专利名称：一种重组h5n1禽流感病毒细胞苗及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物传染病技术领域。具体涉及一种重组H5m禽流感病毒细胞苗及应用。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza，Al)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。 自1878年意大利首先发现至今，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行。高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI)呈世界性分布，危害极大，其爆发常是毁灭性的，国际兽疫局将其划定为A类传染病，并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。尤其是香港1997年和东南亚2003-2004年出现的H5W亚型禽流感病毒直接感染并致死人的事件，引起了世人的震惊和关注。我国自1996年首次报道分离到H5W亚型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈一种上升趋势；2005年至2006年5月间，我国已经出现了 H5W亚型禽流感病毒感染人的病例18例，其中12人死亡。目前，世界上已经有 50多个国家和地区出现了 HPAI，HPAI已经成为制约全球经济发展和威胁人类和动物健康的重大传染病。全群扑杀和生物安全防护是及时扑灭和控制高致病性禽流感的主要措施。但是， 对于养殖管理水平参差不齐的东南亚各国，疫苗免疫接种可能是防止禽流感疫情大范围流行的最经济的方法。但是采用传统方法构建H5亚型禽流感疫苗株的操作比较困难，流感病毒反向遗传学操作技术为禽流感疫苗的研制提供了新的技术手段。目前我国禽流感H5W 亚型商品疫苗主要是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的Re-4，Re-5株，这种疫苗是利用人流感病毒A/PR/8/34 HlNl为背景制备的人流感病毒和H5W禽流感病毒的重组体， 利用鸡胚增殖。因此，其对人存在着安全问题；同时，如果禽流感爆发流行，鸡胚短缺，这种疫苗的生产将面临资源短缺问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种安全性更好的重组H5m禽流感病毒细胞苗。实现本发明的技术方案如下所示一种具有免疫原性的重组H5W禽流感病毒细胞苗，它包含有来自禽流感病毒的8 个相关基因片段，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO :1-8所示，将所述的8个基因片段分别克隆至转录/表达载体PHW2000上，构建出8个质粒，将所述的8个质粒共转染细胞，得到重组H5W禽流感病毒株rC4/Wl，所述的重组H5W禽流感病毒株rC4/Wl保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期2010年11月9日；其保藏编号为CCTCC NO :V201(^9。具体地本发明的技术方案是通过合成H5m亚型禽流感病毒A/chicken/ Hubei/327/2004的ΔΗΑ基因(切割位点改为低致病性禽流感病毒HA基因的切割位点)和NA基因到转录/表达载体PHW2000上，构建禽流感病毒H9N2亚型A/duck/Hubei/
3ffl/2004 (Xu, X.等，2008)的 6 个内部基因的载体P冊-PB2，P冊-PB1，P冊-PA，PHW-NP, PHW-M, PHW-NS,利用反向遗传学技术拯救出重组H5W禽流感病毒，将重组病毒在MDCK细胞上传代至稳定并将其灭活后作为油乳灭活苗检测其免疫原性。与现有技术相比，本发明的有益效果是1、本发明利用禽流感病毒H9N2作为背景，换入禽流感病毒H5W亚型的HA和NA 基因，这样的重组病毒得到所有基因片段都来自禽流感病毒，因而具有更好的安全性。2、重组H5m禽流感病毒在MDCK细胞上传代适应，获得了在MDCK细胞上高增殖滴度的毒株，这样更有利于克服禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题。 更详细的技术方案参见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO :1-8是本发明克隆的8个禽流感病毒的基因片段的核苷酸序列，其中SEQ ID NO :1-6是禽流感病毒H9N2的基因序列，SEQ ID NO :7_8是禽流感病毒H5W 的基因序列。序列表SEQ ID NO 9是本发明中质粒PHW2000的序列。图1 是H9N2病毒6个基因PCR扩增片段琼脂糖凝胶电泳图。图2 是本发明使用的PHW2000载体质粒图谱。图3 是禽流感H9N2病毒PB2基因克隆到PHW2000的示意图。图4 是本发明所采用的拯救策略。图5 是拯救病毒的血凝结果。图6 是细胞苗免疫鸡的抗体变化规律曲线图。
具体实施例方式实施例1 禽流感病毒相关基因的克隆
1、禽流感病毒RNA的提取参照OMEGA Bioteck RNA-SOLV Reagent RNA Isolation Solvent 的试剂盒的说明书提取禽流感病毒RNA。具体方法如下取H9N2亚型禽流感病毒株A/duck/Hubei/ ffl/2004 (Xu, X.等，2008)的新鲜尿囊液300 μ L，加入到装有1000 μ L RNA-Solv的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的1. 5mL EP管中，上下颠倒混勻，室温放置8min，加入200 μ L氯仿， 冰浴lOmin，4°C 12000r/min离心15min，取上清500-600 μ L移入另一 EP管，加等体积异丙醇，混勻，室温下放置lOmin，在室温12000r/min离心lOmin，弃上清，加ImL 80%浓度的乙醇，涡旋混勻，室温7000r/min离心5min，吸弃乙醇，将EP管置于超净工作台上风干，最后将 RNA沉淀溶于10-20 μ L用DEPC处理的无RNA酶的双蒸水中，置_80°C保存备用。2、引物设计合成参考E. Hoffman (Ε. Hoffman, 2000)等设计的用来扩增所有A型流感病毒全长基因的通用引物序列，扩增8个全长基因片段的特异性引物，引物合成由上海生物工程有限公司完成，所用的引物对的核苷酸序列如下所示反转录引物Unil2 primer 5' AGCAAAAGCAGG3‘扩增PB2基因的引物对
Pl 5’ TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTC 3’P2 5， ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT 3’扩增PB1基因的引物对P3 5' TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGCA 3'P4 5’ ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT 3’扩增PA基因的引物对P5 5’ TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC 3’P6 5， ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT 3’扩增NP基因的引物对P7 5’ TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA 3’P8 5， ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’扩增M基因的引物对P9 5’ TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG 3’PlO 5’ ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’扩增NS基因的引物对Pll 5’ TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG 3’P12 5’ ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’3、病毒RNA的反转录在20 μ 1反转录体系中进行，依次加入以下组分AMV Reverse Transcriptase XL (购自宝生物工程(大连)有限公司)1. 0 μ 1，RNase free H20 1· 0 μ 1，RNase inhibitor (宝生物工程(大连)有限公司)0· 5 μ 1,5XAMV Buffer 4· 0μ 1，dNTP 2. 0μ I(IOmmol)，Uni 12 primer2 μ 1 (IOpmol)，溶于焦碳酸二乙酯水中的禽流感病毒RNA模板10. 5 μ 1，混勻后置PCR仪上42V 60min进行反转录反应，反应产物直接用于PCR或4°C 保存备用。4、禽流感病毒cDNA的PCR扩增在PCR反应管中加入反转录产物2μ l，primerstar Taq DNA聚合酶(宝生物工程 (大连)有限公司)1 μ l,primerstar PCR Buffer 5 μ l，dNTPS Mixture (各 IOmM) 2 μ 1，各基因的上下游引物各2. 5 μ 1，最后用RNase freed H20将终体积调至50 μ 1，混勻后于PCR 仪上进行扩增。PCR扩增程序为预变性94°C 5min，变性94°C 20sec，退火58°C 30sec，延伸 72°C 5min，运行30个循环，最后于72°C后延伸lOmin。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物各取5μ 1，在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，剩余的回收。5、PCR产物的回收电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收DNA。具体方法如下切下目的DNA回收片段，放入一无菌的1.5mL的EP管中，加入500-750 μ L Binding Buffer，于50_60°C水浴5min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体转至一回收柱，于室温静置 2min，8000r/min，离心 lmin，倒掉收集管中的废液，用 500μ L Washing solution 8000r/ min，离心lmin，洗两次；最后12000r/min离心15s，将回收柱转至一干净的1. 5mL EP管中， 加10-20 μ L ddH20洗脱，于室温放置5min，12000r/min离心lmin，收集管中即为回收的DNA片段。6、连接反应回收的PCR产物直接连接到pMDIS-T(购自宝生物工程(大连)有限公司)，连接体系和反应如表1 表IPCR产物连接体系
权利要求
1.一种具有免疫原性的重组H5m禽流感病毒细胞苗，其特征在于，它包含重组H5m禽流感病毒rC4/Wl株，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :V201029, 在所述的重组H5m禽流感病毒rC4/Wl株的基因组中含有如序列表SEQ ID N0:l_8所示的禽流感病毒的8个基因片段。
2.一种具有免疫原性的重组H5W禽流感病毒rC4/Wl株，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :V201029o
3.权利要求2所述的重组H5W禽流感病毒rC4/Wl株在制备H5W禽流感病毒细胞苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及动物传染病技术领域。具体涉及一种重组H5N1禽流感病毒细胞苗及应用。重组H5N1禽流感病毒细胞苗包含重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株，该rC4/W1株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOV201029，该重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株的基因组中含有如SEQ ID NO1-8所示的禽流感病毒的8个相关基因的片段。利用反向遗传学方法拯救出重组H5N1禽流感病毒，将该重组病毒在MDCK细胞上传代至稳定并将其灭活后作为油乳灭活苗。本发明以H9N2禽流感病毒为背景，换入H5N1亚型的禽流感病毒HA和NA基因，重组病毒所有基因片段均来自禽流感病毒，具有更好的安全性。重组H5N1禽流感病毒能在MDCK细胞上传代培养，获得高增殖滴度的毒株，克服了禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题。
文档编号C12R1/93GK102526718SQ20101062015
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者周红波, 徐晓娟, 涂加钢, 金梅林, 陈焕春 申请人:华中农业大学, 武汉科前动物生物制品有限责任公司