专利名称：一种低温中性组氨酸植酸酶appa206及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温中性植酸酶APPA206及其基因和应用。
背景技术：
磷是动物生长、繁殖及代谢所必需的矿物质因素之一。谷物、豆类和油料等作物中的磷40 70%是以植酸的形式存在的，以植酸磷形式存在的磷因单胃动物体内缺乏能分解植酸磷的酶而难以被利用，典型猪日粮中利用率只有15%，其余85%左右的磷从粪便中排出，从而造成许多问题第一，磷资源的浪费，一方面饲料中的磷得不到有效利用，另一方面则需加入大量无机磷以满足动物对磷的需求，提高了生产成本；第二，高磷粪便对环境的污染，饲料中85%的植酸磷被动物直接排出体外，使周围的土壤和水受到严重污染。另外， 植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化过程中会与多种金属离子(如Zn2+， Ca2+，Cu2+，Fe3+等)以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的有效利用。植酸酶可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，其对单胃动物的饲喂效果已得到了广泛的确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%，还可降低植酸盐的抗营养作用，因此对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。随着饲料工业的发展，植酸酶已经成为饲料添加剂和酶制剂研究的热点。重点的研究方向之一就是通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因，可望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的。单胃畜禽和淡水鱼类饲料中都需要使用植酸酶，但它们对植酸酶的性质有不同的要求。对单胃畜禽而言，植酸酶的主要作用场所是单胃动物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性条件下要有较高的酶活性，即酶反应的最适PH值为酸性的植酸酶。对于淡水养殖的主要鱼类-鲤科鱼类来说，因为它们无胃，只有PH值呈中性(pH6.5 8.0)的肠道，因而在鱼类饲料中必需使用在中性PH值条件下有高活性的植酸酶。目前商品化生产的用于单胃畜禽的植酸酶在中性PH值环境下基本没有酶活性，因而不能用于鲤科鱼类饲料。另外由于水产养殖环境得水体温度一般在0-30°C之间，投放到养殖池塘的植酸酶需要在低温具有较高的活性。而到目前为至，很少有在低温及中性的环境下具有高酶活性植酸酶的报道。因此， 开发低温中性植酸酶具有较好的科学理论价值，也具有较大的应用潜力和产业价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用于淡水鱼类的低温中性植酸酶。本发明的再一目的是提供编码上述低温中性植酸酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述低温中性植酸酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述低温中性植酸酶的应用。本发明的中性植酸酶APPA206来源于假单胞菌(Pseudomonas sp. 206)。本发明提供了一种低温中性植酸酶APPA206，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。MSMTLFNRTG LALVALTLCA SLQAAETNRY VLEKVVQVSR HGVRSPTDTDKLVKATGRAff 60TPffLVQDGEL TGHGYLAASY MGAffQAAYYR NAGLLADSCP SPGSVVAVASPKQRTRSTAA 120ALLDGMFPGC GEKALARSKP DPLFQTDEMP FAQIDPAIAK AQILQALGGSLQSARERLRP 180DLERLKSAVC EAGKACPFFD TPWVLKE⑶G GRFKIKGLDK ASSMAETIRLQYSEGMPLAD 240VAFGHARDAA QVSALGRLHR AKYDFINDTP HVASRGGSQL MNQIVLALEQGTPLEKNDPL 300GNPPAARLLM LVAHDTNISH LRTLLGFTffQ LGEYQRGNIP PTGTLAFERYRDTQTGERFI 360RTRFITQGMD QIRALQRLDS EHPPLQADFD QPGCQHTPLG ILCPIAQFVERTDRAIDRTA 420LTAYRYP427本发明提供了编码上述低温中性植酸酶的基因appa206。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO. 2所示。atgagcatga ccctcttcaa tcgaacgggc ctggcattgg tcgccctcac gttgtgcgcc 60agcctgcaag ccgccgaaac gaaccgttac gtgctggaaa aagtggtgca ggtcagccgc 120
catggcgtgc gttcgcccac cgataccgac aaattggtca aggccaccgg ccgcgcctgg 180acgccatggc tggtacagga cggtgagctg accggccatg gttatctggc cgccagctac 240atgggggcct ggcaggcggc gtactaccgc aacgccggtc tgctggccga tagctgcccg 300tcgccgggca gcgtcgtggc ggttgccagc cccaaacagc gcacacgttc taccgccgcc 360gccctgctcg atggcatgtt ccccggctgc ggcgaaaaag cgctggcgcg cagcaagccg 420gacccgttgt tccagaccga tgaaatgccc ttcgcgcaga ttgaccccgc tattgccaaa 480gcccagatcc tgcaggccct cggcggctct ctgcaatcag cccgcgagcg cttgcgccct 540gacctggagc gtctgaaaag tgcagtgtgc gaagcgggca aagcttgccc gttcttcgac 600acgccctggg tcttgaaaga gggcgatggc gggcggttca agatcaaggg cctggacaag 660gcctcgtcga tggccgagac cattcgcctg caatacagcg aaggcatgcc gctggcagat 720
gtcgctttcg gccatgctcg cgatgcggcg caagtctcgg cgctggggcg gctgcaccgg 780gccaaatatg acttcatcaa tgacaccccg cacgttgcca gtcgtggcgg ttcgcagttg 840atgaaccaga ttgtgctggc cctggagcag gggacgccgt tggagaagaa cgatccgttg 900ggcaacccgc ctgcggcgcg tctgctgatg ctggtggccc acgacaccaa catctcgcac 960ctgcgtaccc tgctggggtt tacatggcag cttggcgagt accagcgggg caatatcccg 1020cccaccggca cgctggcgtt cgagcgctac cgcgacaccc agaccggcga gcgctttatc 1080cgcacgcggt tcatcacaca aggcatggat cagattcgcg ccttacagcg cctggacagt 1140
gaacatccgc ccttgcaggc tgactttgat cagccgggtt gccagcacac cccgctcggc 1200atcctgtgtc cgattgcgca gttcgtcgag cgcaccgacc gggccatcga tcgcacagcg 1260ctgacggcgt accgctaccc ttga1284本发明还提供了包含上述低温中性植酸酶基因appa206的重组载体，优选为 pET-22b appa206。本发明还提供了包含上述低温中性植酸酶基因appa206的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选保藏编号为CGMCC No. 4435的大肠埃希氏菌 Appa206o本发明还提供了一种制备低温中性植酸酶APPA206的方法，包括以下步骤1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；以及3)纯化所表达的植酸酶APPA206本发明还提供了上述中性植酸酶APPA206的应用。本发明的中性植酸酶APPA206来源于假单胞菌。本发明获得一种低温中性植酸酶，其在pH4. 5 8. 5的范围内均具有高的酶活性。 且APPA206在20-30°C时，仍具有40-60%的最高活性，这些性质使其更适于应用于淡水鱼类养殖用饲料中。
图1重组植酸酶的最适pH。
图2重组植酸酶的pH稳定性。图3重组植酸酶的最适温度。图4重组植酸酶的热稳定性。关于生物材料的保藏说明大肠埃希氏菌Appa206 scherichia.coli)，于2010年12月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCCNo. 4435。
具体实施例方式实验条件1、菌株及载体fseudomonas sp. 206分离浙江嘉兴人工鱼塘底泥样品。大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3)、表达载体 pET_22b (+)(购自 Novagen 公司)。2、酶类及其他生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自hvitrogen公司。 PNPfel、植酸钠等底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。3、培养基假单胞菌及大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、 NaCl，pH 7. 0)。本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 片反· 2001)；禾口 CurrentProtocols
5in Molecular Biology (Ausubel 等人编，1994)。实施例1假单胞菌植酸酶编码基因appa206的克隆提取假单胞菌(I^eudomonas sp.)基因组DNA 取37 °C培养M小时的菌液 IOOOOrpm离心IOmin。取IOOmg菌体加500 μ L无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重悬于500 μ L 提取液混合液，于37°C温育60min，IOOOOrpm离心IOmin去沉淀。上清液用等体积酚、氯仿依次抽提。取上层溶液加0. 6-1倍体积的异丙醇常温沉淀lOmin。12000rpm离心15min。 沉淀用70%乙醇清洗，稍离心，将沉淀烘干后用30μ L无菌水溶解，备用。根据中性植酸酶的保守序列设计合成了简并引物。以提取假单胞菌为模板进行兼并性PCR扩增。PCR反应参数为94°C变性:3min后冷却至4°C ；然后94°C变性30sec，50°C 退火30seC，72°C延伸lmin，32个循环后72°C保温lOmin。得到植酸酶保守性片段，将该片段回收后测序。根据已知序列，采用TAIL-PCR方法分别设计上下游特异性引物，扩增得到基因的全部序列。最后经过正确的拼接，最终得到一个植酸酶基因，appa206。该植酸酶基因以ATG 为起始密码子，由1284个碱基组成，编码427个氨基酸和一个终止密码子TGA。实施例2植酸酶的活性分析方法酶活测定方法为将酶液用含有0. 05% BSA和0. 05% Triton X-100的0. Imol/ L的pH7. OTris-HCl缓冲液稀释，取50 μ L稀释酶液加底物1. 5mmol/L植酸钠950 μ L (用 0. lmol/L 的 pH7. OTris-HCl 缓冲液配制)，37 °C 反应 15min，加 ImLlO % TCA 终止反应，力口 2mL显色液(IOg四水合钼酸铵+32mL硫酸+73. 2g硫酸亚铁，加水定容至1L)。对照则加酶液后先加TCA混勻，再加底物。显色后700nm下测其OD值，计算酶活。一个酶活性单位(U)定义为在一定条件下，每分钟释放出Inmol无机磷所需酶量为一个酶活性单位。实施例3重组植酸酶的制备根据基因的序列设计扩增植酸酶基因成熟蛋白序列的表达引物206-mF和206_m R(5 ‘ -TCAGAATTCGGCCGAAACGAACCGTTACGTG-3 ‘ ,206mR,5 ‘ -CGACTCGAGAGGGTAGCGGTACG CCGTCAGCG-3 ‘)，并在引物206mF的末端引入酶切位点EcoRI，在引物206mR的末端引入 XhoI,以I^seudomonas sp. 206菌株基因组DNA为模板，进行植酸酶基因的PCR扩增。PCR 反应循环条件为94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin,30 个循环；72°C 5min。胶回收PCR产物并用EcoR I和B10 I双酶切，然后与大肠杆菌载体pET222b(+)连接，构建表达载体pET22b-appa206，利用电转化方法转化大肠杆菌BL21 (DE3)，用检测植酸酶活性和 SDS-PAGE电泳的方法验证植酸酶基因appa206在大肠杆菌中的表达，检测植酸酶的活性， 将活性最高的大肠埃希氏菌Appa206于2010年12月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 100101)，其保藏号为=CGMCC 44350 ο实施例4重组植酸酶的纯化获得的阳性克隆按常规的方法进行摇瓶培养，当0D600至0. 6时，加入终浓度为 0. 8mmol/L的IPTG进行诱导，诱导他后取样测定植酸酶酶活性。收集诱导液上清液，用中空纤维素超滤浓缩诱导上清液。进一步利用60 80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀物用NaAc-HAc 缓冲液溶解，透析后利用HiTrap Q XL柱子纯化，平衡缓冲液为20mmol/L的Tris/HCl (pH8. 0)，洗脱液为含 lmol/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)，上样量 5mL，0 100%洗脱 10CV，流速2mL/min，分部收集洗脱峰，得到电泳纯的目标蛋白，分子量约为44kDa，与此酶的理论分子量相当。实施例5植酸酶酶学性质的研究重组植酸酶最适pH及pH值稳定性纯化后的重组酶在不同的pH(l. 0-10.0)条件下进行酶促反应其最适PH值的测定，所用缓冲液为pH 1.0-3.5,0. lmol/L甘氨酸-盐酸缓冲液；PH 3. 5-6. 0,0. 25mol/L 醋酸钠-醋酸缓冲液；pH 6. 0-8. 5,0. 25mol/LTris-HCl 冲液，pH 8. 5-10. 0,0. 25mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，37°C测定酶活性。将酶液在不同pH 缓冲液，37°C处理lh，在37°C，最适pH缓冲液中测定酶的剩余活性来研究酶在不同pH条件下的稳定性。各PH值条件下的测定重复3次，取平均值。结果表明重组酶的最适pH值为 5. 5，在pH4. 5 8. 5条件下，酶活性维持在40%以上，而在pH小于2. 5时酶活性难以检测 (图1)。pH稳定性方面，从pH 3. 5到7. 5剩余酶活均在80%以上，说明该酶在较广的pH 条件具有较好的稳定性(图2)。重组植酸酶最适反应温度及热稳定性在最适pH及不同温度(0_80°C )条件下测定酶活性以确定最适温度。热稳定性测定为在不同温度(50°C、6(TC )条件下将酶液分别处理2、4、8、lOmin，在37°C最适pH条件下进行酶活性测定。每一温度下的测定重复3次，取平均值。结果表明纯化的重组酶r-APPA206的最适温度为45°C，在20°C时，该酶仍有40% 的相对活性，即在20-45°C时，该植酸酶具有较高的活性，但是当温度高于50°C时酶的活性急剧下降(图幻。热稳定性试验表明，该植酸酶的热稳定性一般，45处理30min，剩余酶活为70%，55°C处理lOmin，基本丧失所有活性(图4)。
权利要求
1.一种低温中性植酸酶APPA206，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种低温中性植酸酶基因appa206，其特征在于，编码权利要求1所述的低温中性植酸酶 APPA206。
3.如权利要求2所述的低温中性植酸酶基因appa206，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO. 2 所示。
4.包含权利要求2或3所述低温中性植酸酶基因appa206的重组载体。
5.包含权利要求2或3所述低温中性植酸酶基因appa206的重组载体 pET-22b-appa206。
6.包含权利要求2或3所述低温中性植酸酶基因appa206的重组菌株。
7.如权利要求6的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
8.如权利要求6的重组菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo. 4435。
9.一种制备低温中性植酸酶APPA206的方法，其特征在于，包括以下步骤1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；以及3)回收并纯化所表达的低温中性植酸酶APPA206。
10.权利要求1所述低温中性植酸酶APPA206的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温中性植酸酶APPA206及其基因、包含该基因的重组载体和应用。本发明提供了一种低温中性植酸酶APPA206，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述低温中性植酸酶的基因appa206。本发明获得一种低温中性植酸酶，其在pH4.5～8.5的范围内均具有高的酶活性，其可以抵御水产动物体内胰蛋白酶的水解。这些性质使其适用于淡水鱼类饲料中。
文档编号C12N9/16GK102533693SQ20101060217
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者付大伟, 张菁, 詹志春 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司