专利名称：在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法
技术领域：
本发明属于动物细胞工程领域，具体涉及一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法。
背景技术：
动物细胞的大规模培养已经广泛应用于生物医药制品的生产。近年来，代谢工程和代谢分析发展迅速，但是代谢分析基本上都基于细胞群体培养所得到的数据，由于细胞生长和代谢的不同步，部分掩盖了细胞的一些代谢行为。如果应用单个细胞进行研究，不仅存在技术上的困难，而且由于数量太少难以进行定量分析，可行的方法就是使得细胞群体同步生长，用同步化生长的群体细胞动力学特性来反映细胞真实的代谢行为。动物细胞同步化生长的控制方法，主要有化学方法和物理方法。使用化学方法阻断细胞周期，可以获得较高的同步化效率，同时也有多种化学试剂可供选择，但是这类化学试剂价格极为昂贵，不适合于在生物反应器上对规模化培养的动物细胞大量使用，且该类化学试剂均具有一定的毒性，对操作人员健康存在安全隐患。通过物理方法进行细胞周期同步化控制也存在其自身弊端，因为需要使用一些特殊实验设备，如梯度离心设备等，此外物理方法制备同步化细胞耗时长，操作过程容易污染且制备量太小，往往不能满足研究的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，可安全、简单、方便地控制动物细胞的同步化生长，以适应对动物细胞大规模培养的需要。本发明提供一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，包括如下步骤(1)在反应器中，用含有甘油的培养基培养哺乳动物细胞，每代次生长至M 30h 后，将反应器迅速降温，使所述哺乳动物细胞在4°C下进行低温胁迫培养0. 5 Ih ；(2)将反应器升温，使低温胁迫培养后的哺乳动物细胞在37°C培养16 18h，获得基本处于细胞周期同步化生长状态的动物细胞。所述哺乳动物细胞为HEK293细胞或Marc 145细胞。步骤(1)中低温胁迫培养时间为lh。所述培养基中甘油的浓度为5 10g/L，优选8g/L。经研究表明，HEK293细胞和Marcl45细胞在4°C低温下，细胞代谢几近停止，而细胞膜却未出现损伤，但细胞存活率随着4°C低温时间的延长而明显下降；为能有效减缓甚至停止细胞的正常代谢活动，同时又能维持细胞的基本活力不变，本发明采用4°C下低温胁迫1小时，两种细胞的存活率基本可维持在92%以上。然后将反应器温度直接升到37°C， 继续培养细胞，细胞逐步开始恢复生长代谢，但HEK293细胞恢复生长至18小时，细胞逐步
3出现G2/M期的阻滞，Marc 145细胞恢复生长至16小时，细胞逐步出现G2/M期的阻滞。随后细胞即开始同步化生长。本发明操作简单，安全、方便、规模大，能够应用于生物反应器上大规模悬浮培养的细胞，对研究细胞同步化生长、群体代谢、病毒增殖、蛋白表达有着重大的应用价值。下面将结合附图和实施例，对本发明作进一步说明。
图1(1)表示4°C低温胁迫的不同时间，对HEK293细胞存活率的影响。图1 O)表示4°C低温胁迫的不同时间，对Marcl45细胞存活率的影响。图2(1) 图2(6)表示4°C低温胁迫1小时后，37°C恢复培养时间的不同，对 HEK293细胞的细胞周期分布的影响；其中图2(1)表示正常培养细胞对照；图2(2) 图2(6)表示4°C低温胁迫1小时，37°C恢复培养时间分别为0小时、6 小时、12小时、18小时、24小时的HEK293细胞的细胞周期分布。图3(1)表示HEK293细胞形态，图中箭头表示处于G2/M期的细胞；图3(2)表示Marcl45细胞形态，图中微载体培养的处于G2/M期Marcl45细胞呈现出细胞个体增大、从微载体上突起的状态。图3 (1)表示经4°C低温胁迫处理Ih后，悬浮培养的HEK293细胞在37°C恢复培养 1 后的细胞形态图，观察条件为倒置显微镜下，20倍物镜观察并拍摄；图3 (2)表示经4°C低温胁迫处理Ih后，微载体悬浮培养的Marcl45细胞在37°C 恢复培养IWi后的细胞形态图，观察条件为倒置显微镜下，20倍物镜观察并拍摄。
具体实施例方式实施例1. 4°C低温胁迫不同时间对HEK293细胞和Marcl45细胞存活率的影响用悬浮培养法培养HEK293细胞，用微载体悬浮培养法培养Marcl45细胞，具体方法如下1.悬浮培养HEK293细胞以3X IO5个细胞/毫升的初始密度接种于250ml摇瓶中，悬浮培养的培养基成分如下表所示
权利要求
1.一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，包括如下步骤(1)在反应器中，用含有甘油的培养基培养哺乳动物细胞，每代次生长至M 30h后， 将反应器迅速降温，使所述哺乳动物细胞在4°C下进行低温胁迫培养0. 5 1h ；(2)将反应器升温，使低温胁迫培养后的哺乳动物细胞在37°C培养16 18h，获得基本处于细胞周期同步化生长状态的动物细胞。
2.根据权利要求1所述在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞为HEK293细胞或Marcl45细胞。
3.根据权利要求1或2所述在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，其特征在于步骤(1)中低温胁迫培养时间为lh。
4.根据权利要求1所述在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，其特征在于所述培养基中甘油的浓度为5 10g/L。
5.根据权利要求4所述在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，其特征在于所述培养基中甘油的浓度为8g/L。
全文摘要
本发明涉及一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，在反应器中用含有甘油的培养基培养哺乳动物细胞，每代次生长至24～30h后，将反应器迅速降温，使所述哺乳动物细胞在4℃下进行低温胁迫培养0.5～1h，随后将反应器升温，使低温胁迫培养后的哺乳动物细胞在37℃培养16～18h，获得基本处于细胞周期同步化生长状态的动物细胞。本发明操作简单，安全、方便、规模大，对研究细胞同步化生长、群体代谢、病毒增殖、蛋白表达有着重大的应用价值。
文档编号C12N5/071GK102154196SQ20101061736
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者侯继波, 冯磊, 吴培培 申请人:国家兽用生物制品工程技术研究中心