专利名称：一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明属单核苷酸多态性的检测领域，特别是涉及一种基于核酸横向流试纸条检 测单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
心血管疾病是现代人的第一大杀手。现在全球有近四分之一人口为心血管及相关 疾病所威胁，而且终其一生，大约有三分之一人的人生为心血管疾病阴影所笼罩，最后有五 分之一的人口死于心血管相关疾病。在心血管疾病(如冠心病)的发生、诊断和治疗中， KIF6 (kinesin-like protein 6)基因有着重要的影口向。KIF6 (kinesin-like protein 6) 蛋白是一种与细胞内运输有关的蛋白质。KIF6基因型提供了传统风险因素以外的重要信 息，以帮助识别冠心病的高危患者并进行个性化的治疗。KIF6(719 Arg)的单核苷酸多态性 (SNP)已被证实可以预测冠心病(CHD)风险的增加，并减少statin (他汀类药物)治疗的 事故。这类KIF6基因型携带者含有一个或两个719Arg等位基因(e. g.，Arg/trp or Arg/ Arg)，而非携带者的基因型缺乏719Arg等位基因(e. g.，Trp/Trp)。并且女性KIF6 (719Arg) 等位基因携带者心梗及冠心病(CHD)危险高于非携带者。目前最常见的单核苷酸多态性检测方法包括测序法、单链构象多态性检测 (SSCP)、连接或引物延伸法(ligation or primer extension)、基于分子信标的荧光能量 共振转移方法(molecular-beacon-based fluorescence resonance energy transfer)， 电化学检测(electrochemical detecting)以及双色荧光偏振技术等方法。但这些方法普 遍存在操作过程复杂，比较费时以及需要贵重的检测仪器等缺点。因此建立简单、特异、快 速、便捷的靶核酸及单核苷酸多态性检测方法可以更便于在医学诊断及临床检验上的推广 使用。最近许多研究都集中在新的检测技术的开发以便使PCR及其他扩增技术更适应 现代分子诊断的需求。如试纸条检测技术为生化检测以及医学快速检测提供了便捷的途 径。然而，目前试纸条技术主要是标记了扩增产物或寡核苷酸探针的抗体或链亲和素试纸 条。该试纸条具有一定的优势，但也因为运用了蛋白的抗原抗体反应，需要更多的标记，并 且高亲和力的抗体/半抗原对的数量限制了基因多靶标的检测，增加了成本和步骤，并且 更不易于保存。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多 态性的方法，该方法操作简单，成本低，具有特异、快速、高分辨、高灵敏度的特点，可应用于 临床医学中遗传病、传染性疾病、肿瘤以及心血管疾病中基因的单核苷酸多态性、基因型的 检测以及不同病原微生物的鉴定。本发明的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，以心血管病相 关基因KIF的基因多态性检测为例进行详细阐述，包括
(1)将含有毛细管的膜(Membrane)粘贴在衬垫纸板上，再把吸收区(Absorbent Pad)放置在含有毛细管的膜之上，重叠l-2mm;再把结合区(Conjugation Pad)放置在含 有毛细管的膜之上，重叠l-2mm;最后把浸入区(Immersion Pad)放置在结合区之上，重叠 l-2mm，得核酸横向流试纸条；所述含有毛细管的膜上有以捕获DNA探针包被的两条检测线 (检测线1、检测线2)，和一条质控线；(2)KIF6 DNA的单核苷酸多态性检测取1 μ L待测样本，在PCR仪中95°C变性^iin，再放入_20°C冰盒退火!Min ；首先配制检测KIF6基因型的反应体系，用于目标DNA与检测探针的杂交和连接， 取水4 μ L、纳米金探针溶液2 μ L、连接探针Z-KIF-I和Z-KIF-2 (浓度为1 μ M/L)各1 μ L、 TaqDNA连接酶缓冲液1 μ L和Taq DNA连接酶(浓度为1个单位)溶液1 μ L，用移液枪打 勻，得混合液；向混合液中加入1 μ L(浓度为1 μ M/L)的KIF-l、KIF-2或它们的混合液，用 移液枪打勻；然后加入上述处理后的待测样本，用移液枪打勻，之后再PCR仪中45°C杂交连 接30分钟，再95°C变性％iin，再放到_20°C冰盒中退火3min，最后将所得溶液滴加在上述 核酸横向流试纸条的结合区，迅速将试纸条浸入区浸入运行缓冲液(RurmingBuffer)中， 在液体到达吸收区时平放试纸条，IOmin后观察现象。所述步骤(1)中含有毛细管的膜的成分为硝酸纤维素膜；结合区的成分为聚脂纤 维；浸入区的成分为玻璃纤维；吸收区的成分为吸水纸；玻璃纤维的型号是SB06，聚脂纤维 膜的型号是VL68，吸水纸的型号是SX27。所述步骤(1)中含有毛细管的膜上包被的是捕获DNA探针，其序列为一个或几个 通用序列，利用DNA的杂交捕获检测探针上与其互补的通用序列；质控线上包被的是质控 探针Control ftx)be，而两条检测线上分别包被了不同的捕获探针(ZW-T和ZM-T)，其中捕 获DNA探针浓度为20 μ M/L,包被捕获DNA探针用量为1 μ L/mm,捕获探针被溶解在含2 %蔗 糖和5%甲醇的溶液中以固定捕获探针并保存捕获探针的活性。包被线后试纸条在室温下 晾干并保存。所述步骤⑵中的运行缓冲液的成分为50mM/L的Tris-HCl，50mM/L的NaCl，2ml/ L的Tween-20和0. 5g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)。表1. KIF6基因DNA序列及探针序列
权利要求
1.一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，包括(1)将含有毛细管的膜粘贴在衬垫纸板上，再把吸收区放置在含有毛细管的膜之上，重 叠l-2mm;再把结合区放置在含有毛细管的膜之上，重叠l-2mm;最后把浸入区放置在结合 区之上，重叠l_2mm，得核酸横向流试纸条；所述含有毛细管的膜上有以捕获DNA探针包被 的两条检测线和一条质控线；(2)取1μ L待测样本，在PCR仪中95°C变性^iin，再放入_20°C冰盒退火^iin ；取水4 μ L、纳米金探针溶液2 μ L、连接探针Z-KIF-I和Z-KIF-2各1 μ L、Taq DNA连接酶缓冲液1 μ L和浓度为1个单位的Taq DNA连接酶1 μ L，用移液枪打勻，得混合液；向混 合液中加入1 μ L的KIF-l、KIF-2或它们的混合液，用移液枪打勻；然后加入上述处理后的 待测样本，用移液枪打勻，之后再PCR仪中45°C杂交连接30分钟，再95°C变性％iin，再放 到-20°C冰盒中退火3min，最后将所得溶液滴加在上述核酸横向流试纸条的结合区，迅速 将试纸条浸入区浸入运行缓冲液中，在液体到达吸收区时平放试纸条，IOmin后观察现象。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其 特征在于所述步骤(1)中含有毛细管的膜的成分为硝酸纤维素膜；结合区的成分为聚脂 纤维；浸入区的成分为玻璃纤维；吸收区的成分为吸水纸。
3.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其 特征在于所述步骤(1)中含有毛细管的膜上包被的是捕获DNA探针，其序列为一个或几个 通用序列，利用DNA的杂交捕获检测探针上与其互补的通用序列；质控线上包被的是质控 探针Control ftx)be，而两条检测线上分别包被了不同的捕获探针=ZW-I^PZM-T ；其中捕获 DNA探针浓度为20 μ M/L，包被捕获DNA探针用量为1 μ L/mm,捕获探针被溶解在含2%蔗糖 和5%甲醇的溶液中。
4.根据权利要求3所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其 特征在于所述捕获探针ZW-T的序列为5’ -TGCGGGTAATCG-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’，捕获探 针 ZM-T 的序列为 5，-CAGCATCGTGCG-TTTTTTTTTTTTTTTT-3，，质控探针 Control Probe 的序 列为 5 ‘-AGAGGAGTTGGGACC-AAAAAAAAAAAAAAA-3，。
5.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法， 其特征在于所述步骤O)中待测样本的制备采用裂解法抽提血清样品中KIF6基因组 DNA，然后对KIF6 DNA进行PCR扩增，即得；其中PCR扩增体系为10X缓冲液1. 5 μ l，Taq 酶，25mmol/L MgCl2 0. 8 μ l、25mmol/L dNTP 1 μ 1，上下游引物各 0. 5 μ 1，引物终浓度为 0. 5pmol/L ；扩增条件94°C变性 4 分钟；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒，35 个循环，72°C 延伸4分钟。
6.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其 特征在于所述步骤( 中的纳米金探针的序列为5，-P04-GGTCCCAACTCCTCT-TTTTTTTTTTT TTTT- (CH2) 3-SH-3，；连接探针 Z-KIF-I 序列为 5，-CGATTACCCGCA ACTCCCAGCATGAAC-3，，连 接探针 Z-KIF-2 的序列为 5，-CGCACGATGCTG ACTCCCAGCATGAAT-3，；Target DNA KIF-1 的 序列为 5' -AGAGGAGTTGGGACCGTTCATGCTGGGAGT-3'，TargetDNA KIF-2 的序列为 5' -AGA GGAGTTGGGACCATTCATGCTGGGAGT-3'。
7.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其 特征在于所述步骤O)中的运行缓冲液的成分为50mM/L的Tris-HCl，50mM/L的NaCl，2ml/L的Tween-20和0. 5g/L的十二烷基硫酸钠。
8.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法， 其特征在于所述步骤O)中的iTaq DNA连接酶缓冲液成分为200mmol/L的Tris-HCl， 250mmol/L 的 KAcO,IOOmmo1/L 的 MgAcO，IOmmol/L 的 NAD，1 % 的 Triton X-100， pH7. 6025 °C。
全文摘要
本发明涉及一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，包括(1)核酸横向流试纸条的制备；(2)取待测样本，变性，退火；取水、纳米金探针溶液、连接探针、Taq DNA连接酶缓冲液和Taq DNA连接酶，打匀，得混合液；向混合液中加入KIF-1、KIF-2或它们的混合液，打匀；然后加入待测样本，杂交连接，变性，退火，最后将所得溶液滴加在核酸横向流试纸条的结合区，将试纸条浸入区浸入运行缓冲液中，观察。本发明的方法操作简单，成本低，具有特异、快速、高分辨、高灵敏度的特点，可应用于临床医学中遗传病、传染性疾病、肿瘤以及心血管疾病中基因的单核苷酸多态性、基因型的检测以及不同病原微生物的鉴定。
文档编号C12Q1/68GK102134596SQ201010608280
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者毛红菊, 赵建龙, 邹能利, 金庆辉 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所