专利名称：一种辅酶q10工业化生产方法
技术领域：
本发明涉及发酵工程领域，特别指对辅酶QlO培养基、关键促进因子配方优化及发酵工艺改进的辅酶QlO工业化生产方法。
背景技术：
辅酶QlO又称泛醌，为脂溶性醌类化合物，是细胞自身产生的天然抗氧化剂和细胞代谢激活剂，广泛存在于动、植物及微生物体内，是生物细胞呼吸链中的重要递氢体。同时由于其醌环的天然氧化还原特性，辅酶QlO具有保护和恢复生物膜结构的完整性、稳定膜电位和增强免疫反应等作用。作为一种良好的生化药物，辅酶QlO近年来已被广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病治疗，并可预防动脉硬化、中风和高血压，对心脏、肝脏和肾也有良好的保健作用。此外，辅酶QlO还具有抗衰老作用，在化妆品和保健品领域有广泛的应用。目前，国内外辅酶QlO的生产以微生物发酵法为主。动植物组织提取法来源有限， 原料价格高，且化学成份复杂，辅酶QlO含量低，规模化生产受制约；化学合成法合成条件苛刻、工艺复杂，产物为顺反异构体混合物，生物活性低，不适合现代化工业生产；利用微生物发酵法生产辅酶QlO具有原料来源丰富、成本低、反应条件温和产物生物活性高等优点， 是最具发展潜力的生产方法。近年来，国内对微生物发酵法生产辅酶QlO的研究主要集中在高产菌株的选育及发酵小试实验水平，如天辰神舟实业有限公司在“一株产辅酶QlO的类球红细菌突变株及培养方法”的专利申请中利用空间搭载诱变手段获得突变株，发酵单位达到800mg/L ；乔志新等采用基因组改组技术结合传统诱变育种方法快速融合多种正向突变获得高产菌株，单位菌体的辅酶QlO产量为8. 31mg/g。当前对辅酶QlO工业化规模生产工艺研究甚少，发酵水平普遍较低，周期长，成本高。除利用各种诱变技术获得高产菌株外，对培养基、关键促进因子配方优化及发酵工艺改进也是实现高效、低廉工业化生产辅酶QlO的有效途径。目前尚未见到将该关键促进因子组合及添加方法、溶氧反馈-补料分批培养技术应用于辅酶 QlO工业化生产的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种辅酶QlO工业化生产方法，本生产方法针对辅酶QlO在工业生产技术方面存在的不足，设计出新的发酵工艺路线，其特点为根据微生物细胞自身的生理需要、辅酶QlO的合成途径和代谢调控机制，添加关键促进因子，通过对种子、发酵培养基及合成辅酶QlO的关键促进因子配方优化，有效地提高了菌浓及单位发酵液的辅酶QlO含量；并对发酵过程进行动力学分析，确定出溶氧反馈-补料分批培养为最佳补糖模式，通过溶氧反馈补糖、中间变速流加营养源料及连续流加磷水、氨水等策略对辅酶QlO进行反馈调节，有效地提高细胞密度，控制代谢流，并延长产物合成期，实现辅酶QlO 产量的大幅度提高，生产成本则大大降低。
本发明要解决的技术问题由如下方案来实现突变株Rhodobacter sphaeroides Nr-F 17经斜面传代及母瓶培养后按2 5%0 接种量接入已灭菌的一级种子罐中培养，控制搅拌转速250 500rpm、空气流量20 80m3/ h、罐温28 32°C、罐压0. 02 0. 05Mpa，培养时间30 60h ；将培养好的一级种子液按5 15%接种量移入已灭菌的二级种子罐中培养，控制搅拌转速100 200rpm、空气流量100 300m7h、罐温28 32°C、罐压0. 02 0. 05Mpa, 培养时间10 20h，一级、二级种子罐培养基配方为葡萄糖3 10g，酵母粉1 5g，硫酸铵2 6g，味精0. 5 2g，玉米浆粉0. 3 2g，硫酸镁1 4g，磷酸二氢钾0. 3 2g，氯化钠1 4g，硫酸亚铁0. 2 lg，硫酸锰0. 03 0. Ig,硫酸锌0. 001 0. Olg,轻质碳酸钙 5 10g,7jC 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下灭菌25min ；母瓶及一级、二级种子罐接种前均按配料体积的2 5%移入已灭菌的关键促进因子至培养基中；在无菌条件下，将培养好的二级种子液按10 20%接种量移入发酵罐，发酵基础料配方为葡萄糖10 20g，硫酸铵3 10g，味精2 8g，玉米浆粉4 9g，硫酸镁5 IOg,磷酸二氢钾0. 1 0. 5g，氯化钠1 5g，硫酸亚铁1 3g，硫酸锰0. 1 0. 4g，氯化钴 0. 005 0. Olg, 7jC 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下灭菌 25min ；控制搅拌转速80 130rpm、空气流量1000 2500m7h、罐温30 !35°C、罐压 0. 03 0. 06Mpa,当溶氧值急剧上升时开始流加葡萄糖，保持培养过程中5%的溶解氧，在发酵对数期，通过提高搅拌速度、空气流量及葡萄糖的流加速率，使菌体终浓度达90g/L以上，总培养时间为70 100h，发酵至30 60h，采用逐步增加流速的方法补加营养源料，补料体积为发酵液体积的3 8%，发酵过程流加磷酸二氢钾溶液，发酵前期和中后期分别控制溶磷水平在0. 14 0. 18g/L和0. 08 0. 12g/L，补入氨水调节发酵液pH值在6. 5 7. 0 之间，氨基氮含量控制在0. 8 1. 5g/L，当菌体染色变浅，部分菌丝自溶，效价增长缓慢时， 终止发酵；上述关键促进因子的优选组合为茄尼醇0. 3 0. Sg, β -胡萝卜素0. 2 lg， L-酪氨酸0.2 lg，L-苯丙氨酸0.2 0. 9g，麦角固醇0. 15 0. 3g，硫胺素15 25g，核黄素15 25g，泛酸钙1 5g，烟酸10 20g，水1000ml，121°C下灭菌20min ；营养源料配方为3倍浓缩的发酵基础料，并含3 7% (ν/ν)的关键促进因子， 121°C 下灭菌 25min。下面详述生产方法1.种子制备①菌种类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides) Nr-F 17突变株(实验室编号)。②菌种传代采用斜面传代，培养基为肉汤培养基，于30°C避光培养4天，至长出草绿色圆形菌落，直径约1. 4 2. 0mm。③母瓶培养培养基配方葡萄糖10g，酵母膏6g，蛋白胨5g，氯化钠5g，硫酸铵0.75g，硫酸镁Ig,磷酸二氢钾0. 3g，硫酸亚铁0. 2g，硫酸锰0. 05g,硝酸钾0. 03g,硫酸锌0. 007g,水 1000ml，pH7. 2，灭菌温度和时间121°C、25min ；每瓶接入10 20个单菌落，在温度为30°C， 搅拌转速300rpm条件下，摇床培养25h。2.突变株的发酵配方优化
本发明采用响应面分析法，对辅酶QlO发酵中不同来源的碳源、氮源、无机盐和生长因子等进行优化，确定出培养基的最佳组成和含量。通过适当添加不同前体物和促进剂等辅酶QlO生物合成关键促进因子，有效地促进菌体生长，控制代谢产物流向，实现目的产物的最大化积累。种子培养基的优选配方为葡萄糖3 10g，酵母粉1 5g，硫酸铵2 6g，味精 0. 5 2g，玉米浆粉0. 3 2g，硫酸镁1 4g，磷酸二氢钾0. 3 2g，氯化钠1 4g，硫酸亚铁0. 2 lg，硫酸锰0. 03 0. lg，硫酸锌0. 001 0. Olg，轻质碳酸钙5 IOg,/K 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C 下灭菌 25min。发酵基础料的优选配方为葡萄糖10 20g，硫酸铵3 10g，味精2 8g，玉米浆粉4 9g，硫酸镁5 10g，磷酸二氢钾0. 1 0. 5g，氯化钠1 5g，硫酸亚铁1 3g，硫酸锰 0. 1 0. 4g，氯化钴 0. 005 0. Olg, 7jC 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下灭菌 25min。关键促进因子优选组合为茄尼醇0.3 0.8g，β-胡萝卜素0.2 lg，L-酪氨酸 0. 2 lg，L-苯丙氨酸0. 2 0. 9g，麦角固醇0. 15 0. 3g，硫胺素15 25g，核黄素15 25g，泛酸钙1 5g，烟酸10 20g，水1000ml，121°C下灭菌20min。营养源料配方3倍浓缩的发酵基础料，并含3 7% (ν/ν)的关键促进因子， 121°C 下灭菌 25min。关键促进因子的添加方法1)接种前按配料体积的2 5%加入培养基中，包括母瓶、一级种子罐、二级种子罐和发酵罐；2)在发酵中后期以变速流加营养源料的方式补入。添加关键促进因子对辅酶QlO发酵生产影响显著(见图2)，主要体现①硫胺素、核黄素、泛酸钙和烟酸等维生素类添加物可有效加快糖酵解速度并激活戊糖磷酸途径，促进菌体生长，细胞干重(DCW)明显增加，获得高细胞密度；未添加时，菌体拉长变形严重，老化快，中后期效价增长缓慢，产物分泌期明显缩短。②L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、麦角固醇、β-胡萝卜素和茄尼醇等有效阻断或减弱代谢分支，解除反馈抑制，增大辅酶QlO代谢通量，随着中后期营养源料的补入，辅酶QlO效价增长迅速，发酵水平较未添加时有显著提高。3.扩培工艺及参数采用三级发酵工艺进行生产，种子罐的基本培养条件为一级种子罐搅拌转速250 500rpm，空气流量20 80m7h，罐温观 32°C，罐压0. 02 0. 05MPa,接种量为2 5%。，培养时间30 60h ；二级种子罐搅拌转速100 200rpm，空气流量100 300m7h，罐温28 32°C， 罐压0. 02 0. 05MPa，接种量为5 15%，培养时间为10 20h。4.发酵补料-分批培养本发明在补料-分批培养模式下，通过对辅酶QlO高产菌的呼吸强度、糖代谢与产物合成关系研究及A含量与葡萄糖供应的动力学分析，确定出最佳的溶氧条件及补糖模式。采用溶氧反馈-补料分批培养技术，通过溶氧反馈补糖及连续流加磷水、氨水等策略实现对辅酶Qio的反馈调节，在发酵中后期变速流加营养源料，从而获得高细胞密度，并有效延长产物合成期，增加产物积累，使菌种获得最大的生产率。
在无菌条件下，将培养好的二级种子液按10 20%接种量移入发酵罐，在搅拌转速80 130rpm，空气流量1000 2500m3/h，罐温30 !35°C，罐压0. 03 0. 06MPa的初始条件下进行培养。以溶氧值急剧上升为标志开始流加葡萄糖，保持培养过程中5%的溶解氧，在发酵对数期，通过提高搅拌速度、空气流量及葡萄糖的流加速率，使菌体终浓度达 90g/L以上，总培养时间为70 100h。发酵至30 60h，采用逐步增加流速的方法补加营养源料，补料体积为发酵液体积的3 8%。发酵过程流加磷酸二氢钾溶液，分段控制溶磷水平0. 14 0. 18g/L (发酵前期)，0. 08 0. 12g/L (发酵中后期)；补入氨水调节发酵液 pH值在6. 5 7. 0之间，氨基氮含量控制在0. 8 1. 5g/L，当菌体染色变浅，部分菌丝自溶， 效价增长缓慢时，终止发酵。本发明的优点是本生产方法主要由对辅酶QlO培养基、关键促进因子配方优化及发酵工艺改进两部分组成。其中关键促进因子优选组合，是根据辅酶QlO生物合成途径结合细菌的代谢调控机制优选得到的，优选组分的加入有效地促进菌体生长，获得高细胞密度，阻断或减弱代谢分支，增大辅酶QlO代谢通量，达到增产的效果。采用溶氧反馈-补料分批培养技术，使发酵前期细菌保持适当的比生长率，获得高细胞密度，中后期保持一定的溶氧值，避免过低的溶氧条件加速菌体老化，达到延长产物累积时间的目的，同时葡萄糖浓度控制在低水平，有效抑制了代谢副产物的生成和积累。通过溶氧反馈补糖、变速流加营养源料及连续流加磷水、氨水等策略对辅酶QlO进行反馈调节，有效地控制了代谢流，延长产物合成期，辅酶QlO产量达3400mg/L和34. 7mg/g DCff,较原发酵水平有大幅度提高。本生产方法工艺稳定，发酵成本大大降低。
图1为本发明的发酵工艺路线2添加关键促进因子对辅酶QlO发酵影响
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例如图1所示，由液氮保存的菌种经活化并传代稳定后，30°C平板培养4天， 挑出长势良好的草绿色圆形单菌落至已灭菌好的母瓶培养基，每瓶接入20个单菌落，控制条件为30°C，300rpm，培养时间25h ；按2%。接种量接入已灭菌好的一级种子罐(配料体积 0. 7m3)，控制搅拌转速400rpm，空气流量45m7h，罐温30°C，罐压0. 04MPa,培养时间38h。当种子液菌体形态均勻，菌量丰富，且无菌度合格后，按10 %接种量移入已灭菌好的二级种子罐(配料体积7m3)，在搅拌转速200rpm，空气流量300m3/h，罐温30°C，罐压0. 04MPa条件下培养12h。关键促进因子优选组合为茄尼醇0.4g，β-胡萝卜素0.3g，L-酪氨酸0.3g， L-苯丙氨酸0. 5g，麦角固醇0. 15g，硫胺素15g，核黄素15g，泛酸钙lg，烟酸10g，水IOOOml， 121°C下灭菌20min，各级接种前均按配料体积的4%移入培养基中；一级、二级种子罐培养基配方为葡萄糖5g，酵母粉3g，硫酸铵4g，味精lg，玉米浆粉0. Sg,硫酸镁2g，磷酸二氢钾 Ig,氯化钠2. 4g，硫酸亚铁0. 5g，硫酸锰0. Ig,硫酸锌0. 005g,轻质碳酸钙5g，水IOOOml，pH 6. 5，121°C 下灭菌 25min。
当二级种子液菌体形态均勻，菌量丰富，且无菌度合格后，按15%接种量移入 120m3发酵罐(配料体积50m3)。发酵基础料配方为葡萄糖20g，硫酸铵5g，味精5g，玉米浆粉7g，硫酸镁7g，磷酸二氢钾0. 3g，氯化钠3g，硫酸亚铁2g，硫酸锰0. 4g，氯化钴0. 008g, 水 1000ml, pH 6. 5，121°C 下灭菌 25min。控制搅拌转速80rpm，空气流量1500m3/h，罐温32°C，罐压0. 04MPa,总培养时间为 88h。发酵过程中，当溶氧值急剧上升时开始流加葡萄糖，保持培养过程中5%的溶解氧，在 32h(发酵对数后期)，将搅拌速度、空气流量及葡萄糖的流加速率分别勻速提升至120rpm、 2000m3/h和400L/h，使菌体终浓度达90g/L以上；发酵至30 60h，变速流加营养源料 4. 5m3，设初始流速为100L/h，每IOh增加50L/h，营养源料配方为3倍浓缩的发酵基础料， 并含6% (ν/ν)的关键促进因子，121°C下灭菌25min;中间在线测量和控制搅拌转速、空气流量、溶氧和PH值，离线检测残糖浓度、溶磷、氨基氮浓度等并观察菌体形态。发酵过程流加磷酸二氢钾，培养前3 控制发酵液溶磷在0. 14 0. 18g/L，32h后在0. 08 0. 12g/L，补入氨水调节发酵液pH值在6. 5 7. 0之间，氨基氮含量控制在0. 8 1. 5g/L，当菌体染色变浅，部分菌丝自溶，效价增长缓慢时放罐。
权利要求
1. 一种辅酶Qio工业化生产方法，其特征在于包括如下步骤突变株Miodobacter sphaeroides Nr-F 17经斜面传代及母瓶培养后按2 5%。接种量接入已灭菌的一级种子罐中培养，控制搅拌转速250 500rpm、空气流量20 80m3/h、 罐温28 32"C、罐压0. 02 0. 05Mpa，培养时间30 60h ；将培养好的一级种子液按5 15%接种量移入已灭菌的二级种子罐中培养，控制搅拌转速100 200rpm、空气流量100 300m7h、罐温28 32°C、罐压0. 02 0. 05Mpa，培养时间10 20h，一级、二级种子罐培养基配方为葡萄糖3 10g，酵母粉1 5g，硫酸铵 2 6g，味精0. 5 2g，玉米浆粉0. 3 2g，硫酸镁1 4g，磷酸二氢钾0. 3 2g，氯化钠 1 4g，硫酸亚铁0. 2 lg，硫酸锰0. 03 0. lg，硫酸锌0. 001 0. Olg，轻质碳酸钙5 10g,7jC 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下灭菌25min ；母瓶及一级、二级种子罐接种前均按配料体积的2 5%移入已灭菌的关键促进因子至培养基中；在无菌条件下，将培养好的二级种子液按10 20%接种量移入发酵罐，发酵基础料配方为葡萄糖10 20g，硫酸铵3 10g，味精2 8g，玉米浆粉4 9g，硫酸镁5 10g，磷酸二氢钾0. 1 0. 5g，氯化钠1 5g，硫酸亚铁1 3g，硫酸锰0. 1 0. 4g，氯化钴0. 005 0. Olg, 7jc 1000ml, pH 6. 5 7. 0，121°C下灭菌 25min ；控制搅拌转速80 130rpm、空气流量1000 2500m7h、罐温30 !35°C、罐压0. 03 0. 06Mpa,当溶氧值急剧上升时开始流加葡萄糖，保持培养过程中5%的溶解氧，在发酵对数期，通过提高搅拌速度、空气流量及葡萄糖的流加速率，使菌体终浓度达90g/L以上，总培养时间为70 100h，发酵至30 60h，采用逐步增加流速的方法补加营养源料，补料体积为发酵液体积的3 8%，发酵过程流加磷酸二氢钾溶液，发酵前期和中后期分别控制溶磷水平在0. 14 0. 18g/L和0. 08 0. 12g/L，补入氨水调节发酵液pH值在6. 5 7. 0之间， 氨基氮含量控制在0. 8 1. 5g/L，当菌体染色变浅，部分菌丝自溶，效价增长缓慢时，终止发酵；上述关键促进因子的优选组合为茄尼醇0. 3 0. Sg, β -胡萝卜素0. 2 lg，L-酪氨酸0.2 lg，L-苯丙氨酸0.2 0. 9g，麦角固醇0. 15 0. 3g，硫胺素15 25g，核黄素 15 25g，泛酸钙1 5g，烟酸10 20g，水1000ml，121°C下灭菌20min ；上述营养源料配方为3倍浓缩的发酵基础料，并含3 7% (ν/ν)的关键促进因子， 121°C 下灭菌 25min。
全文摘要
本发明公开了一种辅酶Q10工业化生产方法，主要特点是根据辅酶Q10生物合成途径和代谢调控机制，选择合适的前体物和促进剂作为关键促进因子诱导辅酶Q10的积累，通过对种子、发酵培养基及辅酶Q10生物合成关键促进因子进行优化，有效地促进菌体生长，增大辅酶Q10代谢通量；采用三级发酵扩大培养及补料-分批培养。应用溶氧反馈-补料分批培养技术，通过溶氧反馈补糖、中间变速流加营养源料及连续流加磷水、氨水等策略实现对辅酶Q10的反馈调节，有效提高细胞密度，控制代谢流，并延长产物合成期，辅酶Q10发酵水平有了大幅度的提升，本生产工艺稳定，发酵成本大大降低。
文档编号C12R1/01GK102168115SQ20101060122
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者吴轶, 朱友跑, 詹光煌, 陈必钦 申请人:内蒙古金达威药业有限公司, 厦门金达威集团股份有限公司