验证明，本发明开发的SCAR分子标记能够为快速、准确地鉴定小麦遗传背景下的外源长穗偃麦草E组染色质或染色体奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK102127597SQ201010594469
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者刘春影, 徐国辉, 束永俊, 苏文悦, 郭长虹 申请人:哈尔滨师范大学