专利名称：一种检测甾体类激素及多环芳烃的高效微生物荧光传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学及微生物学技术领域。
背景技术：
伴随着工、农、畜牧业的快速发展，留体类激素和多环芳烃类物质造成的环境和食 品污染日益严重，给人类生活健康带来了巨大危害。如何快速、高效的检测这两类污染物倍 受国内外政府部门和相关研究机构的关注。目前，环境、食品中留体类激素及多环芳烃污染 物检测方法主要为化学和生物两大类前者多为色谱及质谱法，仪器设备大型昂贵，检测样 品单一，样品前处理复杂，而且无法检测未知污染物；某些生物学检测方法如细胞增值实验 等，过程繁琐、耗时长、成本高，检测样品单一，对检测环境、实验人员要求严格。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测留体类激素及多环芳烃的高效微生物荧光传感 器，将质粒ρΚ-3 α -GFP3和ρ6共转化进大肠杆菌中，建立了一种绿色荧光蛋白标记的微生 物荧光检测系统，检测对象为留体类激素和多环芳烃两大类物质。本发明的技术方案是本发明构建了基于睾丸酮丛毛单胞菌(C. testosteroni, C. T)的甾体类激素及多 环芳烃微生物荧光检测系统。睾丸酮丛毛单胞菌能够以睾丸酮等留体类激素作为唯一碳源 和能源，还能降解非固醇类的多环芳烃等物质，通过3 α-羟类固醇脱氢酶(3CI-HSD)等酶 的代谢，消化这类底物。绿色荧光蛋白(GFP)是近年来广泛应用于生物学标记领域的报告 基因，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光，根据其荧 光强度通过对照标准曲线可以计算出特异底物的相对含量。本发明将质粒ρΚ_3α -GFP3和ρ6共转化进大肠杆菌中，建立了一种绿色荧光蛋白 标记的微生物荧光检测系统。在重组质粒ρΚ-3 α-GFP3的顺势β -半乳糖苷酶(LacZ)启 动子基因(见序列1)下游依次插入了 3 α -HSD启动子等调控序列(见序列2)470碱基对 及GFP报告基因(见序列3) 717碱基对；重组质粒ρ6含有3 α -HSD全部调控基因(见序列 4)，共5257碱基对。当环境中存在雌激素等底物时，可以诱导ρ6质粒上3 α -HSD的调控序 列表达调控作用的蛋白，该蛋白可使质粒ρΚ-3 α -GFP3上的启动子启动进而表达出GFP蛋 白，此时GFP的表达量严格受到诱导底物量的控制。质粒ρΚ-3 α -GFP3中顺势LacZ启动子基因能够作用于其本身质粒中的3 α -HSD 的调控序列和启动子基因，促进其后的绿色荧光蛋白大量表达，对荧光信号具有放大、增强 作用。根据该荧光传感器的荧光强度大小，通过对照标准曲线可以计算出特异性底物的相
对含量。本发明的构建方法是1.将质粒ρΚ-3 α -GFP3和ρ6共转化入大肠杆菌，经过双抗性筛选得到一株重组大 肠杆菌BL21-GFP，
(1)取新鲜制备的感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。(2)加入质粒 ρΚ-3 α -GFP3 和 ρ6，冰浴。(3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。(4)加37°C预热的培养基，在37°C恒温振荡摇床中，120转每秒培养60分钟以上。(5)将细菌涂布在含有卡那霉素(karmmycin)和氨苄青霉素(ampicillin)双抗性 的LB琼脂平板上。(6)平皿在37°C下正向放置1小时以上，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平皿倒 置，培养12小时以上。(7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌BL21-GFP。2、建立生物荧光标准检测曲线(1)将检测底物标准品用无水乙醇溶解，分别配制浓度为10_6M、10_9M、10_1(iM、 IO-11MzIUO-2M/!的标准检测液。(2)取菌液分别加入标准检测液，空白对照加入无水乙醇，静置，用荧光酶标仪检 测其荧光发光值，建立标准检测曲线。本发明检测对象是甾体类激素和多环芳烃两类物质，样品检测浓度范围为10_12至10_3摩尔每升。本发明的有益效果是1、本发明构建的绿色荧光蛋白标记的微生物传感器进行留体类激素和多环芳烃 的检测，检测范围比其它检测方法高出3个数量级以上，利用质粒ρΤορο-3 α -GFP3对绿色 荧光蛋白的表达具有放大、增强效应，进一步扩大了检测的线性范围(10_15至10_3摩尔每 升)，与原绿色荧光蛋白(GFP)标记的传感器相比，不同留体类激素、多环芳烃的标准检测 液的检测线性范围可高出1到6个数量级。2、利用微生物构建传感器，检测时间较短，60分钟以内即可完成检测。3、以往的检测方法必须在已知检测物质的前提下才能够检测物质的含量，本发明 构建的微生物荧光传感器可以检测环境中未知留体类激素、多环芳烃类物质的含量。4、可应用于环境、食品中所有留体类激素及多环芳烃的检测。具有检测体积小，稳 定、快速、高效的特点。
图1是质粒ρΚ-3 α -GFP3示意图；图2是质粒ρ6示意图；图3是睾丸酮荧光检测结果；图4是雌二醇荧光检测结果；图5是萘荧光检测结果。
具体实施例方式本发明基于3α-羟类固醇脱氢酶(3CI-HSD)调控表达原理，利用重组质粒 ρΚ-3 α -GFP3和ρ6共转化入大肠杆菌，建立一种检测留体类激素和多环芳烃的高效微生物荧光传感器，分别以睾丸酮，雌二醇，萘为例建立标准检测曲线。本方法具有检测时间短(60 分钟之内)，检测范围宽(10_12至10_6摩尔每升)，灵敏度高(10_12级)，操作简便，成本低廉 等明显优点。是检测环境、食品中留体类激素和多环芳烃等物质含量的较好方法。具体技术方案如下1.将质粒ρΚ-3 α -GFP3和ρ6共转化入大肠杆菌，经过双抗性筛选得到一株重组大 肠杆菌BL21-GFP，具有以下特征(1)包含重组质粒ρΚ-3 α -GFP3,其特征是包括顺势β -半乳糖苷酶(LacZ)启 动子基因、3 α-羟基类固醇脱氢酶(3CI-HSD)调控序列及报告基因一绿色荧光蛋白在内的 1190bp碱基对；(2)包含重组质粒p6，其特征是含有3 α -HSD整个5. 2Kb碱基对全序列调控基 因；(3)可被留体类激素和多环芳烃诱导表达绿色荧光蛋白(4)具有卡那霉素(karmmycin)和氨苄青霉素(ampicillin)双抗性。上述重组质粒ρΚ-3 α -GFP3和ρ6为本实验室构建。2.将重组大肠杆菌BL21-GFP在37°C培养至OD595 = 1.0状态，将菌液和样品按一 定比例混合温育，用荧光酶标仪检测其荧光值，制定不同物质的荧光-含量标准曲线。其 中，被测样品包括甾体类激素和多环芳烃两类物质，样品检测范围为10_12至10_3摩尔每 升。荧光检测结果表明本方法对睾丸酮检测范围为10—11至10_6摩尔每升，标准曲线为y =-52. 278x3+657 77x2-1415. 8x+40185,R2 = 0. 9921 ；雌二醇的检测范围为10_12至10_3摩尔每升，标准检测 曲线:y = -170. 92x3+1961. 1χ2-4755χ+39596, R2 = 0. 9969 ；萘的检测范围为 1(Γ12 至 1(Γ6 标准检测曲线:y = -104. 92x3+987. 54x2-1700. 5x+40123, R2 = 0. 9986。实施例1以睾丸酮为例建立生物荧光检测标准曲线1、重组大肠杆菌BL21-GFP的构建(1)取新鲜制备的100 μ L感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。(2)加入质粒ρΚ-3 α -GFP3和ρ6个1· 5 μ L，冰上放置30分钟。(3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。(4)加600 μ L 37°C预热的培养基，37°C，120转每秒振荡培养60分钟；( 将200 μ L细菌涂布在含有卡那霉素(karmmycin)和氨苄青霉素 (ampicillin)双抗性的LB琼脂平板上。(6)平皿在37°C下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，过 夜培养16小时。(7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌BL21-GFP。2、建立生物荧光标准检测曲线(1)将睾丸酮标准品用无水乙醇溶解，分别配制浓度为Io-fiMUO-9MUO-1cKlO-11M/ L、10_2M/L的标准检测液。(2)取100M1 0D595 = 1.0的菌液分别加入2 μ L标准检测液，空白对照加入2 μ L无水乙醇，30°C静置60分钟后，用荧光酶标仪检测其荧光发光值，建立标准检测曲线。荧光检测结果如下表表1.睾丸酮荧光检测结果
权利要求
1.一种检测留体类激素及多环芳烃的高效微生物荧光传感器，其特征是将质粒 ρΚ-3 α -GFP3和ρ6共转化进大肠杆菌中，建立了一种绿色荧光蛋白标记的微生物荧光 检测系统；在重组质粒ρΚ-3 α -GFP3的顺势β -半乳糖苷酶启动子基因下游依次插入了 3 α-HSD启动子等调控序列468碱基对及GFP报告基因722碱基对；重组质粒ρ6含有 3 α -HSD全部调控基因，共5200碱基对；当环境中存在雌激素等底物时，可以诱导ρ6质粒 上3 α -HSD的调控序列表达调控作用的蛋白，该蛋白可使质粒ρΚ-3 α -GFP3上的启动子启 动进而表达出GFP蛋白，此时GFP的表达量严格受到诱导底物量的控制。
2.根据权利要求1所述的一种检测留体类激素及多环芳烃的高效微生物荧光传感器， 其特征是质粒ρΚ-3 α -GFP3中顺势LacZ启动子基因能够作用于其本身质粒中的3 α -HSD 的调控序列和启动子基因，促进其后的绿色荧光蛋白大量表达，对荧光信号具有放大、增强 作用。
3.根据权利要求1所述的一种检测留体类激素及多环芳烃的高效微生物荧光传感器， 其特征是根据该荧光传感器的荧光强度大小，通过对照标准曲线可以计算出特异性底物 的相对含量。
4.根据权利要求1所述的一种检测留体类激素及多环芳烃的高效微生物荧光传感器， 其特征是检测对象是留体类激素和多环芳烃两类物质，样品检测浓度范围为10_12至10_3 摩尔每升。
5.根据权利要求1所述的一种检测留体类激素及多环芳烃的高效微生物荧光传感器， 其构建方法是a、将质粒ρΚ-3α -GFP3和ρ6共转化入大肠杆菌，经过双抗性筛选得到一株重组大肠杆 菌BL21-GFP ；(1)取新鲜制备的感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上；(2)加入质粒ρΚ-3α -GFP3和ρ6，冰浴；(3)42°C水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟；(4)加37°C预热的培养基，在37°C恒温振荡摇床中，120转每秒培养60分钟以上；(5)将细菌涂布在含有卡那霉素(karmmycin)和氨苄青霉素(ampicillin)双抗性的 LB琼脂平板上；(6)平皿在37°C下正向放置1小时以上，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培 养12小时以上；(7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重组大 肠杆菌BL21-GFP ；b、建立生物荧光标准检测曲线(1)将检测底物标准品用无水乙醇溶解，分别配制浓度为IO-6MUO-9MUO-kiMUO-11M/!^ 10_2M/L的标准检测液；(2)取菌液分别加入标准检测液，空白对照加入无水乙醇，静置，用荧光酶标仪检测其 荧光发光值，建立标准检测曲线。
全文摘要
一种检测甾体类激素及多环芳烃的高效微生物荧光传感器，属于分子生物学及微生物学技术领域，其特征是将质粒pK-3α-GFP3和p6共转化进大肠杆菌中，在重组质粒pK-3α-GFP3的顺势β-半乳糖苷酶启动子基因下游依次插入了3α-HSD启动子等调控序列468碱基对及GFP报告基因722碱基对；当环境中存在雌激素等底物时，可以诱导p6质粒上3α-HSD的调控序列表达调控作用的蛋白。有益效果是检测范围比其它检测方法高出3个数量级以上，利用质粒pTopo-3α-GFP3对绿色荧光蛋白的表达具有放大、增强效应，与原绿色荧光蛋白标记的传感器相比，不同甾体类激素、多环芳烃的标准检测液的检测线性范围可高出1到6个数量级。检测时间较短。具有检测体积小，稳定、快速、高效的特点。
文档编号C12N15/65GK102147364SQ20101059509
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者于化东, 于源华, 何秀霞, 侯巍, 张淑华, 杨佳新, 葛淑敏, 马书林 申请人:长春理工大学