专利名称：控制水稻粒重的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种控制水稻粒重的蛋白及其编码基因与它们的应用。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，世界上接近50%的人口以水稻为食，不断提高水稻产量是人类不断追求的目标。研究表明影响水稻产量的构成要素主要有三个分蘖数、穗粒数和粒重。粒重作为影响水稻产量的重要因素之一渐渐受到人们的广泛重视。水稻在自然演化及人工驯化的过程中，不断满足了人类粮食需求的同时，等位基因的数目也在不断减少，近年来，随着水稻分子设计育种技术的完善，迫切需要根据目前的水稻资源的情况，有效地从中选育出有增加粒重潜力的品种加以遗传改良，或对其控制粒重的基因进行分离和克隆， 具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。我国水稻遗传资源丰富，从这些丰富的资源中发掘、定位控制水稻粒重的新基因， 不仅为培育高产水稻新品种提供理论支持，而且对加强我国水稻基因资源的保护，将资源优势变成经济优势具有重要意义。
发明创造内容本发明的目的是提供一种控制水稻粒重的蛋白及其编码基因与它们的应用。本发明提供的控制水稻粒重的蛋白，名称为GS6，来源于稻属普通栽培稻 (0. sativa.)，是下述1)或2)所述的蛋白质1)序列表中的SEQ ID No . 2的氨基酸残基序列；幻将序列表中的SEQ ID N2 . 2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。序列表中序列2氨基酸残基序列是由617个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明提供的控制水稻粒重的蛋白的编码基因(GS6)，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列；2)自序列表中SEQ ID N2 :1的5'端第788位到第沈41位核苷酸；3)编码序列表中SEQ ID Na 2蛋白质序列的多核苷酸；4)在高严谨条件下可与1)或2)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。5)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。所述高严谨条件为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。序列表中序列SEQ ID No 1的DNA序列由3102个核苷酸组成，该基因的读码框为自5’端第788位到第沈41位核苷酸；其它序列为两端非翻译区。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。扩增GS6 中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。上述基因在培育粒重提高的植物中的应用也属于本发明的保护范围。所述植物为水稻，具体为含有上述基因的水稻。所述应用，是将水稻中上述基因灭活，筛选获得颗粒重提高的水稻。所述将水稻中上述基因灭活，是用突变、缺失、置换上述基因或者利用反义RNA干扰上述基因的表达。使用GS6构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、 组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、泛生素基因 WDiquitin启动子(ρ^ )等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本发明编码提高水稻籽粒宽度的基因GS6的植物表达载体可通过使用Ti 质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化水稻细胞或组织，并将转化的水稻细胞或组织培育成植株。本发明提供了的控制水稻粒重的基因GS6，当GS6基因在水稻中的表达降低后，转基因植株T3千粒重可比对照提高约5%，且粒宽的增加是粒重的增加的主要原因。该基因对于水稻籽粒宽度分子机制的研究，水稻高产新品种的选育具有重要的理论及实际意义， 并为改良作物的千粒重提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。我们构建RNAi载体利用基因枪法转化粳稻中花17号，当GS6基因在水稻中的表达降低后，转基因植株1千粒重平均可比对照提高约5%，显著高于未转基因和转基因的对照组。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
图 1 为 RNAi 载体(pGS6_RNAi)示意图。图2为转pGS6-RNAi植株T3代的千粒重的鉴定结果。CK 为正常生长条件的粳稻中花17号和转基因植株；LineU Line 2、Line 3、Line 4、Line 5和Line6为6个阳性转基因植株，其粒宽较对照明显变大，千粒重平均增加超过5% ；图3为转基因系Line 5和Line 6抽穗前12天基因GS6的表达下降。
具体实施方式
实施例1、控制水稻粒重的新基因GS6的获得及其功能验证一、控制水稻粒重的新基因GS6的获得本发明的发明人通过对诱变籼稻93-11获得的一株突变体研究发现一个控制水稻粒重的新基因GS6，在籼稻93-11突变体中，基因GS6由于点突变造成GS6翻译提前终止和功能的丧失，从而引起粒重的显著增加，且粒宽的增加是粒重的增加的主要原因。设计引物扩增该基因，引物序列为CDSF 5 ‘ CATTCCACCAAAGCCTTAG 3' ； CDSR 5' ATGCTGCCCCTGCTAATC 3'。以籼稻93-11 (购自国家种质资源库)基因组DNA为模板，以上述引物为引物，进行PCR扩增。结果扩增得到约3102bp的片段，即为本发明的控制水稻粒重的基因，将其命名为 GS6。测序表明该片段具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，序列表中序列1的DNA序列由3102个碱基组成，该基因编码具有序列表中SEQ ID N2 :2氨基酸残基序列的蛋白质，即控制水稻粒重的蛋白GS6。二、控制水稻粒重的新基因GS6的功能验证1、不同等位基因千粒重的鉴定为进一步验证基因GS6与千粒重的相关性，我们分别提取76个水稻品种基因组 DNA,在引物CDSF和CDSR引导下进行PCR扩增，测序，并选取其中的43个水稻品种进行了千粒重的鉴定。关联分析表明基因GS6主要存在3种不同的等位基因，如表1所示表1. GS6的3种不同的等位基因变异位点
权利要求
1.一种蛋白，是下述1)或幻所述的蛋白质1)由序列表中的SEQID N2. 2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQID N2 . 2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述编码基因，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID Na 1的DNA序列；2)自序列表中SEQID N2 :1的5'端第788位到第沈41位核苷酸；3)编码序列表中SEQID No 2蛋白质序列的多核苷酸；4)在高严谨条件下可与1)或2)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；5)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、重组工程菌或转基因细胞系。
5.权利要求2或3所述基因在培育颗粒重提高的植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物为水稻。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用，是将水稻中权利要求2或3所述基因灭活，筛选获得颗粒重提高的水稻。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述将水稻中权利要求2或3所述基因灭活，是用突变、缺失、置换权利要求2或3所述基因或者利用反义RNA干扰权利要求2或 3所述基因的表达。
全文摘要
本发明公开了一种控制水稻粒重的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是下述1)或2)所述的蛋白质1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。本发明的基因可用于培育千粒重增加的水稻新品种，具有重要意义。
文档编号C12N5/10GK102532290SQ201010621898
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者付永彩, 刘凤霞, 孙传清, 孙连军, 朱作峰, 李晓娇, 谢道昕, 谭禄宾 申请人:中国农业大学