专利名称：一种具有天冬酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有天冬酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其应用。
背景技术：
氮元素是构成蛋白质的主要成分，包括N03 —、NH4 +以及它们的一些同化产物， 用于合成生物体所需的氨基酸和核苷酸及多种不同的含氮化合物，对茎叶的生长和果实 的发育有重要作用，是与产量最密切的营养元素。氮元素也是植物需求量最大的矿物质元 素，而土壤中可利用的氮源比较少，自然就会成为农作物产量最主要的限制因素之一。由于 外源的氮对农作物产量的提高是非常有效的，因而，在集中型农业系统中，阶段性的施加无 机氮肥成为提高农作物产量的重要途径。许多农作物品种之所以被耕种者选择，一部分原 因就是它们对施用的氮肥有更高的利用性。然而，无机氮肥的应用会造成一系列环境问题， 尤其是淡水，进而江河和海水的富营养。正因为如此，如今需要降低氮肥的使用量，并寻找 氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保证在产量不下降的前提下，减少氮肥 的使用量。对于生物体的生长和发育而言，氮素的同化是个十分重要的生理过程，无机氮必 须同化为谷氨酰胺和天冬酰胺等有机氮才能被生物体所吸收和利用。天冬酰胺合成酶 (asparagine synthetase，ASN)是氮同化的路径上重要的运输氮化合物，它以谷氨酰胺和 天冬氨酸为反应底物，产生天冬酰胺和谷氨酸，而外界的无机氮元素也通过这个途径进入 生物体内的整个氮素循环。因此天冬酰胺合成酶生物体氮同化过程中起到了十分重要的作 用。盐藻{JJimaliella viridis)属团藻目、多毛藻科、杜氏藻属，是耐盐性最强的真核 单细胞藻类。不仅可在高盐海水和盐湖等生长，也能经受外界环境中盐浓度0.5-5. 5 mol/ L剧烈变化。在外界高盐的环境下，盐藻可利用环境中低浓度的毫摩尔的NO3--N和NH/-N。 研究盐藻的氮利用途径，有利于搞清楚高盐环境下植物氮利用途径及调控机制。因此，盐藻 天冬酰胺合成酶基因DvASN的克隆及功能鉴定对于改善逆境下农作物的性状有重要的意 义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一个具有天冬酰胺合成酶功能的基因，该基因 是从盐藻中分离的一个DNA分子，称之为iVAW。本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供该在提高植株的氮利用率中的应用。本发明的目的之四在于提供了该基因在改良农作物性状中的应用。为达以上目的，本发明通过下述方案实现
一种具有天冬酰胺合成酶功能的基因，其特征在于，该基因具有下列核苷酸序列之1)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；
2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同生 物学功能蛋白质的DNA序列。一种上述的具有天冬酰胺合成酶功能的基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白具有 下列氨基酸序列之一
1)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；
2)通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2的蛋白具有 相同的生物学功能。一种重组载体，其特征在于该重组载体含有上述的基因。一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有上述的重组载体。上述的具有天冬酰胺合成酶功能的基因在低氮环境下提高生物氮利用效率基因 工程方面的应用。上述的具有天冬酰胺合成酶功能的基因在改良农作物性状中的应用。上述的编码蛋白在低氮环境下提高生物氮利用效率基因工程方面的应用。上述的编码蛋白在改良农作物性状中的应用。一种克隆上述的基因的方法，该方法的具体步骤为利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA的序列的测序，获 得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个谷氨酰胺合成酶基因，命名为iVAW ；挑 选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA序列。本发明的基因iVAW具有合成天冬酰胺合成酶功能，能恢复酿酒酵母突变体合成 天冬酰胺的能力，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。
图1为本发明的基因iVAW编码的蛋白在softberry网站上亚细胞定位预测图， 表明该编码蛋白定位在胞质的可能性很大；
图2为本发明的基因iVAW编码的蛋白在ftOtComp Version 9. 0软件上亚细胞定位 预测图，表明该编码蛋白定位在胞质的可能性很大；
图3为本发明的iVAW基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于天冬酰胺 合成酶家族；
图4为本发明的iVAW基因在酵母突变体DNY41 (Genotype =MATa, asnA, asnB, his4_519，leu2_3，112，ura3_52)中的功能互补分析图。
具体实施方案下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规 条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遗传法实验 指南(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Adams A et al 编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。实施例一 -.DvASN基因全长编码区的克隆与分析利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对文库中cDNA的序列进行大规模测 序，获得对应的EST文库。通过序列比对，分离到了一个盐藻天冬酰胺合成酶基因，命名为 DvASN0挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA序列。测序 结果表明iVA V的cDNA全长1773bp，并含有poly(A)结构。Vector NTI9. 1. O软件的分析 结果显示该基因编码一个含591个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小约为66. 6kDa，等电点 为 6. 11。利用 Cell-PLoc 网站的 Euk-mPLoc 2. O 以及 Softberry 网站的 ProtComp Version 9.0对iVAW基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测，预测数据显示该蛋白定位在胞质的可 能性很大，参见图1-1和1-2，这与其它物种中的天冬酰胺合成酶的定位信息相符。进化分 析表明，DvASN基因编码的蛋白属于天冬酰胺合成酶家族，参见图3。
实施例二iVAW在酵母突变体中的功能分析通过酶切方法，酶切位点为EcoRI+XhoI (这两个酶切位点位于库质粒上)，将iVASV的全长cDNA从库质粒中切下，获得包含完整ORF 的基因片段。然后将克隆到的目的片段插入到酵母过表达载体PAJ401中，并转入酵母天冬酰 胺合成酶突变体 DNY41 (Genotype :MATa, asnA, asnB, his4-519, leu2-3, 112，ura3_52)中。 该突变体由于缺失编码天冬酰胺合成酶基因asnA和asnB，在不添加天冬酰胺的培养基中 无法正常生长。由图3可以看出，iVAW的表达，使得酵母突变体DNY41在不添加天冬酰胺 的培养条件下生长。该互补实验在酵母中验证了基因i^AW所编码的天冬酰胺合成酶能够 在酵母中发挥天冬酰胺合成酶的功能，证明该基因能够恢复酵母突变体合成天冬酰胺的能 力，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利 要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种具有天冬酰胺合成酶功能的基因，其特征在于，该基因具有下列核苷酸序列之a.具有SEQID NO 1所示的碱基序列；b.与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同生物学功 能蛋白质的DNA序列。
2.一种根据权利要求1所述的具有天冬酰胺合成酶功能的基因的编码蛋白，其特征在 于该蛋白具有下列氨基酸序列之一a.具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列；b.通过将SEQID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2的蛋白具有相同的 生物学功能。
3.—种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求1所述的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求1所述的具有天冬酰胺合成酶功能的基因在低氮环境下提高生物氮 利用效率基因工程方面的应用。
6.根据权利要求1所述的具有天冬酰胺合成酶功能的基因在改良农作物性状中的应用。
7.根据权利要求2所述的编码蛋白在低氮环境下提高生物氮利用效率基因工程方面 的应用。
8.根据权利要求2所述的编码蛋白在改良农作物性状中的应用。
9.一种克隆根据权利要求1所述的基因的方法，该方法的具体步骤为利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA的序列的 测序，获得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个谷氨酰胺合成酶基因，命名为 iVAW ；挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA序列。
全文摘要
本发明涉及一种具有天冬酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其应用。该基因具有下列核苷酸序列之一1.具有SEQIDNO1所示的碱基序列；2.与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因具有合成天冬酰胺合成酶功能，能恢复酿酒酵母突变体合成天冬酰胺的能力，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。
文档编号C12N15/10GK102121018SQ20101060005
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者宋任涛, 范倩岚, 许政暟 申请人:上海大学