专利名称：诱导性多能干细胞的制备方法以及用于制备诱导性多能干细胞的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及诱导性多能干细胞的制备方法以及用于制备诱导性多能干细胞的培养基。
背景技术：
胚胎干细胞来源于早期胚胎的内细胞团，在体外培养中能够自我更新、保持多能性并具有向三个胚层细胞分化的能力。随着1981年小鼠胚胎干细胞和1998年人的胚胎干细胞的建系成功[1，2]，再生医学的研究真正地拉开了序幕。胚胎干细胞的应用前景主要是用于移植治疗，以胚胎干细胞作为起始细胞，通过体外培养及定向分化，可以为临床治疗提供大量的组织和器官的移植材料。通过对于胚胎干细胞自我更新和定向分化机制的研究， 许多特异性的细胞类型(例如，神经细胞、心肌细胞等)已经具备了成熟的分化方法的检测标准，这些研究为帕金森氏病、老年痴呆症、心肌损伤、糖尿病、肝硬化等疾病的治疗带来了希望。然而，胚胎干细胞真正从体外研究到进入临床应用还面临许多技术和伦理问题，比如，如何获得无免疫排斥的胚胎干细胞？如何获得病人自身的胚胎干细胞？等等。2006年，Yamanaka实验室首先报道可以利用过表达0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc四种转录因子使小鼠的成纤维细胞逆分化成具有胚胎干细胞特性的细胞，并将其命名为诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCells) [3]。在这篇发表在《Cell》 杂志上的文章中，研究人员最初是选取了 M个与胚胎干细胞信号调控相关的基因作为候选基因，以逆转录病毒为基因转染载体，用混合有多种不同基因的病毒感染小鼠成纤维细胞，最终以细胞形态学特征、胚胎干细胞特定基因的表达以及畸胎瘤的形成等指标作为iPS 细胞多能性的鉴定指标。他们在实验中最终将M个候选基因减少到0ct4、Sox2、Klf4和 c-Myc这四个转录因子。虽然在这篇文章中，研究人员最终没有得到嵌合体小鼠，但是直接从已分化的细胞得到干细胞为胚胎干细胞领域甚至生命科学领域都带来了概念性的革新。 iPS细胞诱导技术的出现也引起了人们对其生物医学应用的极大关注，因为我们可以病人的体细胞为来源得到病人特异的iPS细胞，这种iPS细胞又可以分化为具有功能的细胞、组织和器官，用于疾病治疗。这样的应用方式可以避免免疫相容性和伦理问题。2007年，三个不同的实验室均发表文章报道获得了具有种系嵌合能力的小鼠iPS 细胞W-6]。在此之后，也陆续有实验室报道获得了人的iPS细胞[7，8]。2009年，研究人员首次利用iPS细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，证明了 iPS细胞具有真正的全能性[9]。iPS作为诱导产生多能性干细胞的一种技术，在临床疾病治疗方面的应用价值是巨大的，因为它不像传统的核移植或者细胞融合等获取干细胞的方式那样需要人的卵子或人的胚胎干细胞，并且它由成体细胞重编程为干细胞的特性避免了免疫排斥使得自体移植变得更加可行；另一方面，iPS对于干细胞自我更新机制的研究、干细胞信号调控的研究以及很多疾病的研究都有很大意义。但是，iPS细胞的应用仍然有两大问题，安全问题和诱导效率问题。在生物安全问题方面，最初实验体系中过表达的外源基因中含有两个癌基因(c-Myc和Klf-4)，并且外源基因的导入方式是逆转录病毒，病毒在基因组中有多个拷贝的插入也会导致基因突变及癌变。因此，研究人员正在致力于优化iPS技术使其应用的安全性增加，例如，减少转录因子的数目[10，11]，或者使用非整合到基因组的基因转染方法[12]，还有直接添加透膜的转录因子蛋白的形式进行重编程[13]。但是，这些方法会导致iPS细胞的诱导效率更加低下， 目前iPS细胞的形成效率一般都低于1 %，这对iPS细胞的发展和应用造成了巨大障碍。因此，寻找能够提高iPS细胞诱导效率的培养条件、方法或小分子化合物，对推动iPS细胞的基础研究和临床应用将有巨大帮助。
发明内容
因此，针对现有技术中存在的问题，本发明人进行了广泛和深入的研究，最终完成本发明。为了提高iPS细胞的诱导效率，本发明提供了一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法包括以下步骤步骤1，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；步骤2，使用添加了锂盐的培养基培养步骤1中导入了干细胞多能性因子的体细胞；以及步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。优选地，所述方法进一步包括将报告基因导入体细胞以此通过报告基因来指示所述诱导性多能干细胞的产生及其产生效率。且更优选地，所述报告基因为0ct4-GFP或 Nanog-GFP，且更优选为 0ct4_GFP。优选地，在步骤1中，将所述干细胞多能性因子的cDNA以病毒感染方式导入小鼠胚胎成纤维细胞。优选地，在步骤1中，所述干细胞多能性因子可选自0ct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、 Klf5、Nanog、c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lir^8和Esrrb中。且更优选地，所述干细胞多能性因子可包括0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc。且更优选地，所述干细胞多能性因子可包括0ct4、Sox2 和 Klf4。优选地，在步骤2中，所述锂盐包括氯化锂、碳酸锂、醋酸锂、溴化锂、门东氨酸锂、 Y亚麻酸锂、肝素锂、硫酸锂、硝酸锂等所有包含锂离子的化学品。更优选地，在步骤2中，所述锂盐为氯化锂。优选地，所述锂盐的工作浓度为0. l_40mM。更优选地，所述锂盐的工作浓度为 0. 5-20mM。且更优选地，所述锂盐的工作浓度为Ι-lOmM。且更优选地，所述锂盐的工作浓度为5-10mM。且最优选地，所述锂盐的工作浓度为10mM。步骤2中使用的培养基可为添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM(DulbCC0’ s Modified Eagle's Medium) (mES培养基)以及添加有15%替代血清、lOOOU/mL白血病抑制因子(LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的Knockout DMEM (KSR 培养基)。优选地，所述步骤2具体包括如下步骤
将步骤1中制备的导入了四因子(0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc)或三因子(0ct4、 Sox2、Klf4)的小鼠胚胎成纤维细胞在第二天消化并接种到饲养层细胞中使用mES培养基培养，并在第三天使用添加了锂盐的mES培养基培养，在第六天换为添加锂盐的KSR培养基培养，在第八天换为KSR培养基继续培养；以及挑选具有良好干细胞形态或0ct4_GFP阳性的克隆进行传代。“良好干细胞样形态”是指与小鼠干细胞形态相似的克隆。“0ct4_GFP阳性”是指转基因0ct4-GFP报告基因阳性的克隆。0ct4是干细胞特异性基因，其表达比较真实地表征小鼠胚胎成纤维细胞已经重编程为干细胞。步骤3中，鉴定诱导多能性干细胞克隆包括AP染色，内源0ct4表达检测，荧光定量PCR检测多能性标志物表达水平，外源病毒基因的沉默，畸胎瘤的形成，嵌合体的形成， 以及是否有生殖系传递(germ line transmission)。本发明的方法中，优选地，所述体细胞来自哺乳动物的体细胞。且更优选地，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、猪、羊、牛、猴或人。此外，本发明提供了一种用于制备诱导性多能干细胞的培养基，其进一步包含锂
Τττ . ο优选地，所述锂盐包括氯化锂、碳酸锂、醋酸锂、溴化锂、门东氨酸锂、Y亚麻酸锂、 肝素锂、硫酸锂、硝酸锂等所有包含锂离子的化学品。且更优选地，所述锂盐为氯化锂。优选地，所述锂盐的工作浓度为0. l_40mM。更优选地，所述锂盐的工作浓度为 0. 5-20mM。且更优选地，所述锂盐的工作浓度为Ι-lOmM。且更优选地，所述锂盐的工作浓度为5-10mM。且最优选地，所述锂盐的工作浓度为10mM。锂盐浓度超过40mM时，长期培养将导致细胞死亡；锂盐浓度低于0. ImM时，不能显著增加iPS细胞的诱导效率。优选地，所述培养基为添加了锂盐的mES培养基和添加了锂盐的KSR培养基。本发明的锂盐能高效产生iPS细胞。流式细胞计数实验计算效率显示添加锂盐的实验组比对照组提高约5倍(转导四因子实验)和60倍(转导3因子实验)。在iPS诱导过程中添加锂盐也可以加快重编程的过程，添加锂盐的实验组在感染第8天即可检测到 0ct4-GFP阳性的克隆，而对照组一般要到10天以后才能检测到0ct4-GFP阳性的克隆。利用锂盐诱导的iPS细胞具有良好的全能性，转导四因子或三因子的iPS克隆均能形成嵌合体小鼠，其中四因子iPS的嵌合体小鼠实现了生殖系传递，并产下后代。本发明提供的高效诱导iPS细胞的方法对推动iPS的基础研究和临床应用有着重要的意义。
图1为利用添加锂盐的干细胞培养基促进iPS细胞的形成的实验操作流程图。图2显示了添加锂盐的干细胞培养基提高四因子(0Ct4、SOX2、Klf4、C-MyC)诱导 iPS效率并加快iPS诱导进程。A为显示感染后第10天96孔板内一孔的代表性图像的照片，其中，IOmM LiCl处理的孔中出现较多的Oct-GFP阳性克隆；B为显示对Oct-GFP阳性克隆的统计数据的图，在感染后第8天，LiCl处理的孔中即能观察到10个左右Oct-GFP阳性克隆，而对照孔则没有 ’第10天，LiCl处理的孔中的Oct-GFP阳性克隆数能达到20个左右。*，ρ < 0. 05 ；C为显示添加不同浓度LiCl的Oct-GFP阳性克隆的统计数据的图，可以观察到明显的剂量效应，其中LiCl浓度为IOmM时效果最为显著。*，ρ < 0. 05图3显示了流式细胞仪检测锂盐提高四因子诱导iPS效率。A为显示了感染后第 12天细胞消化后经流式细胞仪分析的GFP阳性细胞百分比的图；B为显示了 3次独立实验统计数据的图。#*，p<0.001。图4显示了添加锂盐的干细胞培养基提高三因子(0ct4、Sox2、Klf4)诱导iPS效率。A为显示了对Oct-GFP阳性克隆的统计数据的图，在感染后第14天，5mM或IOmM的LiCl 均能显著提高iPS诱导效率；B为显示了感染后第16天细胞消化后流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分比的图。*，ρ < 0. 05，**，ρ < 0. 01。图5显示了碱性磷酸酶染色及免疫荧光染色。上半部分显示在iPS细胞系具有类似胚胎干细胞的形态，强烈的表达0ct4-GFP，碱性磷酸酶染色呈阳性并且均一。下半部分为干细胞特异性蛋白Nanog和SSEA-I的免疫荧光染色，iPS细胞系表达这两种干细胞特异性蛋白。图6显示了荧光定量PCR检测干细胞特异基因的表达和外源病毒基因的沉默。A、 以小鼠胚胎成纤维细胞为阴性对照，小鼠胚胎干细胞系E14细胞为阳性对照，检测干细胞特异基因的表达。所有四因子及三因子加锂盐诱导的iPS克隆均高表达干细胞特异基因， 包括内源0ct4、内源S0X2、Nan0g和Rexl ；B、以病毒感染后4天的小鼠胚胎成纤维细胞为阳性对照，ES细胞为阴性对照，检测外源病毒基因的沉默。所有四因子及三因子加锂盐诱导的iPS克隆均显示良好的外源病毒基因沉默。图7显示了四因子加锂盐诱导的iPS形成畸胎瘤实验。由组织结构判断，iPS细胞系能够分化形成三个胚层的特有组织，左侧为属于外胚层的表皮样结构，中间为属于中胚层的软骨样及肌肉样结构，右侧为属于内胚层的消化道管腔结构。图8显示了四因子加锂盐诱导的iPS细胞形成嵌合体及生殖系传递实验。左侧为 4因子加锂盐处理得到的iPS细胞系具有生殖系传递能力，右侧为3因子加锂盐处理得到的 iPS细胞系具有嵌合体形成能力。
具体实施例方式定义和技术除非另外指明，本发明的实验使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第三版 0002) ；Current Protocols inMolecular Biology (F. Μ. Ausubel 等人编著(1987))；丛书 Methods inEnzymology(酶学方法)(Academic Press, Inc.)； PCR2 :A Practical Approach (PCR 实验方法)(Μ. J. MacPherson, B. D. Hames 禾口 G. R. Taylor 编著，(1995)) ；Antibodies, A Laboratory Manual and Animal Cell Culture(抗体实验手册及动物细胞培养)(R. I. Freshney编著，(1987)) ；Handbook of StemCells (干细胞手册)，卷2(W. French等人编著)。除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。本文所述的“诱导性多能干细胞”(iPS细胞)是这样的细胞，其来源是体细胞通过导入干细胞多能性因子在体外重编程而成。这样的细胞在胚胎干细胞(EQ培养条件下，与 ES细胞在细胞形态、生长特性、特异性基因表达、DNA甲基化方式等性质均与小鼠ES细胞非常相似，而且在畸胎瘤形成、嵌合体动物形成和生殖系传递等方面也与小鼠ES细胞非常相似。本文所述的“诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子”是维持干细胞多能性的关键因子，通过向体细胞导入这些因子可以诱导体细胞重编程为干细胞。已有多篇文献报导了多个这样的可以诱导重编程的因子[14-18]。优选地，所述的多能性因子包括选自0ct4、 Sox2 (或 Soxl)、Klf4 (或 Klf2 或 Klf5)、Nanog、c_Myc (或 L-Myc 或 N-Myc)、Lin28 及 Esrrb 中的一个或多个。上述干细胞多能性因子可以根据需要来源于任何物种，优选为小鼠的干细胞多能性因子。本文所述的“诱导重编程”(有时也仅被简化为“诱导”)是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子的cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化为多能干细胞。其中，优选地，所述的多能性因子包括选自0ct4、 Sox2 (或 Soxl)、Klf4 (或 Klf2 或 Klf5)、Nanog、c_Myc (或 L-Myc 或 N-Myc)、Lin28 及 Esrrb 中的一个或多个。将所述干细胞多能性因子的cDNA导入体细胞的方法可采用多种方法，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、粒子轰击、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导等的各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染。所述病毒载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒等多种病毒载体。优选地，使用逆转录病毒载体(PMX载体)。本文所述的“培养基”可为添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM(DulbCC0’ s Modified Eagle's Medium) (mES培养基)以及添加有15%替代血清、lOOOU/mL白血病抑制因子(LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的Knockout DMEM (KSR 培养基)。本发明所述的“报告基因”是指能够指示细胞已经转变到类似胚胎干细胞的阶段， 包括利用转基因或同源重组手段加入一段荧光蛋白序列或针对抗生素的抗性基因序列，这段序列处于胚胎干细胞特异表达的一些基因的启动子控制下，故而可以在细胞到达类似胚胎干细胞状态时激活这段荧光蛋白或抗性基因的表达，从而使这个细胞具有某些可以被检测的特征。本实施例中使用的小鼠胚胎成纤维细胞为0G2(0ct4-GFP+勺细胞，分离自纯合 0G2(0ct4-GFP+/+)雄鼠与1 母鼠交配产生的13. 5天的胚胎。本发明所述的检测细胞多能性的方法是本领域技术人员熟知的，包括AP染色，细胞荧光染色，荧光定量PCR分析干细胞特异基因表达及病毒基因的沉默，分析体内分化为畸胎瘤的能力，嵌合鼠的形成及生殖系的传递。实施例下列实施例举例说明了发明人的标准实验室实践，用于示范本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。本发明中所用技术概述除了特别说明，本说明书中提及的各种物质均购自Invitrogen。反转录病毒生产以及产生iPS细胞的实验过程如下
从Addgene公司购置包含小鼠0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc的cDNA的反转录病毒载体 (pMXs)。使用Fugene HD (罗氏)按其产品说明书进行转染至PlatE细胞以产生病毒，48小时后收集病毒上清液并且过滤，补充1，5_ 二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(8mg/ L)后感染小鼠胚胎成纤维细胞。添加病毒上清液的当天被定义为第0天。将病毒感染后的成纤维细胞培养在mES培养基中，在感染后14-18天G因子感染实验)或20-M天(3因子感染实验)挑取iPS集落，这是基于Oct-GFP的表达和典型的干细胞形态来挑取的。重编稈效率的定量的实验过稈如下用于计算重编程效率的主要方法是计数Oct-GFP阳性克隆1.利用流式细胞仪对四因子感染后10-12天或三因子感染后14-16天的iPS细胞测定Oct-GFP阳性的细胞比例； 2.在原孔中直接用荧光显微镜计数Oct-GFP阳性克隆数。iPS细胞的鉴定实验过稈如下进行碱性磷酸酶染色、干细胞标记蛋白荧光染色、鉴定多能性基因的表达、病毒基因的沉默、畸胎瘤的形成、嵌合体的形成及生殖系传递[19，20]。实施例1 添加了锂盐的干细胞培养基能促进四因子诱导的iPS的形成a.将四因子(0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的病毒以等体积混合，感染到6孔板的一孔中共计18万个0G2小鼠胚胎成纤维细胞中，在371、5%0)2的环境中培养在添加了 10% 胎牛血清的DMEM培养基中。以加入病毒当天为第0天，第2天将细胞消化并重悬于mES培养基中，并种在预先种满饲养层细胞(放射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞)的96孔板中， 每孔5000个细胞，第3天开始使用添加了不同浓度LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)的mES培养基，第6天开始换为添加了不同浓度LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)的KSR培养基，第8天开始再换为KSR培养基培养，整个过程如图 1所示。b.使用如a所述的方法，从第8天开始，每天在倒置荧光显微镜下观察并计数 Oct-GFP阳性克隆数，同时使用荧光显微镜拍照。图2A为第10天时96孔板中代表性的图片，可以看到IOmM LiCl处理的孔相对于不处理的孔，有更多Oct-GFP阳性的克隆。图2B 是对Oct-GFP阳性克隆的统计数据。第8天时，对照孔几乎看不到Oct-GFP阳性克隆，而 IOmM LiCl处理的孔可以观察到10个左右克隆。而到第10天，IOmM LiCl处理的孔可以观察到20个左右克隆，其效率是对照组的5-6倍。图2C是用不同浓度的LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)处理之后出现的阳性克隆数，可以发现明显的剂量效应曲线，其中LiCl浓度为IOmM时效果最为显著。c.使用如a所述的方法，在第12天消化细胞，利用流式细胞仪检测Oct-GFP阳性的细胞比例。图3A为代表性的流式数据图；图:3B是对3次实验的统计数据，显示在四因子诱导条件下，IOmM LiCl处理可提高iPS诱导效率5_6倍。实施例2 添加锂盐的干细胞培养基能促进三因子诱导的iPS的形成a.将三因子(0ct4、Sox2、Klf4)的病毒以等体积混合，感染到6孔板的一孔中共计18万个0G2小鼠胚胎成纤维细胞中，在37°C、5% CO2的环境中培养在添加了 10%胎牛血清的DMEM培养基中。以加入病毒当天为第O天，第2天将细胞消化并重悬于mES培养基中，并种在预先种满饲养层细胞(放射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞)的96孔板中，每孔 5000个细胞，第3天开始使用添加了不同浓度LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)的mES培养基，第6天开始换为添加了不同浓度LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)的KSR培养基，第8天开始再换为KSR培养基培养，整个过程如图1所
7J\ οb.使用如a所述的方法，从第12天开始，每天在倒置荧光显微镜下观察并计数 Oct-GFP阳性克隆数，同时使用荧光显微镜拍照。如图4A所示，第14天时，与对照组相比， 添加5mM或IOmM LiCl均能够显著提高iPS效率，其中添加IOmM LiCl的效率可增加7倍
左右οc.使用如a所述的方法，在第16天消化细胞，利用流式细胞仪检测Oct-GFP阳性的细胞比例。如图4B所示，对照组的Oct-GFP阳性的细胞比例仅为0. 24%。而添加IOmM LiCl的实验组的Oct-GFP阳性细胞比例可达到14. 5%，增加了近60倍。实施例3 添加锂盐得到的iPS细胞系具有多能性a.如上所述，用 4 因子(0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc)或 3 因子(0ct4、Sox2、Klf4) 感染小鼠胚胎成纤维细胞，在添加LiCl的干细胞培养基中培养，感染后14天G因子)或 20天(3因子)，根据克隆形态及荧光表达挑取具有代表意义的克隆团，经过传代后形成均勻的iPS细胞系。b.对于挑选出来的iPS细胞系进行形态观察，并进行干细胞特异性蛋白的染色。 如图5所示，iPS细胞系具有类似胚胎干细胞的特征形态，强烈表达Oct-GFP的绿色荧光， 并且碱性磷酸酶(AP)呈阳性。使用针对干细胞特征蛋白的抗体对iPS细胞进行免疫荧光染色，结果表明iPS细胞系均表达干细胞特异性蛋白Nanog和SSEA-1。c.在提取RNA之前，利用差速贴壁法去除滋养层细胞，使用Trizol (Invitrogen公司)试剂，按照制造商说明提取iPS细胞的总RNA。用I^rimeScriptTM试剂盒(Takara公司)进行逆转录，并使用JumpMartTMTaq ReadyMix 试剂盒(Sigma公司)，Mx 3000P荧光定量PCR仪(ABI公司)进行Real-Time PCR分析。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件，按照制造商说明进行。其中鉴定iPS特异基因使用的引物列表如表1所示。[表1]
权利要求
1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法包括以下步骤 步骤1，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；步骤2，使用添加了锂盐的培养基培养步骤1中导入了干细胞多能性因子的体细胞；以及步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包括将报告基因导入体细胞，以此报告基因来指示所述诱导性多能干细胞的产生及其产生效率。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述报告基因为0ct4-GFP或Nanog-GFP，且优选为 0ct4-GFP。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1中，所述干细胞多能性因子选自0ct4、 Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog、c_Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28 和 Esrrb 中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤1中，所述干细胞多能性因子包括0ct4、 Sox2、Klf4 和 c-Myc,或者包括 0ct4、Sox2 和 Klf4。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述锂盐包括氯化锂、碳酸锂、醋酸锂、溴化锂、门东氨酸锂、Y亚麻酸锂、肝素锂、硫酸锂、硝酸锂及其它包含锂离子的化学品。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述锂盐为氯化锂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述锂盐的工作浓度为0.l-40mM, 且优选为0. 5-20mM，更优选为5-10mM，最优选为10mM。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述培养基为mES培养基和KSR培养基，所述mES培养基为添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM，且所述KSR培养基为添加有15%替代血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β -巯基乙醇的 Knockout DMEM。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2进一步包括将步骤1中制备的导入了 0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子或0ct4、Sox2、Klf4三因子的小鼠胚胎成纤维细胞在第二天消化并接种到饲养层细胞中使用mES培养基培养，并在第三天使用添加了锂盐的 mES培养基培养，在第六天换为添加锂盐的KSR培养基培养，在第八天换为KSR培养基继续培养；以及挑选具有良好干细胞形态或0ct4-GFP阳性的克隆进行传代。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述体细胞来自哺乳动物的体细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、猪、羊、牛、 猴或人。
13.一种用于制备诱导性多能干细胞的培养基，其进一步包含锂盐。
14.根据权利要求13所述的培养基，其中，所述锂盐包括氯化锂、碳酸锂、醋酸锂、溴化锂、门东氨酸锂、Y亚麻酸锂、肝素锂、硫酸锂、硝酸锂及其它包含锂离子的化学品。
15.根据权利要求13所述的培养基，其中，所述锂盐为氯化锂。
16.根据权利要求13所述的培养基，其中，所述锂盐的工作浓度为0.l_40mM，且优选为 0. 5-20mM，更优选为5-10mM，最优选为10mM。
17.根据权利要求12所述的培养基，其中，所述培养基为添加了锂盐的mES培养基和添加了锂盐的KSR培养基。
全文摘要
本发明提供了一种诱导性多能干(iPS)细胞的制备方法，该方法包括以下步骤步骤1，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；步骤2，使用添加了锂盐的培养基培养步骤1中导入了干细胞多能性因子的体细胞；以及步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。此外，本发明还提供了一种用于制备诱导性多能干细胞的培养基，其进一步包含锂盐。本发明将含有锂盐的培养基应用于高效产生诱导多能干细胞中。在本发明中，锂盐能够使小鼠iPS细胞的产生效率提高5-60倍。本发明提供的高效率诱导iPS细胞的方法对iPS技术安全性的提高和iPS细胞在再生医学领域的应用有重要意义。
文档编号C12N5/074GK102559587SQ20101059484
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者王荃, 谢欣 申请人:中国科学院上海药物研究所