专利名称：一种提高ε-聚赖氨酸发酵产量的方法
技术领域：
本发明涉及诱变育种及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种提高ε -聚赖氨酸发酵产量的方法。
背景技术：
ε -聚赖氨酸(ε -polylysine, ε -PL)是20世纪80年代由日本首先发现的一种新型、安全、高效的防腐保鲜剂。在中性和偏酸性条件下对革兰阳性菌和革兰阴性菌、酵母及其他真菌、病毒都有抑制作用，具有抗菌谱广等特性。在欧美日等发达国家，ε -聚赖氨酸已被批准用于食品防腐剂，主要用于肉制品、高盐食品、快餐、色拉、蛋糕和面点类食品。由于聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，抑菌范围较广，成为高附加值的生物防腐保鲜剂。另外，ε -聚赖氨酸富含阳离子，被广泛用于医学和医药制造领域，具有广阔的市场前景。日本是生物发酵法生产ε-聚赖氨酸的主要国家，采用诱变育种是选育高产突变菌株行之有效的方法，诱变育种包括诱变和筛选两步，用诱变剂使细胞核物质发生突变，从变异群体中筛选出的菌株再进行诱变，然后再筛选，通过诱变和筛选的交替进行，选育出高产菌株，自然筛选分离出的白色链霉菌菌株产聚赖氨酸的能力很低，从而限制了对它的进一步研究和利用。为了提高生物发酵法生产ε_聚赖氨酸的产量，本发明对白色链霉菌菌株采用了微波、化学试剂诱变的方法，以此提高该菌株发酵产量，为大规模工业化发酵生产ε -聚赖氨酸提供科学的理论依据和有效的实践经验。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高ε -聚赖氨酸发酵产量的方法，其是通过微波、硫酸二乙酯复合诱变的方法，显著提高白色链霉菌CGMCC 4. 121的正突变率，从而获得高产菌株用于发酵生产ε-聚赖氨酸。为了实现本发明目的，本发明的一种提高聚赖氨酸发酵产量的方法，其是将白色链霉菌CGMCC 4. 121的菌悬液在室温下以200r/min 250r/min振荡培养Ih 釙小时，然后进行微波和硫酸二乙酯复合诱变，将诱变后的白色链霉菌进行发酵生产ε -聚赖氨酸。前述的方法，所述白色链霉菌CGMCC 4. 121的菌悬液是将白色链霉菌CGMCC 4. 121与生理盐水混合形成浓度为IO6 IO8个细胞/mL。前述的方法，微波的条件为M50MHz，850W，微波的时间为20 70s，优选为30 50s，更优选为40s。前述的方法，所述硫酸二乙酯的浓度为1 ν/ν % 4ν/ν %，处理时间为60 120min，优选为70 90min，更优选为80min。前述的方法，诱变后的白色链霉菌使用筛选平板培养基进行培养，所述筛选平板培养基配方为葡萄糖10g/L、酵母膏4g/L、小麦胚芽lg/L和琼脂粉20g/L，以水配制；培养温度为，培养时间7 8天。
前述的方法，诱变后的白色链霉菌使用发酵培养基进行发酵培养，所述发酵培养基配方为葡萄糖 50g/L、(NH4)2SO4 10g/L, K2HPO4 1. 6g/L, KH2PO4 0. 8g/L,MgSO4 0. 5g/L 和酵母膏5，以水配制，ρΗ6· 8，培养条件为280C，300r/min,培养时间7 8天。本发明提供的微波、化学试剂复合诱变的方法能够显著提高白色链霉菌的正突变率，从而提高ε-聚赖氨酸发酵水平。结果表明ε-聚赖氨酸摇瓶发酵水平由0.60g/L提高到0. 85g/L，该方法简单易行。此外，本发明提供的方法对其他菌株的诱变具有一定的借鉴意义。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例11)平板筛选培养将白色链霉菌str印tomyces albulus (CGMCC4. 121)在无菌条件下接种于平板筛选培养基上，28°C恒温培养7 8d。2)将步骤1)培养的菌种挑选80株在无菌条件下接种到发酵瓶中J8°C，300r/ min，恒温培养8d。其中步骤1)使用的筛选平板培养基配方(g/L):葡萄糖10，酵母膏4，小麦胚芽1， 琼脂粉20。其中步骤2)使用的发酵培养基配方(g/L):葡萄糖50，(NH4)2SO4 10, K2HPO4 1.6， KH2PO4 0. 8，MgSO4 0. 5，酵母膏 5，ρΗ6· 8。发酵培养过程条件下，300r/min，恒温培养8d，平均发酵水平达到0. 60g/L。实施例21)将白色链霉菌与生理盐水混合形成浓度为IO6个细胞/mL。经200r/min振荡培养1小时后进行微波辐射20s，再经硫酸二乙酯处理60min，立即涂筛选平板进行培养。2)平板筛选培养将经过复合诱变的白色链霉菌str印tomyces albulus (CGMCC 4. 121)在无菌条件下接种于筛选平板培养基上，28°C恒温培养7 8d。3)将步骤幻培养的菌种随机挑选80株在无菌条件下接种到发酵瓶中J8°C， 300r/min，恒温培养8d。其中步骤幻使用的筛选平板培养基配方(g/L)葡萄糖10，酵母膏4，小麦胚芽1， 琼脂粉20。其中步骤3)使用的发酵培养基配方(g/L)葡萄糖50，(NH4)2SO4 10，K2HPO4 1.6, KH2PO4 0. 8，MgSO4 0. 5，酵母膏 5，ρΗ6· 8。发酵培养过程条件下，300r/min，恒温培养8d，平均发酵水平达到0. 78g/L。实施例31)将白色链霉菌与生理盐水混合形成浓度为IO8个细胞/mL。经200转/分钟振荡培养1小时后进行微波辐射40s，再经乙酸二乙酯处理80min，立即涂筛选平板进行培养。2)平板筛选培养将经过复合诱变的白色链霉菌str印tomyces albulus (CGMCC 4. 121)在无菌条件下接种于平板筛选培养基上，28°C恒温培养78d。3)将步骤幻培养的菌种随机挑选80株在无菌条件下接种到发酵瓶中J8°C， 300r/min，恒温培养8d。
其中步骤幻使用的平板筛选培养基配方(g/L):葡萄糖10，酵母膏4，小麦胚芽1， 琼脂粉20。其中步骤3)使用的发酵培养基配方(g/L):葡萄糖50，(NH4)2SO4 10, K2HPO4 1.6， KH2PO4 0. 8，MgSO4 0. 5，酵母膏 5，ρΗ6· 8。发酵培养过程条件下，300r/min，恒温培养8d，平均发酵水平达到0. 85g/L。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种提高ε-聚赖氨酸发酵产量的方法，其特征在于，将白色链霉菌CGMCC 4. 121的菌悬液在室温下以200r/min 250r/min振荡培养Ih 5h，然后进行微波和硫酸二乙酯复合诱变，将诱变后的白色链霉菌进行发酵生产聚赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白色链霉菌CGMCC4. 121的菌悬液是将白色链霉菌CGMCC 4. 121与生理盐水混合形成浓度为IO6 IO8个细胞/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，微波的条件为M50MHz，850W，微波的时间为20 70s。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，微波的时间为30 50s。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，微波的时间为40s。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述硫酸二乙酯的浓度为lv/v% 4v/v%，处理时间为60 120min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，硫酸二乙酯的处理时间为70 90min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，硫酸二乙酯的处理时间为80min。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，诱变后的白色链霉菌使用筛选平板培养基进行培养，所述筛选平板培养基配方为葡萄糖10g/L、酵母膏4g/L、小麦胚芽lg/L和琼脂粉20g/L，以水配制；培养温度为^°C，培养时间7 8天。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，诱变后的白色链霉菌使用发酵培养基进行发酵培养，所述发酵培养基配方为葡萄糖50g/L、(NH4)2SO4 10g/L、K2HPO4 1. 6g/L、 KH2PO4 0. 8g/L、MgS04 0. 5g/L 和酵母膏 5，以水配制，pH6. 8，培养条件为 28°C，300r/min，培养时间7 8天。
全文摘要
本发明提供了一种提高ε-聚赖氨酸发酵产量的方法，其是通过微波、硫酸二乙酯复合诱变的方法，显著提高白色链霉菌CGMCC4.121的正突变率，从而获得高产菌株用于发酵生产ε-聚赖氨酸，结果表明ε-聚赖氨酸摇瓶发酵水平由0.60g/L提高到0.85g/L。
文档编号C12N13/00GK102154392SQ20101060920
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者张海涛, 李荣杰 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司