专利名称：一种肾功能不全治疗用的自体干细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是干细胞及其制备方法，具体地说是一种肾功能不全治疗用的脂肪 来源的自体干细胞及其制备方法。
背景技术：
肾功能不全(renal insufficiency)是由多种原因引起的，肾小球严重破坏，使身 体在排泄代谢废物和调节水电解质、酸碱平衡等方面出现紊乱的临床综合症后群。分为急 性肾功能不全和慢性肾功能不全。肾功能不全可分为四期一期肾功能储备代偿期；二期 肾功能不全期；三期肾功能衰竭期；四期尿毒症期或肾功能不全终末期。其是世界公认的 疑难顽症，预后严重，是威胁生命的主要病症之一。尿毒症被称为第二癌症，是各种慢性肾 病肾功能恶化、衰竭的终末阶段。目前对肾病的治疗，包括早期的激素，免疫抑制剂和抗菌 素治疗及病情后期的透析与换肾，方法虽可行，但长期持续的透析只能是维持，达不到治疗 的目的，因欠缺器官捐赠致使换肾机会可能遥遥无期，而肾移植成功率目前还不太高，排异 现象目前还难以彻底解决，且费用昂贵，给患者带来较大的心理压力和经济压力。只是在病 人肾衰竭严重时，用透析治疗或肾脏移植来维持病人的生命。近来，对于干细胞研究的不断深入，干细胞对许多疾病的独特疗效逐步受到重视。 干细胞疗法是利用干细胞的自我复制和分化潜能来替代、修复患者受损的细胞，恢复受损 器官、组织的正常功能。干细胞疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的 有效方法，是传统疗法无能为力的“不治之症”的新疗法和新希望，是目前疾病治疗的新远
旦
ο虽然胚胎干细胞在理论上具有很高的评价，但在宗教和伦理上有着潜在的限制。 成体干细胞是存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且具有 多向分化潜能。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中，来源广泛，取材方便，且没有胚 胎干细胞所涉及的伦理问题，已成为普遍研究和应用的对象。骨髓间充质干细胞是目前应 用最多的种子细胞，然而，骨髓间充质干细胞的采集获得又常常需麻醉后，进行骨髓穿刺， 会给患者带来痛苦，且麻醉会引起意外，而且采集量有限。近年来也有采用外周血干细胞进 行治疗的报导，虽然采集容易，但是外周血中间充质干细胞的含量极少，不是十分理想的选 择。脂肪干细胞(adipose-derived stem cell，ASC)是存在于脂肪组织中的间充质干 细胞。由^ik等于2001年首次从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离获得，在体外培养 中保持着稳定的生长增殖活性，而且和间充质干细胞一样具有多向分化潜能，可向脂肪、成 骨、软骨、成肌、神经元等多向分化，并且它的获取比常用的骨髓间充质干细胞容易且量大， 具有重复性，给患者带来的痛苦很小。ASC体外扩增能力强，扩增速度快。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是内皮细胞的前体细胞、多功 能干细胞。具有自我自我分化和增值能力，能定向归巢。内皮祖细胞有促进内皮细胞再生 和促进血管再生的功能。
然而，干细胞的应用都不可避免地面对一个关键问题，即异体应用时干细胞的免 疫排斥反应。而患者自身来源的干细胞经体外扩增、定向诱导分化后再回输到体内的一对 一个性化治疗，可以克服异体的排斥反应。因而ASC可为多种疾病的治疗提供充足的种子 细胞。目前国内外尚无应用诱导分化的ASC移植治疗肾功能不全的文献报道。因此，开发 用于治疗肾功能不全的干细胞及其制备方法具有特别重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的旨在克服肾功能不全常规治疗方法的缺陷，提供一种肾功能不全 治疗用的干细胞及其制备方法。本发明涉及的干细胞采取的技术方案为从患者腹部或者臀部抽吸脂肪组织，分 离提纯、扩增培养脂肪干细胞(ASC)，诱导分化成治疗肾功能不全用的内皮祖细胞(EPC)。本发明涉及的肾功能不全治疗用自体干细胞及其制备方法包括以下步骤
a、在无菌条件下从患者腹部或者臀部抽吸脂肪组织，用PBS缓冲液反复冲洗3次去除 红细胞和其它细胞碎片后，剪碎，加入2 3倍体积的含0. 075% 0. 1% I型胶原酶的PBS 缓冲液，37°C水浴中充分振荡消化30min以上。b、而后加入等量的含10%自体血清或人AB血清的DMEM培养液中和胶原酶， IOOOrpm离心lOmin，去除漂浮的脂肪细胞和上清液，获得的细胞沉淀加入14(Tl80mM NH4Cl 的PBS缓冲液重新悬浮，室温静置IOmin裂解红细胞后，IOOOrpm离心IOmin弃去上清液，获 得细胞沉淀。C、获得的细胞沉淀经PBS缓冲液洗涤后，用含10%自体血清或人AB血清、100U/mL 青霉素、100 g/mL链霉素的DMEM培养液重悬，以约104/cm2密度接种至IOOmm培养皿中， 在37°C、5%C02、饱和湿度为100%的培养箱中培养，4 后首次换液；待细胞生长至80%以上 融合时，用0. 25%胰酶/EDTA消化、按1 3的比例传代。d、选取第2 4代的细胞，用0. 25%胰酶/EDTA消化后，接种在含1 lOng/mL人 重组血管内皮生长因子(hrVEGF)，0. 05 0. 2 mol/L atorvastatin和5% 20%患者自 体血清或人AB血清的X-vivo-15培养液中，培养3 4d，诱导分化成肾功能不全治疗用的 自体干细胞(EPC)。本发明具有如下突出特点
1、按照本发明提供的制备方法，可以从自体脂肪组织中分离提纯、扩增培养脂肪干细 胞(ASC)，并且将其诱导分化成内皮祖细胞(EPC)。2、按照本发明提供的制备方法制备的干细胞可用于肾功能不全患者的治疗。脂肪 来源的干细胞具有获取容易，安全简便，痛苦小，并且体外增殖速度快，可获取足够的细胞 用于移植等优点；自体移植克服异体的排斥反应，本发明制备的干细胞回输治疗肾功能不 全患者时，治疗效果明显、安全性好、无明显毒副作用和不良反应。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明
a、在无菌条件下从患者腹部或者臀部抽吸脂肪组织，用PBS缓冲液反复冲洗3次去除 红细胞和其它细胞碎片后，剪碎，加入2 3倍体积的含0. 075% 0. 1% I型胶原酶的PBS
4缓冲液，37°C水浴中充分振荡消化30min以上。b、而后加入等量的含10%自体血清或人AB血清的DMEM培养液中和胶原酶， 1000rpm离心10min，去除漂浮的脂肪细胞和上清液，获得的细胞沉淀加入140~l80mM NH4Cl 的PBS缓冲液重新悬浮，室温静置IOmin裂解红细胞后，1000rpm离心10min弃去上清液，获 得细胞沉淀。C、获得的细胞沉淀经PBS缓冲液洗涤后，用含10%自体血清或人AB血清、100U/mL 青霉素、100 g/mL链霉素的DMEM培养液重悬，以约104/cm2密度接种至IOOmm培养皿中， 在37°C、5%C02、饱和湿度为100%的培养箱中培养，48h后首次换液；待细胞生长至80%以上 融合时，用0. 25%胰酶/EDTA消化、按1 3的比例传代。d、选取第2 4代的细胞，用0. 25%胰酶/EDTA消化后，接种在含1 10ng/ mL hrVEGF, 0. 05 0. 2 mol/L atorvastatin和5% 20%患者自体血清或人AB血清的 X-vivo-15培养液中，培养3 4d，诱导分化成肾功能不全治疗用的自体干细胞(EPC)。采用上述方法制备的干细胞，用于治疗肾功能不全，正是充分利用了内皮祖细胞 (EPC)所具有的以下特点
内皮祖细胞(EPC)是内皮细胞的前体细胞、多功能干细胞。它能促进内皮细胞层再生 和促进血管再生。当组织受到损伤时，尤其是缺血性损伤时，循环及组织中EPC动员和增值 能力增强，并可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修复血管内皮损伤 区，并参与缺血或损伤组织内新血管生成，从而改善缺血器官的功能；而如果创伤后EPC的 分化、迁徙功能发生严重障碍，则会导致损伤部位微循环严重损害而无法得到修复，甚至发 生器官功能衰竭。EPC是机体创伤修复过程中不可缺少的组成部分。临床移植使用方法移植过程严格无菌操作。ASC经诱导分化3 4d后，获得的EPC用0. 25%胰酶/EDTA消化，生理盐水洗涤2 3 次。选取大于10 7干细胞，用含1%自体血清的生理盐水重悬，混勻，通过静脉输注回输肾功 能不全患者进行治疗。剩余干细胞以1. 2 2X 10 7/支，严格按干细胞低温保存步骤冻存， 共2 3支，用于后面回输患者。每间隔2周左右，进行冻存干细胞复苏后，回输患者。
权利要求
1.一种肾功能不全治疗用的自体干细胞，其特征在于所述的自体干细胞是从患者腹 部或者臀部抽吸的脂肪组织中分离提纯、扩增培养的脂肪干细胞经诱导分化形成的自体内 皮祖细胞。
2.如权利要求1所述的一种肾功能不全治疗用的自体干细胞，其特征在于所述的自 体干细胞的具体制备方法为a、在无菌条件下从患者腹部或者臀部抽吸脂肪组织，用PBS缓冲液反复冲洗3次去除 红细胞和其它细胞碎片后，剪碎，加入2 3倍体积的含0. 075% 0. 1% I型胶原酶的PBS 缓冲液，37°C水浴中充分振荡消化30min以上；b、而后加入等量的含10%自体血清或人AB血清的DMEM培养液中和胶原酶，IOOOrpm离 心lOmin，去除漂浮的脂肪细胞和上清液，获得的细胞沉淀加入140 180mM NH4Cl的PBS 缓冲液重新悬浮，室温静置IOmin裂解红细胞后，IOOOrpm离心IOmin弃去上清液，获得细胞 沉淀；c、获得的细胞沉淀经PBS缓冲液洗涤后，用含10%自体血清或人AB血清、100U/mL青 霉素、100 g/mL链霉素的DMEM培养液重悬，以约104/cm2密度接种至IOOmm培养皿中，在 37°C、5%C02、饱和湿度为100%的培养箱中培养，4 后首次换液；待细胞生长至80%以上融 合时，用0. 25%胰酶/EDTA消化、按1 3的比例传代；d、选取第2 4代的细胞，用0.25%胰酶/EDTA消化后，接种在含1 lOng/mL hrVEGF, 0. 05 0. 2 mol/L atorvastatin和5% 20%患者自体血清或人AB血清的 X-vivo-15培养液中，培养3 4d，诱导分化成肾功能不全治疗用的自体内皮祖细胞。
3.如权利要求2所述的一种肾功能不全治疗用自体干细胞的制备方法，其特征在于 选取第2、代脂肪干细胞进行诱导分化成内皮祖细胞。
全文摘要
本发明提供了一种用于治疗肾功能不全的自体干细胞及其制备方法。从患者脂肪组织中分离纯化、扩增培养脂肪干细胞,经诱导分化成治疗肾功能不全用的自体内皮祖细胞。其来源丰富、取材方便、简便易行、经济实用。制备的干细胞自体回输治疗肾功能不全，治疗的效果明显、安全性好、无免疫排斥、无明显毒副作用和不良反应，病人痛苦小。为肾功能不全患者提供了一种全新的治疗手段，具有深远的积极意义。
文档编号C12N5/071GK102146357SQ20101061872
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者吴国祥, 张绪敏, 许凤华 申请人:上海科医联创生物科技有限公司