专利名称：致病性嗜水气单胞菌的lamp检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种利用环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术快速检测致病性嗜水气单胞菌所 用的试剂盒及检测方法。
背景技术：
嗜水气单胞菌(Aeromona hydrophila)是条件致病菌，广泛存在于水和土壤中， 可引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类及哺乳动物类等多种动物的全身性败血症或局部感 染，常导致动物大量死亡，亦可引起人的败血症，脑膜炎和肠炎腹泻。嗜水气单胞菌是我国 养鱼史上危害鱼的种类最多，流行地区最广，流行季节最长，危害养鱼水域类别最多，造成 的损失最严重的一种急性传染病病原。自90年代在全国大范围流行以来，许多水产养殖 动物都可以被感染发病，如鲫、鳊、鲮、鲤、鲢、鳙、草鱼、香鱼、狼鲈、鳟鱼、尼罗非鱼、鲶鱼、鮰 鱼、黄鳝、鳖、鳜鱼和蛙等。嗜水气单胞菌有致病性菌株和非致病性菌株之分。目前已被证实的致病因子有外 毒素、蛋白酶、S蛋白、菌毛、外膜蛋白及载铁体等。致病性嗜水气单胞菌引起的疾病不仅给 水产养殖业带来严重的经济损失，还可通过水产动物和水产品感染人畜，导致人畜腹泻和 食物中毒，影响人类健康。目前的致病性嗜水气单胞菌检测方法步骤繁多，包括将分离后的 菌体进行菌落分析、氧化酶试验、AHM鉴别培养、吲哚试验、革兰氏染色、糖发酵试验，之后进 一步进行致病性鉴别，包括脱脂奶平板和斑点酶联免疫等试验步骤。这些方法操作比较烦 琐，对实验结果的数据处理需要对菌落形态，生化特性进行人为的比较，判定，其准确性往 往因人而异，难以把握，且费时。LAMP是一种新型的核酸等温扩增技术，该技术针对靶基因的6个区域设计6条特 异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下即可完成核酸扩 增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增 强了反应的特异性并缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，在等温条件下 就能完成反应，且扩增产物用肉眼能观察，可用于病原微生物的现场快速检测。因此，本发明采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术，通过检测嗜水气单胞菌的致病因子四型菌毛编码基因，来检测致病性嗜水气单 胞菌，这在国内外尚无报道。该方法的建立为由致病性嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病 诊断提供技术支撑。
发明内容
本发明要解决目前致病性嗜水气单胞菌检测步骤繁多、操作烦琐、对检测的数据 处理费时且准确性难以把握的问题，为此提供致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒和 检测方法。本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测 方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案包括建立致病性嗜水气单胞菌的LAMP 检测试剂盒及用该试剂盒检测致病性嗜水气单胞菌的方法。本发明致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括细菌DNA提取试剂和LAMP 反应试剂，所述LAMP反应试剂中含有用于检测致病性嗜水气单胞菌的LAMP扩增用核酸引 物组，该引物组包含弓I物AH. PV-FIP、弓I物AH. PV-BIP、弓|物AH. PV-F3、引物AH. PV-B3，其特 殊之处是所述引物AH. PV-FIP、引物AH. PV-BIP、引物AH. PV-F3、引物AH. PV-B3分别为AH. PV-FIP GTTTCCCCCATCAGATCCGTGGTTTACGCCACCCAGTTTCTTGAH. PV-BIP TCCGGCCTGTATACCTGTATCAGGTTAAACCAGGGTGTCATCGCTAH.PV-F3 TGATGGCACGAGACATCCAAH. PV-B3 TGCTTGATCCCCTTGCTACT所述LAMP反应试剂包括以下组分(I)LAMP 预反应液20 25mM pH 为 8. 2 9. 0 的 Tris_HCl、6 IOmM 硫酸镁、 10 12mM 氯化钾、8 12mM硫酸按、0. 1 0. 2% Triton X_100(或是 0. 1 0. 2% Tween 20)、1 1. 6mM dNTP、0. 6 1. OM 甜菜碱、1. 5 2. 2uM 所述引物 AH. PV-FIP、1. 5 2. 2uM 所述引物 AH. PV-BIP,0. 15 0. 3uM 所述引物 AH. PV_F3、0. 15 0. 3uM 所述引物 AH. PV-B3 ；(2)聚合酶每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶；(3) LAMP反应稳定液由矿物油或液体石蜡油组成；(4) LAMP反应显色液含有10% SYBR Green工的荧光染料；所述细菌DNA提取试剂包含以下组分TE缓冲液，5-15mM Tris, 0. 5-1. 5mM EDTA, pH 8.0 ；溶菌酶，浓度 10-20mg/mL，pH8. 0 ；蛋白酶 K 溶液，浓度 10_20mg/mL，pH8. 0 Jris 饱 和酚，ρΗ8· 0 ；乙酸钠，浓度2-5mol/L ；乙醇，浓度95 %。本发明所述LAMP预反应液还含有0. 6 1. 2uM引物AH. PV-LB和0. 6 1. 2uM引 物AH. PV-LF,所述引物AH. PV-LB和引物AH. PV-LF分别为AH. PV-LF GACCGGCTGCCAGAAGGAGAH. PV-LB :GTGCGCTATGACAACGATGAA。本发明所述试剂盒还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为致 病性嗜水气单胞菌基因组DNA，所述的阴性对照试样为非致病性嗜水气单胞菌基因组DNA。本发明所述的引物是根据在线软件PrimerExplorerV4 (http //primerexplorer. ip/e/)设计和手工修改而得，这六条引物能特异识别靶序列的八个不同位点，增加了扩增 的特异性，并在反应中产生茎环结构。本发明致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测方法，其特殊之处是按以下步骤(I)DNA 抽提挑取纯化的菌落若干加入到pH8. 0的100 μ L TE缓冲液中振荡混勻，加入100 μ L 溶菌酶溶液，37°C保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10 μ L于55°C保温1_2小时，加同体积 Tris饱和酚，pH8. 0,强烈振荡，12000rpm离心5分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液， 加入0. 1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混勻，再加等体积的冰乙醇，混勻后低温静置30分钟， 12000rpm离心5分钟，弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000rpm离心5分钟，弃上清，加入100 μ L TE溶液，得到待检基因组DNA溶液；(2)致病性嗜水气单胞菌的LAMP扩增①.根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N，N=样品数+2(其中1管 为阳性对照，1管为阴性对照)；②.吸取LAMP预反应液的体积为NX 23uL，加入一洁净的1. 5mL离心管中，然后加 入N u L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；③.向设定的N个反应管中分别加入Mu L②步所述混合液，向上述N个PCR反 应管内按顺序依次分别加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对照DNA各IuL ；④.然后在上述每个反应管中再分别加入30u L LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做 好标记，2000转/分钟离心5秒；⑤.在61 °C 67 °C下恒温反应40 70分钟；(3)显色检测取出LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品 和阳性对照的顺序依次分别加入IuL显色液，轻轻混勻，直接用肉眼观察颜色变化。也可以用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪 下观察，如果发现有阶梯状的扩增特征条带，说明样品中有致病嗜水气单胞菌。本发明利用环介导等温扩增技术快速检测致病性嗜水气单胞菌的检测方法，在已 试验的沈种不同种或同种的细菌进行了检测，结果都符合预期。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)本发明根据靶基因序列设计了致病嗜水气单胞菌检测用引物组，能特异性识 别靶序列上的八个独立区域，在BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA 区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环 DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利 进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了致病嗜 水气单胞菌检测的特异性；(2)采用本发明的引物组对致病嗜水气单胞菌进行检测，因为特异性高，所以可以 根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；(3)本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测致病嗜水气单 胞菌，检测灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；(4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊 试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；(5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到Ih即可完成扩增，且产率 尚；(6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后， 阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；(7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立 成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；(8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的环介导等温扩增反应体系，不但使得致病性嗜水气单胞菌定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且可用于 鱼、虾、蟹类养殖过程中各时期的致病性嗜水气单胞菌跟踪检测，避免该病原菌传播流行， 提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
图1引物种特异性测试图；M. IOObp DNA Marker ；1.嗜水气单胞菌 ATCC7966 ；2.嗜水气单胞菌 BSK-10 ；3.嗜 水气单胞菌TPS-30 ;4.嗜水气单胞菌PPL0711 ;5.嗜水气单胞菌BJK0805 ;6.温和气单胞 菌ATCC43979 ;7.豚鼠气单胞菌ATCC15468 ;8.兽生气单胞菌ATCC51108 ;9.异嗜糖气单 胞菌ATCC51208 ;10.中间气单胞菌ATCC33907 ;11.嗜泉气单胞菌ATCC23309 ； 12.小鱼气 单胞菌ATCC49904 ;13.大肠杆菌ATCC25922 ;14.金黄色葡萄球菌ATCC25923 ； 15.铜绿假 单胞菌ATCC27853 ;16.哈维氏弧菌ATCC33842 ;17.副溶血弧菌ATCC33847 ;18.溶藻弧菌 ATCC17749 ； 19.迟钝爱德华氏菌TL5m ;20.阴性对照。图2致病性嗜水气单胞菌特异性检测图。M. IOObp DNA Marker ；1.嗜水气单胞菌 ATCC7966 ；2.嗜水气单胞菌 BSK-10 ；3.嗜 水气单胞菌TPS-30 ;4.嗜水气单胞菌PPL0711 ;5.嗜水气单胞菌BJK0805 ;6.嗜水气单胞 菌YBH0907L ；7.嗜水气单胞菌CL99920 ；8.嗜水气单胞菌TL0903 ；9.嗜水气单胞菌TYG ； 10.嗜水气单胞菌A541 ;11.嗜水气单胞菌XY2005 ;12.嗜水气单胞菌HFJ0907L ； 13.阴性 对照。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。一 ) DNA 抽提挑取疑似菌落加入到0. 4mL TE缓冲液(pH8. 0)中振荡混勻。加入100 μ L溶菌酶 溶液，37°C保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μ L于55°C保温1_2小时，加同体积Tris饱 和酚(pH8. 0)，强烈振荡，IlOOOg离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0. 1倍 体积的乙酸钠(3mol/L)，混勻，再加等体积的冰乙醇，混勻后低温静置30分钟，15000g离心 5分钟，弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下15000g离心5分钟，弃上清，加入50 μ L TE 溶液，得待检基因组DNA溶液，置-20°C保存。二)环介导等温扩增致病性嗜水气单胞菌特异基因区根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N，N =样品数+1管阳性对照+1 管阴性对照；吸取LAMP预反应液的体积为NX23uL，加入一洁净的1. 5mL离心管中，然后加 入N u L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；向 设定的N个反应管中分别加入MuL上述混合液，然后在上述每个反应管中再分别加入30u L LAMP反应稳定液，2000转/分钟离心5秒；向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入 阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对照DNA各luL，盖紧管盖并做好标记；在61°C 67X 下恒温反应40 70分钟；80°C灭活5min。取出LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟 离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入IuL显色液，轻轻混勻， 直接用肉眼观察颜色变化或用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，可发现阶梯状的扩增特征条带，说明样品中有致病嗜水气单胞菌。采用上述快速诊断试剂盒和方法进行LAMP检测嗜水气单胞菌种特异性和致病性 嗜水气单胞菌特异性试验结果如附图1和2所示。图1引物种特异性测试图，如图所示，仅致病性嗜水气单胞菌能扩增出阶梯状的 扩增特征条带，其它种的菌株无阶梯状的扩增特征条带，表明对非嗜水气单胞菌无交叉扩 增性。M. IOObp DNA Marker ；1.嗜水气单胞菌 ATCC7966 ；2.嗜水气单胞菌 BSK-10 ；3.嗜 水气单胞菌TPS-30 ;4.嗜水气单胞菌PPL0711 ;5.嗜水气单胞菌BJK0805 ;6.温和气单胞 菌ATCC43979 ;7.豚鼠气单胞菌ATCC15468 ;8.兽生气单胞菌ATCC51108 ;9.异嗜糖气单 胞菌ATCC51208 ;10.中间气单胞菌ATCC33907 ;11.嗜泉气单胞菌ATCC23309 ； 12.小鱼气 单胞菌ATCC49904 ;13.大肠杆菌ATCC25922 ； 14.金黄色葡萄球菌ATCC25923 ； 15.铜绿假 单胞菌ATCC27853 ;16.哈维氏弧菌ATCC33842 ； 17.副溶血弧菌ATCC33847 ； 18.溶藻弧菌 ATCC17749 ； 19.迟钝爱德华氏菌TL5m ;20.阴性对照。图2致病性嗜水气单胞菌特异性检测图，如图所示，仅致病性嗜水气单胞菌能扩 增出阶梯状的扩增特征条带，表明对致病菌株筛选特异性强。M. IOObp DNA Marker ；1.嗜水气单胞菌 ATCC7966 ；2.嗜水气单胞菌 BSK-10 ；3.嗜 水气单胞菌TPS-30 ;4.嗜水气单胞菌PPL0711 ;5.嗜水气单胞菌BJK0805 ;6.嗜水气单胞 菌YBH0907L ；7.嗜水气单胞菌CL99920 ；8.嗜水气单胞菌TL0903 ；9.嗜水气单胞菌TYG ； 10.嗜水气单胞菌A541 ;11.嗜水气单胞菌XY2005 ;12.嗜水气单胞菌HFJ0907L ； 13.阴性 对照。
权利要求
1.致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括细菌DNA提取试剂和LAMP反应试剂， 所述LAMP反应试剂中含有用于检测致病性嗜水气单胞菌的LAMP扩增用核酸引物组，该引 物组包含引物AH. PV-FIP、引物AH. PV-BIP、引物AH. PV-F3、引物AH. PV-B3，其特征是所述引 物 AH. PV-FIP、引物 AH. PV-BIP、引物 AH. PV-F3、引物 AH. PV-B3 分别为AH. PV-FIP GTTTCCCCCATCAGATCCGTGGTTTACGCCACCCAGTTTCTTGAH. PV-BIP TCCGGCCTGTATACCTGTATCAGGTTAAACCAGGGTGTCATCGCTAH. PV-F3 TGATGGCACGAGACATCCAAH. PV-B3 TGCTTGATCCCCTTGCTACT所述LAMP反应试剂包括以下组分(1)LAMP预反应液20 25mMpH为8. 2 9. 0的Tris-HCl、6 IOmM硫酸镁、10 12mM 氯化钾、8 12mM 硫酸按、0. 1 0. 2% Triton X_100(或是 0. 1 0. 2% Tween 20)、 1 1. 6mM dNTP、0. 6 1. OM 甜菜碱、1. 5 2. 2uM 所述引物 AH. PV-FIPU. 5 2. 2uM 所述 引物 AH. PV-BIP、0. 15 0. 3uM 所述引物 AH. PV_F3、0. 15 0. 3uM 所述引物 AH. PV-B3 ；(2)聚合酶每微升含8个活性单位的BstDNA聚合酶；(3)LAMP反应稳定液由矿物油或液体石蜡油组成；(4)LAMP反应显色液含有10%SYBR Green工的荧光染料；所述细菌DNA提取试剂包含以下组分TE缓冲液，5-15mM Tris, 0. 5-1. 5mM EDTA, pH 8. 0 ；溶菌酶，浓度 10-20mg/mL，pH8. 0 ；蛋白酶 K 溶液，浓度 10_20mg/mL，pH8. 0 ；Tris 饱和 酚，ρΗ8· 0 ；乙酸钠，浓度2-5mol/L ；乙醇，浓度95 %。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述LAMP预反应液还含有0.6 1. 2uM引物 AH. PV-LB和0. 6 1. 2uM引物AH. PV-LF,所述引物AH. PV-LB和引物AH. PV-LF分别为AH. PV-LF :GACCGGCTGCCAGAAGGAGAH. PV-LB :GTGCGCTATGACAACGATGAA。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述 阳性对照试样为致病性嗜水气单胞菌基因组DNA，所述的阴性对照试样为非致病性嗜水气 单胞菌基因组DNA。
4.致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测方法，其特征是按以下步骤(1)DNA抽提挑取纯化的菌落若干加入到pH8. 0的100 μ L TE缓冲液中振荡混勻，加入100 μ L溶菌 酶溶液，37°C保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10 μ L于55°C保温1_2小时，加同体积Tris 饱和酚，PH8. 0，强烈振荡，12000rpm离心5分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0. 1 倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混勻，再加等体积的冰乙醇，混勻后低温静置30分钟，12000rpm 离心5分钟，弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000rpm离心5分钟，弃上清，加入 100 μ L TE溶液，得到待检基因组DNA溶液；(2)致病性嗜水气单胞菌的LAMP扩增①.根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N，N =样品数+2 (其中1管为阳 性对照，1管为阴性对照)；②.吸取权利要求1所述LAMP预反应液的体积为NX23uL，加入一洁净的1.5mL离心 管中，然后加入N u L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000转/分钟离心10秒，取上清 之混合液；③.向设定的N个反应管中分别加入MuL②步所述混合液，向上述N个PCR反应管 内按顺序依次分别加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对照DNA各IuL ；④.然后在上述每个反应管中再分别加入30uL LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标 记，2000转/分钟离心5秒；⑤.在61°C 67°C下恒温反应40 70分钟； (3)显色检测取出LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳 性对照的顺序依次分别加入IuL显色液，轻轻混勻，直接用肉眼观察颜色变化。
全文摘要
使用方便，检测快速的致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括细菌DNA提取试剂和LAMP反应试剂，反应试剂中含引物FIPGTTTCCCCCATCAGATCCGTGGTTTACGCCACCCAGTTTCTTG、BIPTCCGGCCTGTATACCTGTATCAGGTTAAACCAGGGTGTCATCGCT、F3TGATGGCACGAGACATCCA、B3TGCTTGATCCCCTTGCTACT；致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测方法(1)DNA抽提；(2)致病性嗜水气单胞菌的LAMP扩增；(3)显色检测。本发明适合检测致病性嗜水气单胞菌。
文档编号C12Q1/68GK102140512SQ20101061157
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者姚嘉赟, 尹文林, 徐洋, 沈锦玉, 潘晓艺, 郝贵杰 申请人:浙江省淡水水产研究所