专利名称：一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法
技术领域：
本发明属于动物肠道粘膜细胞分离和培养领域，具体涉及一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法。
背景技术：
细胞是动物的结构和功能的基本组成单位，利用培养的细胞作为实验材料在细胞结构、功能损伤作用机理等基础理论研究、新型药物筛选、新型饲料添加剂研究等众多研究领域得到广泛性的使用，与活体动物(鱼类)相比较，具有研究周期短、实验条件容易控制、 可以实现批量化的规模性实验、实验结果重复性好等优点，且使用原代培养细胞较使用细胞系进行实验的技术难度降低、实验成本降低，也更接近于鱼体自身生理条件。鱼类是生活于水域环境的变温动物，与陆生恒温动物在许多方面有显著性的差异。现代基础科学研究和水产药物、水产动物营养产业发展需要建立鱼类细胞实验模型和研究的实验平台，这是推动鱼类基础研究和相关产业技术研究发展的重要关键性领域。鱼类肠道粘膜细胞是研究鱼类消化和吸收生理机制、饲料非营养物质对肠道损伤与修复机制、筛选防治肠道粘膜细胞损伤的药物或饲料添加剂的重要基础性实验模型和实验平台， 具有重要的意义。但是，现有技术中，鱼类肠道粘膜细胞研究领域目前还没有成熟的细胞系，因此只能利用肠道粘膜原代细胞作为细胞材料。利用从健康鱼体肠道分离肠道粘膜细胞并进行原代培养，以原代培养的粘膜细胞作为不同实验研究材料仍然面临下列难题
(1)利用胶原蛋白酶分离肠道粘膜细胞是动物肠道粘膜细胞分离主要的技术，但传统方法主要适合陆生恒温动物如小白鼠、大鼠、家禽等，对于水生的变温动物不完全适用，具体地，首先，现有技术中适用于陆生恒温动物肠道粘膜细胞分离的胶原蛋白酶种类、酶浓度不适用于鱼类肠道粘膜细胞分离；其次，传统的方法是将肠道剪碎后进行胶原蛋白酶的消化处理，但得到的细胞、组织块、死细胞等混杂，是细胞的分离难度很大，同时，破碎的细胞、组织是细胞内溶酶体释放出很多水解酶类，对分离的细胞产生较大的影响。因此，需要研究一种适用于鱼类的肠道粘膜细胞的消化分离方法，要求得到纯净的、生理功能性完整的粘膜细胞、细胞团；
⑵现有技术中，通常采用鼠尾胶原作为细胞培养和生长的细胞支持载体，但是效果不理想，因此需要筛选适用于鱼类细胞培养、生长的细胞支持载体。我们利用鱼皮胶原蛋白作为鱼类肠道粘膜细胞培养的支持载体，细胞生长效果、细胞功能性显著优于利用鼠尾胶原的效果；
⑶需要调整鱼类肠道粘膜细胞接种的细胞、细胞团浓度，含有一定量的粘膜细胞团更有利于鱼类肠道粘膜细胞的生长，尤其是新生培养细胞的凝聚效果更好；
⑷现有技术中，适用于陆生恒温动物的细胞原代培养的条件不适用于鱼类，因为，例如鱼类是长期生活在水域环境中的变温水生动物，其肠道粘膜细胞的培养条件如温度等与陆生恒温动物有很大的差异；鱼类是生活在水域环境中，鱼类细胞生长需要的参透压与陆生动物有差异，鱼类细胞培养液要做适当的调整。
发明内容
本发明目的是提供一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤，其中，所述取材步骤包括消化和分离、步骤，具体为
1、消化按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液
方法一使用含抗生素的D-HankS液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的一端，向肠道内灌注体积为509Γ70%肠道内容积的混合消化液，结扎剩余的肠道一端；然后在25 30°C水浴中消化20 40min，再向肠道加入含质量分数5 6% 新生牛血清的DMEM，用镊子提起肠道的两端，反复振荡5 8次，终止消化；放出含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；
方法二 将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内，使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的两端，将肠道浸没在混合消化液中，在25 30°C水浴中消化20 40min，再向混合消化液中加入含质量分数5 6%新生牛血清的DMEM，反复振荡5 8次，终止消化；取出肠道，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；
2、分离取步骤1所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，在300r/min 500r/min 的转速下离心3 5min，得到粘膜细胞和细胞团的混合物，以所得粘膜细胞和细胞团的混合物作为原代培养的接种材料细胞；
所述培养步骤中，以鱼皮胶原蛋白作为培养支持载体，以改良的DMEM液作为培养基， 以改良的D-Hanks液作为平衡盐溶液，按照2. 3 X IO4个/cm2 4. 7 X IO4个/cm2的粘膜细胞和细胞团浓度，将粘膜细胞和细胞团的混合物加入到培养基中，在培养温度26 28°C下， PH7. 2-7. 4条件下进行原代培养24小时以上即可贴壁生长。上述技术方案中，消化步骤中，所述含抗生素的D-Hanks的配置方法为使用前临时在D-Hanks液中加入抗生素青霉素、庆大霉素、链霉素，并且青霉素浓度为20万U/L、庆大霉素浓度为20万U/L、链霉素浓度为200mg/L ；所述混合消化液含胶原酶I 0. 15 0. 3mg/ ml、胶原酶IV 0. 15 0. 3mg/ml，混合消化液的使用量为体重IOOg/尾左右的鱼体大约需要3 8ml，DMEM的使用量为体重IOOg/尾左右的鱼体大约需要3 8ml。上述技术方案中，分离步骤所得粘膜细胞和细胞团的混合物中，细胞和细胞团的数量比为2.5 5比1。上述技术方案中，所述培养支持载体鱼皮胶原蛋的制备方法、鱼皮胶原蛋白包被培养板的方法可参照申请号为201010288301. 0的中国发明专利申请，具体地，一种鱼皮胶原蛋白的制备方法，包括原料处理、提取、盐析、纯化透析干燥步骤，其中，所述原料处理、提取步骤具体包括⑴原料处理清除鱼鳞，将鱼皮剪成碎粒，按照固液比为1 15 25，将氢氧化钠(NaOH)水溶液加入鱼皮碎粒，广5°C下浸泡3 5h，用20目筛卷网过滤得鱼皮滤渣，风干；以鱼皮滤渣的体积份为1份，用3飞份的无水乙醚于35、0°C回流3、h，除去鱼皮的脂肪，然后风干，得到除脂后的鱼皮渣；其中，所述鱼皮碎粒的尺寸约为2mmX2mmX2mm;所述氢氧化钠水溶液的浓度为0. 04M 0. 05M ；⑵提取按照固液比为1 50 70，将0. 5 0. 6M乙酸加入除脂后的鱼皮渣中，浸提6(T80h，40目筛卷网过滤得到含鱼皮胶原蛋白的滤液；重复进行一次；所述原料选自草鱼、斑点叉尾鮰或罗非鱼的鱼皮，鱼皮可以是干燥的也可以是新鲜的；所述盐析步骤为经终浓度为2. 5M氯化钠(NaCl)盐析得到胶原蛋白沉淀；所述纯化透析干燥步骤为将步骤⑶所得胶原蛋白沉淀溶解于0. 5M乙酸，然后先以0. 5M乙酸为透析外液进行透析3飞次、再以双蒸水作为透析外液进行透析，直至透析外液检测不到氯离子，以保留分子量IOOkDa以上的胶原蛋白；收集透析后的胶原蛋白液体，采用冷冻干燥方法进行干燥，得到鱼皮胶原蛋白。鱼皮胶原蛋白包被培养板的方法具体为在对或96孔培养板中加入鱼皮胶原蛋白1 3ml到每孔中，静置5min，吸出多余的胶原；把培养板放入一干燥器中，另用一培养皿盛1 2ml氨水，盖好干燥器；20min后取出培养板，放入4°C冰箱中存放；使用前用无菌D-Hanks清洗液清洗培养板3 5次，以IOmin内保持血红色作为清晰完毕的标志。上述技术方案中，培养步骤中，所述改良的DMEM液中包含2 μ g/ml重组人表皮生长因子，2. 5mg/ml胰岛素，8% (质量分数)新生牛血清，0. 85 1. 15mg/ml的谷氨酰胺，20 万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素；使用时需要用水稀释1. 4 1. 5倍体积；所述改良的D-Hanks液的配置方法为按照常规方法配制D-Hanks液，并通过改变NaCl 的浓度，调节渗透压到225mmol/kg，成为改良的D-Hanks液，4°C下贮存，使用前用0. 22 μ m 过滤除菌；具体配置方法可以参考文献吴康等，鲤血管内皮细胞的分离培养及初步鉴定， 2001。上述技术方案中，所述鱼优选为体重90 IlOg/尾的健康鱼，在取出肠道前该鱼已被处死。由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点
1、由于本发明创造性的优化了适合鱼类肠道粘膜细胞的消化分离方法(消化方式、消化液、消化条件)和原代培养方式(接种材料为细胞和细胞团的混合物、改良的D-Hanks液、 改良的DMEM液)，结合传统的动物细胞分离、原代培养技术，建立鱼类肠道粘膜细胞分离、原代培养的系统化技术，采用本发明所得鱼类肠道粘膜细胞生长良好，结构和功能性标志性指标体系完善，可以作为基础研究、药物筛选、饲料添加剂筛选等的试验模型和试验平台。2、本发明中鱼类肠道粘膜细胞消化分离效果好与传统的剪碎肠道分离肠道粘膜细胞的方法向比较，本发明选用组合的胶原蛋白酶对肠囊、翻转肠囊进行粘膜细胞的消化分离，粘膜细胞可以成多个细胞团、或单个细胞从粘膜上分离出来，有效控制肠道其他组织中的杂细胞被分离、混杂在粘膜细胞中，得到的粘膜细胞纯度很好，可以得到较多的粘膜细胞；同时，可以得到一定比例的细胞团，以单个细胞一起作为原代培养的细胞种子，有利于肠道粘膜细胞的培养和生长。3、本发明中以细胞和细胞团混合作为原代培养的材料效果好使用细胞和细胞团一起作为原代培养的接种材料细胞，更有利于细胞的离体培养生长，也有效减少了在消化分离时过度消化对细胞的损伤，从实际效果分析，采用本发明，将肠囊、翻转肠囊消化液在 300r/min 500r/min的转速下离心3 5min，得到的细胞细胞团的比例为1 :4左右，按照2. 3 X IO4个/cm2 4. 7 X IO4个/cm2的细胞和细胞团浓度加入到培养液中，粘膜细胞修复时间缩短，很快就进入生长时期，且细胞贴壁生长效果好，细胞主要功能性指标达到要求。4、本发明对D-Hanks液、鱼类细胞DMEM培养液进行改良在参透压、酸碱度、有效成分组成与剂量浓度等方面，研究得到了适合鱼类肠道粘膜原代培养的D-Hanks液和DMEM 培养液，可以对鱼类肠道粘膜细胞进行批量处理、批量培养，且不同批次试验的重复性非常好。
5、利用本发明所述鱼类肠道粘膜细胞可以成功建立基础研究、药物筛选、饲料添加剂筛选的细胞试验模型、试验平台的系统化技术，可以使这类试验模型和试验平台的建设实现规范化、标准化。说明书附图
图la、lb为实施例一中经过肠囊、翻转肠囊消化得到的细胞、细胞团进行显微光镜分析结果图2原代培养48h后生长良好的草鱼肠道粘膜细胞形态图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述 实施例一
一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法，包括以下步骤
⑴选用经过强化肠道粘膜细胞生长的饲料培育2 3周后的试验材料鱼肠道为材料， 所述材料鱼的体重在90 IlOg/尾，平均体重为IOOg/尾；实验鱼经过酒精消毒后，在无菌室用剪刀捣碎鱼体脑部，快速剖开鱼腹，取出肠道，清除肠道外脂肪；
⑵将肠道制成肠囊或翻转肠囊然后进行消化，有效分离肠道粘膜细胞；然后在300r/ min 500r/min的转速下离心3 5min得到肠道粘膜细胞团粘膜细胞比例达到1 :2. 5 5的混合细胞悬浮液，能满足后续试验的接种浓度要求。所述将肠道制成肠囊然后进行消化的过程为用注射器吸取D-Hanks液(临时加入抗生素，浓度为20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素)灌注、冲洗肠道数次，冲出肠道中黏液与杂物。用细线结扎肠道一端。用注射器加入含胶原酶I 0.15 0. 3mg/ml、胶原酶IV 0. 15 0. 3mg/ml的混合消化液60%充满肠道(对于体重IOOg尾左右的鱼体大约需要3 8ml)。结扎剩余的肠道一端。在28°C水浴消化20 40min。用注射器加入含5%新生牛血清的DMEM 3 8ml，用椰子提起肠道的两端，反复振荡5 8次，终止消化。剪开肠囊一端，放出含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液供下一步试验。所述将肠道制成翻转肠囊然后进行消化的过程为右手拿住细竹签或细铁丝接触到肠道一端的外壁，左手食指轻扶肠道外壁轻轻向细竹签或细铁丝方向推进，使肠道套住细竹签或细铁丝将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内。用吸管吸取D-Hanks液(临时加入抗生素，浓度为20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素)反复冲洗肠道粘膜表面。用细线系结扎肠道的两端，使消化液不能进入空腔内。将翻转肠囊放入加入含胶原酶I 0. 15 0. 3mg/ml、胶原酶IV 0. 15 0. 3mg/ml的混合消化液中(对于体重IOOg尾左右的鱼体大约需要3 8ml)。在28°C水浴消化20 40min。加入含5 6%新生牛血清的 DMEM 3 8ml，反复振荡5 8次，终止消化。得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液供下一步试验。
对经过肠囊、翻转肠囊消化得到的细胞、细胞团进行显微光镜分析，得图la、lb，可知经过肠囊、翻转肠囊消化得到的细胞、细胞团较为纯净，杂质很少，细胞的功能装填也非常好。活细胞(团)比例越多、杂质越少、细胞团II与细胞团III的总浓度越大，则相应处理条件为最优。不同消化时间所对应的消化结果如表1所示，经过不同消化时间的试验确定其最佳消化时间为20 40min。表1 不同消化时间细胞、细胞团的比例％
权利要求
1.一种鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤，所述取材步骤包括消化和分离、步骤，其特征在于，1)消化步骤具体为按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液方法一使用含抗生素的D-HankS液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的一端，向肠道内灌注体积为50% 70%肠道内容积的混合消化液，结扎剩余的肠道一端；然后在25 30°C水浴中消化20 40min，再向肠道加入含质量分数 5 6%新生牛血清的DMEM，用镊子提起肠道的两端，反复振荡5 8次，终止消化；放出含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；方法二 将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内，使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的两端，将肠道浸没在混合消化液中，在25 30°C水浴中消化20 40min，再向混合消化液中加入含质量分数5 6% 新生牛血清的DMEM，反复振荡5 8次，终止消化；取出肠道，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；2)分离步骤具体为取步骤1)所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，在300r/ min 500r/min的转速下离心3 5min，得到粘膜细胞和细胞团的混合物，以所得粘膜细胞和细胞团的混合物作为原代培养的接种材料细胞；所述培养步骤中，以鱼皮胶原蛋白作为培养支持载体，以改良的DMEM液作为培养基， 以改良的D-Hanks液作为平衡盐溶液，按照2. 3 X IO4个/cm2 4. 7 X IO4个/cm2的粘膜细胞和细胞团浓度，将粘膜细胞和细胞团的混合物加入到培养基中，在26 28°C培养的温度下，pH7. 2-7. 4条件下进行原代培养，24小时以上即可贴壁生长。
2.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，消化步骤中，所述含抗生素的D-Hanks的配置方法为使用前临时在D-Hanks液中加入抗生素青霉素、庆大霉素、链霉素，并且青霉素浓度为20万U/L、庆大霉素浓度为20万U/L、链霉素浓度为 200mg/L。
3.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，所述混合消化液含胶原酶I 0. 15 0. 3mg/ml、胶原酶IV 0. 15 0. 3mg/ml，消化步骤中，混合消化液的使用量为体重IOOg/尾左右的鱼体需要3 8ml混合消化液。
4.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，消化步骤中，DMEM的使用量为体重IOOg/尾左右的鱼体需要3 8ml的DMEM。
5.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，分离步骤所得粘膜细胞和细胞团的混合物中，细胞和细胞团的数量比为2. 5 5比1。
6.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，培养步骤中，所述改良的DMEM液中包含2μ g/ml重组人表皮生长因子，2. 5mg/ml胰岛素，质量分数8%的新生牛血清，0. 85 1. 15mg/ml的谷氨酰胺，20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素；使用时用水稀释1. 4 1. 5倍体积。
7.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，培养步骤中，所述改良的D-Hanks液的配置方法为按照常规方法配制D-Hanks液，并通过改变NaCl的浓度，调节渗透压到225mmol/kg，成为改良的D-Hanks液，4°C下贮存，使用前用-0. 22 μ m过滤除菌。
8.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，所述鱼的体重为90 IlOg/尾。
全文摘要
本发明属于动物肠道粘膜细胞分离和培养领域，具体涉及一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液将所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，离心得到粘膜细胞和细胞团的混合物，作为原代培养的接种材料细胞；所述培养步骤中，以鱼皮胶原蛋白作为培养支持载体，以改良的DMEM液作为培养基，以改良的D-Hanks液作为平衡盐溶液，在培养温度26～28℃下，pH7.2-7.4条件下进行原代培养24小时以上即可贴壁生长。采用本发明所得鱼类肠道粘膜细胞生长良好，结构和功能性标志性指标体系完善。
文档编号C12N5/071GK102168063SQ20101062010
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者叶元土, 周志刚, 姚仕彬, 张宝彤, 秦杰, 蔡春芳 申请人:苏州大学