专利名称：灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法。
背景技术：
漆酶(EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜的氧化还原酶，属于氧化酶的蓝铜家族(Eur J Biocheml87 :341-352)。漆酶的应用范围很广，目前研究它的应用主要集中在它降解各种化工染料(J Ind Microbiol Biotechnol 31 127-132)、芳香族类化合物(Microbial Cell Factories 5 :31)以及二酚、多酚类化合物(Process Biochemistry 45 :507-513)的功能。 除此之外，漆酶在不同的物种发挥不同的功能在昆虫中，它们参与甲壳的硬化；在植物中，参与细胞壁形成，还与木质素化和去木质素有关；在芽孢杆菌中，则是和抗紫外线的孢子组装有关；在一些植物致病性真菌利用这类酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用。众所周知， 漆酶给工业生产方面带来了巨大的贡献。大量的漆酶基因从植物(J Chem Soc 43:472)、 动物(万云洋，博士论文，武汉大学)和微生物(Microbiology 148 =4003-4014)中分离出来，进行了系统的研究。在NCBI数据库中，收集了很多微生物的全基因组的信息，其中编码蛋白的序列都被注释了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注释蛋白的功能可以完善这些酶学，并运用到工业应用中去。多孔菌科灵芝属于白腐菌担子菌纲家族，是亚洲很受欢迎的药用菌类。它的化学成分较为复杂，含有多糖类、免疫调节蛋白(Phytochemistry 67 =1985-2001)以及抗肿瘤蛋白(Immunol Invest 34 171-198)等。然而来自灵芝的漆酶生理生化特性研究和应用还很少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法，即通过化学合成方法得到所述的漆酶基因，研究其生理生化特性，将其应用于真核生物的表达和纯化中。本发明的技术方案是通过以下方式来实现的。所述的灵芝漆酶基因，来自于灵芝，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，其是通过化学合成方法制得的。即采用大量重叠的引物通过两步 PCR 进行全基因合成(PTDS) (Nucleic Acids Research，2004，32 :e98)。该方法是通过重叠延伸获得合成基因的片段，再通过最外侧的引物将全长的基因扩增得到。该方法的一个明显优势就是不需要对引物进行磷酸化处理。而且通过高通量的DNA合成仪器， 可以较为便利地获得大量的引物。所述的灵芝漆酶基因，其具体合成方法如下1、引物设计设计长度大概为60mer左右的覆盖整个灵芝漆酶基因的寡核苷酸的序列36个，作为引物。每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。利用PCR进行灵芝漆酶基因扩增，在100 μ 1反应体系中，Ρ2-Ρ35共34个引物的添加量为2ng，外侧引物Pl和P36添加量为30ng，扩增条件为:94°C预热Imin ；94°C,30s, 52°C，30s，72°C，1. 5min，72°C lOmin，使用的 Taq DNA 聚合酶为 KOD FX taq 酶 CToyobo 公司，日本)，共30个循环。PCR结束后，1 %琼脂糖胶回收片段，取10 μ 1直接与Τ/Α克隆载体相连(大连宝生物公司)。4°C连接过夜，高效转化于DH5ci感受态中，即获得长度为1512bp的阳性克隆，即为本发明的灵芝漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo 2所示。将上述制得的漆酶基因转入真核生物细胞中。即将上述制得的漆酶基因直接与真核表达载体pYM7909(上海市农科院生物所实验室提供)相连，经过DH5ci克隆过的环形质粒单酶切使其线性化，取约1 μ 1的线性DNA与80 μ 1毕赤酵母感受态细胞混合后进行点击转化，然后涂布于固体SD山梨醇培养基QOg/L琼脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD)上，
继续培养3天后获得白色菌落。挑取经测活呈阳性的毕赤酵母进行细胞外分泌表达纯化，即获得纯化后的灵芝漆酶基因。本发明的灵芝漆酶基因是一类应用非常广泛的生物用酶，通过克隆，可以高效合成本发明的漆酶基因，通过对该基因真核表达和纯化，可以将其应用于灵芝漆酶基因的工业生产中。
图1为本发明的灵芝漆酶基因的化学合成方法策略图。图2为以pYM7909质粒构建DNA表达单元的示意图。图3为酶的最适温度、最适PH及温度和pH的稳定性结果，其中，图A为灵芝漆酶的最适温度；图B为该漆酶最适pH值；图C为该漆酶温度稳定性；图D为该漆酶pH稳定性。图4为金属离子对酶活的影响。图5为有机无机化合物对酶活的影响，其中1.对照，2.硫代硫酸钠，3.叠氮化钠， 4.甘露醇，5.低亚硫酸钠，6. L型-丙氨酸，7. L型-组氨酸，8. L型-甘氨酸，9. L型-精氨酸，10. L型-天门冬氨酸，11. L型-苯丙氨酸。
具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)实施例1灵芝漆酶基因的化学合成参看图1，以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆制备本CN 102533803 A发明的灵芝漆酶基因。设计的引物如下Pl :Tm = 54,60merGCT，GCT，GTC，GTC，GTC，AAT，GGT，GTC，TTC，CCT，GGT，CCA，CTG，ATC，ACT, GGC， AAC，AAG，GGA，GACP2 :Tm = 54,60merTGT，GGT，TGG，TCA，GCT，GGT，CGA，TGA，CGT，TCA，GCT，GGA，ATC，TGT，CTC，CCT， TGT, TGC, CAG, TGAP3 :Tm = 54,60merCGA，CCA，GCT，GAC，CAA，CCA，CAC，CAT, GCT，GAA，GAC，CAC，CTC，CAT, CCA，CTG， GCA，TGG，CTT，CTTP4 :Tm = 54,60merGAT，GAA，GGC，AGG，ACC，ATC，AGC，CCA，GTT，AGT，ACC，TTT，CTG，GAA，GAA，GCC， ATG，CCA，GTG，GATP5 :Tm = 54,60merCTG，ATG，GTC，CTG，CCT，TCA，TCA，ACC，AGT，GTC，CAA，TCG，CTT，CTG，GTC，ATT， CCT，TCC，TGT，ACGP6 :Tm = 54,60merTGA，TAC，CAG，AAG，GTG，CCA，GCT，TGA，TCT，GGA，ACT, TGA，AAG，TCG，TAC，AGG， AAG，GAA，TGA，CCAP7 :Tm = 54,60merGCT，GGC，ACC，TTC，TGG，TAT，CAC，TCT，CAT, CTG，TCT，ACT, CAG，TAC，TGT，GAT， GGT，CTG，AGA，GGTP8 :Tm = 54,60merGAC，CCT，TCA，GAG，GAT，CTT，TAG, GAT，CAT, AGA，CAA，CGA，ATG，GAC，CTC，TCA， GAC，CAT, CAC，AGTP9 :Tm = 54,60merTAA，AGA，TCC，TCT，GAA，GGG，TCT，GTA，CGA，TGT，TGA，TAA，CGA，TTC，TAC，TGT， TAT，CAC，TCT，GTCPlO :Tm = 54,60merGAA，GGA，AGG，TCC，AAG，TCT，GGC，AGC，AAC，ATG，ATA，CCA，GTC，AGA，CAG，AGT， GAT，AAC，AGT，AGAPll :Tm = 54,60merCCA，GAC，TTG，GAC，CTT，CCT，TCC，CAC，TGG，GTT，CTG，ACT, CCA，CTC，TGA，TCA， ATG，GTC，TGG，GTAP12 :Tm = 54,60merTTG，ATG，ACA，GCA，AGA，CCA，GCA，GTA，GCG，TTG，GTG，GTG，GAT，CTA，CCC，AGA， CCA，TTG，ATC，AGAP13 :Tm = 54,60merGCT，GGT，CTT，GCT，GTC，ATC，AAC，GTC，ACC，CAA，GGC，AAG，AGA，TAC，AGA，TTC，AGA，CTG，GTC，TCCP14 :Tm = 54,60merGAC，CAT, CGA，TAG, AGA，AGG，TGT，AGT，TAG, GAT，CAC，AGG，ACA，GGG，AGA，CCA， GTC，TGA，ATC，TGTP15 :Tm = 54,60merCAC，CTT，CTC，TAT，CGA，TGG，TCA，TGA，CAT, GTC，CGT，CAT, CGA，AGC，TGA，TGG， CAT, TGC，TAC，TCAP16 :Tm = 54,60merCTG，AGC，AGA，GAA，GAT，TTG，GAT，AGC，GTT，AGC，AGT，GAC，AGG，TTG，AGT，AGC， AAT，GCC，ATC，AGCP17 :Tm = 54,60merTCC，AAA, TCT，TCT，CTG，CTC，AGA，GAT，ACT, CCT，TCG，TCC，TGA，CTG，CCA，ACC， AGA，CCA，TTG，GCAP18 :Tm = 54,60merCCG，ATG，TTT，CCG，AAG，GAA，GGA，TTG，GCT，CTG，ATC，CAG，TAG, TTG，CCA，ATG， GTC, TGG, TTG, GCAP19 :Tm = 54,60merCCT，TCC，TTC，GGA，AAC，ATC，GGT，TTC，ACC，AAT，GGC，ATC，AAC，TCT，GCC，ATC， CTG，AGA，TAC，TCTP20 :Tm = 54,60merTGG，TCT，GTT，GAG，CAG，TAG, TAG, GTT，CGA，TAG, GAT，CAG，CTC，CAG，AGT，ATC， TCA, GGA, TGG, CAGP21 :Tm = 54,60merTAC，TAC，TGC，TCA，ACA，GAC，CAC，TCA，GAA，CCT，GCT，GAA，CGA，AGT，TGA，TCT， GCA，TCC，ATT，CGTP22 :Tm = 54,60merAGT，ACC，ACC，TTG，AGT，AGC，TCT，ACC，AGG，AGT，CTG，CTT，AGC，AAC，GAA，TGG， ATG，CAG，ATC，AACP23 :Tm = 54,60merGAG, CTA，CTC，AAG，GTG，GTA，CTG，ATG，TTG，CCA，TCA，ACA，TGG，TCT，TCA，ACT, TCA，ATG，GCT，CCAP24 :Tm = 54,60merACA，GTT，GGT，GGA，GTG，AAG，GAA，GCG，TTG，TTG，ATG，AAG，AAG，TTG，GAG，CCA， TTG，AAG，TTG，AAGP25 :Tm = 54,60merTCC，TTC，ACT, CCA，CCA，ACT, GTT，CCT，GTC，CTG，CTT，CAG，ATT，CTG，TCT，GGT， GCA，CAA，GCA，GCTP26 :Tm = 54,60merTAG, GAA，GAG, TGT，AGA，CAG，AGC，CAG，ATG，GAA，GCA，GAT，CCT，GAG，CTG，CTT，GTG，CAC，CAG，ACAP27 :Tm = 54,60merCTC，TGT，CTA，CAC，TCT，TCC，TAT，CAA，CAA，GTC，CAT, CGA，ACT, CAC，CTT，TCC， TGC，TAC，TGT，CAAP28 :Tm = 54,60merGTG，ACC，ATG，CAG，GTG，GAA，TGG，ATG，TGG，AGC，ACC，AGG，AGC，ATT，GAC，AGT， AGC，AGG，AAA, GGTP29 :Tm = 54,60merCAT, TCC，ACC，TGC，ATG，GTC，ACT, CCT，TCG，CTG，TCG，TCA，GAA，GTG，CTG，GTT， CCA，CCG，AGT，ACAP30 :Tm = 54,60merCCA，GTG，GAG，ACG，ACG，TCT，CTC，CAG，ACA，GGG，TTG，TTG，TAG, TTG，TAC，TCG， GTG，GAA，CCA，GCAP31 :Tm = 54,60merAGA，GAC，GTC，GTC，TCC，ACT, GGT，ACT, CCT，GCT，GCT，GGT，GAT，AAC，GTC，ACC， ATC，AGA，TTC，CAGP32 :Tm = 54,60merCGA，TGT，GAC，AAT，GCA，GGA，ACC，AAG，GTC，CAG，GAT，TGT，CAG，TCT，GGA，ATC， TGA, TGG, TGA, CGTP33 :Tm = 54,60merGTT，CCT，GCA，TTG，TCA，CAT, CGA，CTT，TCA，TCT，CGA，AGC，TGG，CTT，TGC，TGT， TGT, CTT, TGC, TGAP34 :Tm = 54,60merCTG，TGG，AAC，ATG，GTT，GGC，AAG，AGA，AGT，GTC，AGC，AGT，GTC，TTC，AGC，AAA, GAC，AAC，AGC，AAAP35 :Tm = 54,60merTTG，CCA，ACC，ATG，TTC，CAC，AGG，CTT，GGT，CTG，ACC，TGT，GTC，CTA，CCT，ACG， ATG，CTC，TCT，CTGP36 :Tm = 54,40merGAG, CTC，TTA，GTG，GTC，GTC，AGC，AGA，GAG，AGC，ATC，GTA，GGT，A利用PCR进行扩增，在100 μ 1反应体系中，Ρ2—Ρ35共34个引物的添加量为 2ng，外侧引物Pl和P36添加量为30ng，扩增条件为:94°C预热Imin ；94°C 30s, 52°C 30s， 72°C 1.5min，72°C lOmin，使用的 iTaq DNA 聚合酶为 KOD FX taq 酶 CToyobo 公司，日本)，共 30个循环。PCR结束后，琼脂糖胶回收，取10 μ 1直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4°C连接过夜，高效转化DH5ci感受态中。获得阳性克隆，即为本发明的灵芝漆酶基因，其序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。将该SEQ ID No 1序列与来自灵芝的漆酶基因相比对，同源性为75.对％，具体如下1 GCTGCTGTCGTCGTCAATGGTGTCTTCCCTGGTCCACTGATCACTGGCAACAAGGGAGAC
Il Il Il Il Il 111111111111111 Il Il mil Il IIIIIIIIII130 GCCGCCGTTGTGGTGAATGGTGTCTTCCCTGGGCCGCTCATCACAGGGAACAAGGGAGAC61 AGATTCCAGCTGAACGTCATCGACCAGCTGACCAACCACACCATGCTGAAGACCACCTCCι IIIIIIIII IIIIIIIII Illll Illlll 1111111111111190 CGTTTCCAGCTGAATGTCATCGACCAACTGACGAACCACACAATGCTGAAGACCACCAGC121 ATCCACTGGCATGGCTTCTTCCAGAAAGGTACTAACTGGGCTGATGGTCCTGCCTTCATCIl Il IIIIIIIII ΜΙΝΙ Il Il ΜΙΝΙ ΜΙΝΙ Il Mill250 ATTCATTGGCATGGCTTTTTCCAGAAGGGCACGAACTGGGCGGATGGTCCCGCGTTCATC181 AACCAGTGTCCAATCGCTTCTGGTCATTCCTTCCTGTACGACTTTCAAGTTCCAGATCAAIIIIIIIII Il III Il Il Il III III Il Il III III310 AACCAGTGTCCGATTGCTAGCGGGCACTCGTTCCTCTACGATTTCCAGGTTCCGGATCAG241 GCTGGCACCTTCTGGTATCACTCTCATCTGTCTACTCAGTACTGTGATGGTCTGAGAGGTIl III Il III IIIIII Il Il IIIIIIIII III Il Il370 GCCGGCACTTTTTGGTACCACAGCCATCTCTCCACGCAGTACTGTGACGGTCTCAGGGGT301 CCATTCGTTGTCTATGATCCTAAAGATCCTCTGAAGGGTCTGTACGATGTTGATAACGATΜΙΝΙ Il III III Il Il Il III ΜΙΝΙ Il Il III430 CCATTCGTGGTATATGACCCTAAGGACCCCCTCAAGGGACTGTACGACGTCGACAACGAC361 TCTACTGTTATCACTCTGTCTGACTGGTATCATGTTGCTGCCAGACTTGGACCTTCCTTCIl III III Il Il IIIIIIIII Il Illlll Illlll III490 TCGACTGTGATCACCCTCTCCGACTGGTATCACGTGGCTGCCAGGCTTGGACCGAGCTTC421 CCACTGGGTTCTGACTCCACTCTGATCAATGGTCTGGGTAGATCCACCACCAACGCTACTIl Il Il Il III III ΜΙΝΙ Il Il I III IIIIIIIII550 CCGCTCGGCTCGGACTCGACTCTCATCAATGGCCTTGGCCGTAGCACTACCAACGCTACC481 GCTGGTCTTGCTGTCATCAACGTCACCCAAGGCAAGAGATACAGATTCAGACTGGTCTCCIl Il Il III IIIIIIIII Il III I Il I III I Il Il Il610 GCCGGCCTCGCTGTTATCAACGTCACACAGGGCAAACGTTATCGCTTCCGCCTTGTGTCC541 CTGTCCTGTGATCCTAACTACACCTTCTCTATCGATGGTCATGACATGTCCGTCATCGAAIlll Il Il Il IIIIIIIIIIIII Il llllllllllll Il670 TTGTCATGCGACCCCAACTACACCTTCAGCATCGACGGCCATGACATGTCCGTTATTGAG601 GCTGATGGCATTGCTACTCAACCTGTCACTGCTAACGCTATCCAAATCTTCTCTGCTCAGIl III III Il III Il Il Il Illlll 111111111111111730 GCGGATGGTATTGCAACGCAACCCGTGACCGCGAACGCTATTCAAATCTTCTCTGCTCAA661 AGATACTCCTTCGTCCTGACTGCCAACCAGACCATTGGCAACTACTGGATCAGAGCCAATIlll Il III ΜΙΝΙ Il III IIIIIIIII III I III790 CGATATTCTTTCGTGCTGACTGCAAATCAGACAATTGGCAACTATTGGATTCGCGCCAAC721 CCTTCCTTCGGAAACATCGGTTTCACCAATGGCATCAACTCTGCCATCCTGAGATACTCTIl III III Il Illlll III 1111111111111111 I III850 CCGAGCTTTGGAAATATTGGTTTCACGAATGGAATCAACTCTGCCATCCTGCGCTACTCG781 GGAGCTGATCCTATCGAACCTACTACTGCTCAACAGACCACTCAGAACCTGCTGAACGAA
III III lllllllll Il Il III III Illlll Il Il910 GGAGCGGATCCCATCGAACCTACGACGGCCCAACAAACCACACAGAACCTCCTCAATGAG841 GTTGATCTGCATCCATTCGTTGCTAAGCAGACTCCTGGTAGAGCTACTCAAGGTGGTACTII II II II II II II III III III I III Il Illlll970 GTCGACCTCCACCCCTTTGTCGCTAAACAGACGCCTGGCCGCGCTACACAGGGTGGTACC901 GATGTTGCCATCAACATGGTCTTCAACTTCAATGGCTCCAACTTCTTCATCAACAACGCTMM lllllllllllllllllllll Il III llllllllllllllllll1030 GATGTGGCCATCAACATGGTCTTCAACTTTAACGGCTCGAACTTCTTCATCAACAACGCG961 TCCTTCACTCCACCAACTGTTCCTGTCCTGCTTCAGATTCTGTCTGGTGCACAAGCAGCTIlllll Il Il III Il III lllllllll Il Il III Il1090 TCCTTCACGCCTCCCACTGTCCCCGTCCTCCTTCAGATTTTGAGCGGCGCACAGGCCGCC1021 CAGGATCTGCTTCCATCTGGCTCTGTCTACACTCTTCCTATCAACAAGTCCATCGAACTCMM Il Il Il Il Il lllllllll Il Il 111111111111111 Il1150 CAGGACCTCCTGCCTTCCGGAAGTGTCTACACGCTGCCGATCAACAAGTCCATCGAGCTC1081 ACCTTTCCTGCTACTGTCAATGCTCCTGGTGCTCCACATCCATTCCACCTGCATGGTCACIII Il Il Il III Il Il Il III Il Il lllllllll III1210 ACCTTCCCCGCCACGGTCAACGCCCCCGGGGCTCCCCACCCCTTCCACCTGCACGGTCAT1141 TCCTTCGCTGTCGTCAGAAGTGCTGGTTCCACCGAGTACAACTACAACAACCCTGTCTGGIl Illlll III I Il Il Il III Il Illlll III Il Il Il1270 TCGTTCGCTGTGGTCCGCAGCGCCGGCTCCACAGAATACAACTATAACAATCCCGTATGG1201 AGAGACGTCGTCTCCACTGGTACTCATGTTCCACAGGCTTGGTCTGACCTGTGTCCTACCι ΜΙΝΙ Il Il Il Il I Il I II1330 CGCGACGTCGTTTCGACCGGCACCCCTGCAGCGGGCGACAACGTCACGATCCGCTTCCAG1261 TACGATGCTCTCTCTGCTGACGACCACTAAGAGCTCATCGACTTTCATCTCGAAGCTGGCIII ι ι ιIl ι ι ι lllllllll lllllll Il Il1390 ACCGACAACCCCGGACCGTGGTTCCTCCATTGCCACATCGACTTCCATCTCGAGGCGGGC1321 TTTGCTGTTGTCTTTGCTGAAGACACTGCTGACACTTCTCTTGCCAACCCTGCTGCTGGTIl III Il Il Il Il III III Illlll Il Illl1450 TTCGCTGTCGTGTTCGCCGAGGACACCGCTGATACTTCTCTGGCGAACCA. . . TGTCCCA1381 GATAACGTCACCATCAGATTCCAGACTGACAATCCTGGACCTTGGTTCCTGCATTGTCACIII Il III Il Il IIIl1507 CAAGCATGGTCGGATCTTTGCCCGACGTACGATGCGCTCTCGGCTGATGATCACTGA实施例2灵芝漆酶基因在毕赤酵母中表达将实施例1制得的漆酶基因直接与真核表达载体PYM7909相连，经过DH5 α克隆过的环形质粒单酶切使其线性化，取约1 μ 1的线性DNA与80 μ 1毕赤酵母感受态细胞混合后进行点击转化，然后涂布于固体SD山梨醇培养基O0g/L琼脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD)上，28°C继续培养3天后获得白色菌落。挑取多个经测活呈阳性的毕赤酵母，分别接种于3ml液体BMGY培养基(10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5 μ 1生物素，甘油， SD)中，26°C摇床直到菌液的浓度达到OD6tltl为1.0时离心(12000rpm)收集菌体，再用液体BMMY培养基(SD)重悬毕赤酵母菌体，甲醇诱导3天，离心(12000rpm)分别收集上清测活，选取有活性的菌株活化。按上述方法进行大量培养，使得灵芝漆酶大量表达。实施例3灵芝漆酶基因的纯化将实施例2中得到的培养液在5，OOOg重力加速度下离心5min，收集含有酶液上清，进行硫酸铵沉淀，所得到的蛋白沉淀用SD重悬，使用微孔滤膜过滤离心好的上清，上到 Ni-Agarose柱上，纯化出目的蛋白，将目的蛋白透析后使用蛋白保存液保存起来。该目的蛋白即为纯化后的灵芝漆酶基因。实施例4灵芝漆酶基因的酶动力学特性分析灵芝漆酶基因的酶动力学特性分析主要有2个底物。它们分别是愈疮木酚和 ABTS,反应采用实施例3中的体系。主要测定灵芝漆酶酶基因对不同底物的Km和最大反应速度Vmax，也就是在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度(ν)随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值(Vmax)。底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示 [。178]
权利要求
1.一种灵芝漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.根据权利要求1所述的灵芝漆酶基因，其编码的核苷酸序列如SEQID No2所示。
3.权利要求1所述的灵芝漆酶基因在真核生物中的表达。
4.根据权利要求3所述的灵芝漆酶基因在真核生物中的表达，其特征在于，将所述灵芝漆酶基因与真核表达载体PYM 7909连接，转化至毕赤酵母菌，进行点击转化。
5.权利要求3所述的灵芝漆酶基因在真核生物中的表达的应用，其特征在于，挑取经测活呈阳性的毕赤酵母进行细胞外分泌表达纯化，以制备纯化的灵芝漆酶基因。
全文摘要
本发明涉及一种灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法。所述的灵芝漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该基因构建到真核表达载体中并转化入真核生物中，可用于灵芝漆酶的工业生产应用。
文档编号C12N15/53GK102533803SQ20101059850
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 孙静, 彭日荷, 熊爱生, 田永生, 赵伟, 金晓芬, 陈晨, 韩红娟 申请人:上海市农业科学院