一种用于遗传转化藻类的新型启动子的制作方法

专利名称：一种用于遗传转化藻类的新型启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于遗传转化藻类的新型的启动子、含有该启动子的载体、以及使用该载体的藻类的遗传转化方法。
背景技术：
利用作为恒久的且稳定的能源的太阳光在能源对策考虑上是非常重要的。植物类的光合成是能够最有效地将太阳光能量转化为化学能量的良好的系统，不但吸收同化环境中的二氧化碳或过剩的营养盐，还释放出氧气。因此，利用植物的技术的开发作为能够解决能源问题的技术，备受期待。在植物类中，藻类由于生存在大量存在的海水和淡水中，因此，藻类的量也是相当大的，另外，藻类具有显著光合成能力。并且，在藻类中还有产生不饱和脂肪酸或抗肿瘤化合物等有用化合物的种类。另外，硅藻类中有产生有用的无机物的藻，因此，利用硅藻类的被称为生物矿化作用的技术备受关注。因此，藻类可以称得上是作为有用资源的重要的生物。通常，在产业上利用生物的情况下，可使用导入有用的基因的遗传转化技术。为了阐明基因的功能，该遗传转化技术还可用于敲除特定基因并抑制其功能的用途。到目前为止，以硅藻和绿藻为中心进行着藻类的遗传转化。但是，相关的方法是将内在性的启动子分离，使基因与其结合并导入藻类中。其中，在内在性的启动子的分离上花费大量的精力和实践，因此，并非有效的方法。另外，还存在藻类、尤其是海产藻类的遗传转化效率本身极其低的问题。另外，在藻类以外的植物或动物的遗传转化中，广泛应用的并非内在性的启动子， 而是来自病毒的启动子。例如，从十字花科植物感染的花椰菜花叶病毒(CaMV)分离的 CaMV35S启动子不仅限于十字花科植物，还可以用于广泛植物的遗传转化。另外，动物细胞的遗传转化广泛利用从细胞巨化病毒(CMV)分离的CMV启动子、从猿猴空泡病毒40(SV40) 分离的SV40启动子。与此相对，在藻类的遗传转化中，基本上还没有使用外来性的病毒启动子的例子。例如，在非专利文献1中，记载了使用CaMV35S启动子进行硅藻Cycrotela cryptica遗传转化的实验例，但是没有得到遗传转化体。另一方面，在非专利文献2中，记载了 使用CMV启动子、CaMV35S启动子以及劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子向硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)导入⑶S基因后， 所有的情况下，GUS ( β -葡萄糖苷酸酶)均得到表达。另外，在非专利文献3中，记载了使用CaMV35S启动子膝沟藻(渦鞭毛藻) Amphidinium和Symbiodinium中导入⑶S基因后，⑶S均得到表达。但是，根据其它文献 (非专利文献4)，无论多么拼命努力，其它的组均没有出现膝沟藻的遗传转化成功的报告。在先技术文献非专利文献
非专利文献1 =Dunahay, T. G.等，Journal of Phycology (藻类学杂志)，vol. 31， pp.1004-1012(1995)非专利文献2 =Sakaue, K 等，Physiologia plantarum( 7 4 夕才口夕了 · 7°，> 夕，A )vol. 133，pp. 59-67(2008)非专利文献3 =Lohuis, M. R.等，The Plant Journal (植物杂志)，vol. 13， pp.427-435(1998)非专利文献4 :Walker，Τ. L.等，Journal of Phycology (藻类学杂志)，vol. 41， pp.1077-1093(2005)

发明内容
如上所述，虽然数量极少，但是存在使用来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子等的病毒启动子来遗传转化藻类的报告例。但是，也有得不到遗传转化体或者无再现性的报告。另外，根据本发明的发明人的见解，广泛应用于其它的植物类的遗传转化的CaMV35S启动子对藻类的适用范围极其窄。 从藻类的存在量极大，另外，存在藏有各种有用性的种类出发，作为用于遗传转化的启动子，期望能够适用于广泛种类的藻类的启动子。进一步，从通常藻类、尤其是海产藻类的遗传转化效率非常低考虑，亟待高效的遗传转化技术的开发。因此，本发明所要解决的课题是提供能够适用于广泛种类的藻类、且高效的遗传转化技术。本发明的发明人为了解决上述课题，进行了深入的研究。其结果发现位于被认为是编码柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)DNA病毒(CdebBNAV)的复制蛋白质的基因的上游的启动子，能够有效地遗传转化超出目的多种藻类，从而完成了本发明。本发明涉及的新型启动子，其特征在于具有下述(1)-03)中任意一种碱基序列。(1)构成非编码区域的多核苷酸，所述非编码区域位于编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游；(2)缺失、置换或添加了上述多聚核苷酸(1)的一个或多个核苷酸的多聚核苷酸， 并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸；(3)在严格的条件下与上述多聚核苷酸(1)杂交，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。本发明涉及的载体的特征在于，该载体含有上述新型的启动子，以及编码任意蛋白质的基因。另外，本发明涉及的藻类的遗传转化方法，其特征在于，该遗传转化方法包括制备上述载体的工序，以及将上述载体导入藻类细胞的工序。


图1为表示含有本发明涉及的启动子的质粒载体的结构的一例子的图；图2为表示含有本发明涉及的启动子的质粒载体的结构的一例子的图；图3为表示确认通过本发明的方法遗传转化的藻类细胞等中所包含的导入基因的有无的实验的结果的电泳照片；
图4为表示确认通过本发明的方法遗传转化的藻类细胞等中所包含的导入基因的有无的实验的结果的电泳照片；图5是表示用于确定本发明的启动子的核心元件的实验结果的图；由该结果可知在编码与CdebDNA病毒的复制有关的蛋白质的基因的上游区域的-72到-33之间的序列中含有核心元件；图6为表示含有本发明的启动子的质粒载体的结构的一个例子的图；图7为表示海产藻类筒柱藻(C. fusiformis)的遗传转化实验的结果的照片；(1) 表示使用了本发明的启动子的情况的结果，(2)表示未使用本发明的启动子的情况的结果。
具体实施例方式本发明涉及的第一启动子具有(1)构成位于编码与CdebDNA病毒的复制有关的蛋白质的基因的上游的非编码区域的多聚核苷酸。CdebDNA病毒是感染硅藻柔弱角毛藻的病毒。迄今为止，对藻类、尤其是海产藻类显示感染性的病毒的报告例很少，近年来，本发明的发明人成功地从赤潮异弯藻(，74 K )、膝沟藻、硅藻等的藻类中分离了各种病毒。本发明涉及的CdebDNA病毒便是本发明的发明人分离的海产藻类感染性病毒之一。编码与复制相关的蛋白质的基因，只要是与CdebDNA病毒的复制相关的基因并且积极地表达的基因，就没有特别的限定。在本发明中，编码区域是指经过mRNA翻译成蛋白质的部分，非编码区域是指编码区域以外的部分。即，非编码区域是指位于ATG等的起始密码子的上游的部分，除了未被 mRNA转录的部分，还包括被mRNA转录但未翻译成蛋白质的部分。通常，启动子具有转录的关键的核心元件和促进或抑制转录的调控元件，在导入基因时，特别重要的是利用核心元件。作为核心元件已知的有TATA框、启动子元件(Inr)、 下游(夕‘々> ^卜U —卜)元件等，作为调控元件已知的有CAAT框、GATA框等。本发明的发明人调查了编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游区域的碱基序列，发现了作为CAAT框I的5，-CAAT-3，、作为GATA框的5，-WGATAR-3，(式中，W表示A或T，R 表示A或G)、以及作为启动子元件(Inr)的5’ _YYA+1N(A/T)YY_3’(式中，Y表示C或Τ)， 但是没有发现常见于真核生物等的启动子的TATA框。因此，上述基因的上游序列中发现的 Inr在羽纹目硅藻(羽状目硅藻)和辐射目硅藻(中心目硅藻)两者中作为核心元件发挥作用，认为可以遗传转化，但是另一方面，使用含有与上述Inr序列酷似的^ir的羽纹目硅藻内在性启动子(Cf fcpA-lA)时，不能遗传转化辐射硅藻目硅藻。结论认为用本发明涉及的多聚核苷酸(1)能够较高地发挥遗传转化，至少不是TATA框或启动子元件等的原因， 极有可能是完全未知的序列作为核心元件在发挥作用。作为上述多聚核苷酸(1)可以举出具有序列号1和序列号5的碱基序列的多聚核苷酸。并且，序列号5的碱基序列相当于编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游序列中的从Inr上游的大约30个碱基开始的大约40个碱基，在该序列中，Inr根本不能认为是CAAT框或GATA框。本发明涉及的第二启动子为( 缺失、置换或添加了上述多聚核苷酸(1)的一个或多个核苷酸的多聚核苷酸，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。在上述多聚核苷酸O)中，缺失、置换或添加的核苷酸的数目优选为1以上200以下，更优选为1以上100以下，进一步优选为1以上70以下，进一步优选为1以上30以下， 进一步优选为1以上20以下，进一步优选为1以上10以下，特别优选为1以上5以下。本发明涉及的第三启动子为( 在严格的条件下与上述多聚核苷酸(1)杂交，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。在上述多聚核苷酸(3)中，所谓严格的条件是指在含有0. SDS的2X SSC中、在 65°C下杂交后，用0. IX SSC-O· ISDS洗涤2次。另外，在上述多聚核苷酸( 和C3)中，所谓使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸是指通过导入到藻类细胞内，可以使结合于其下游的编码任意蛋白质的基因表达的多聚核苷酸。在上述多聚核苷酸(2)和(3)中，与上述多聚核苷酸(1)的同源性优选为50%以上，更优选为70%以上，进一步优选为80%以上，进一步优选为90%以上，进一步优选为 95%以上，进一步优选为98%以上，特别优选为99%以上。上述多聚核苷酸(1)-(3)可以从编码与CdebDNA病毒或其变异体的复制相关的蛋白质的基因的上游分离。但是，也可以化学合成。这些多聚核苷酸(1)-03)可以从模板通过PCR扩增使用。本发明的载体含有上述启动子和编码任意的蛋白质的基因。载体的种类只要是能够导入藻类细胞的载体，就没有特别的限定，可以使用质粒载体和病毒载体中的任意一种。但是，由于很难说感染藻类、尤其是海产藻类的病毒的研究已经得到充分发展，因此优选使用质粒载体。在此，“任意的蛋白质”没有特别的限定，只要是期望生产的有用的蛋白质即可。本发明涉及的载体还可以含有通常的载体所含有的其它的序列。作为相关的序列，例如可以举出用于确定导入了本发明的载体的藻类的标记基因、或在藻类细胞中作用的终止子。作为本发明的载体的制备方法，可以使用通常的方法。例如，将上述各序列与供体载体用限制性内切酶剪切后退火(了二一 U )，通过DNA连接酶连接即可。或者，也可以通过利用了 clonase (々口 f 一 S )反应的简单的公知方法，将各序列克隆到载体。本发明涉及的藻类的遗传转化方法，特征在于，包括制备上述载体的工序，以及将上述载体导入藻类细胞的工序。本发明的载体的制备方法如上所述，可以使用本领域技术人员公知的方法。作为本发明的载体导入藻类细胞的方法，可以使用基因枪法、玻璃珠搅拌法、微量注射法、农杆菌法(7 V 口 〃夕于‘” &法)、醋酸锂法、磷酸钙法、原生质体法等公知的方法。但是，在海产藻类的情况下，需要在高盐浓度的培养基中增殖，因此，电穿孔法不适合。利用本发明的载体遗传转化的藻类细胞能够通过利用与导入的标记基因相应的选择性培养基进行培养来确定。实施例以下通过列举实施例来更具体地说明本发明，但是本发明根本不受下述实施例的限制，可以在符合前述和后述的宗旨的范围内适当地增加变更进行实施，它们均包含在本发明的技术范围内。实施例1本发明涉及的CdebDNA病毒启动子的分离(1)感染海产藻类的病毒的基因组DNA的提取按照 Tomaru，Y.等，Aquatic Microbial Ecology, vol. 50，pp. 103-112(2008) 记载的方法，从以辐射硅藻目硅藻柔弱角毛藻为宿主的柔弱角毛藻DNA病毒(CdebDNAV) CdebDNAV 18株提取基因组。具体地，首先，通过用0. 22 μ m过滤器(MILLIP0RE社制，Millex-GS,孔径 0. 22 μ m)将病毒液(IOmL)过滤，除去藻细胞的碎片等。向得到的滤液中添加40%聚乙二醇6000溶液(Woko社制)使得最终浓度为10W/V%，在4°C下静置一晚。将该液转移至离心分离用试管(Nalgen社制，UltraBottleAssemblies)中，使用超速离心机(BECKMAN社制， Ultracentrifuge L8-70M)在57000X g、4°C下离心分离1. 5小时后，除去其上清液。通过向得到的沉淀中添加混合磷酸缓冲液(IOmM磷酸二氢钠、IOmM磷酸氢钠，pH 7.2, 5mL)，洗涤病毒粒子。再次，在217000Xg、4°C下离心分离4小时，同样地除去其上清液后，将得到的沉淀溶解到灭菌后的精制水(Millipore社制，milliQ(注册商标)，300yL)中。将该溶液转移至1. 5mL容量的微量离心管(印pendorf管)，添加蛋白水解酶K和10%肌氨酰使得各自最终浓度为lmg/mL和lw/V%，在55°C下恒温放置1. 5小时。然后，使用通常的方法进行苯酚/氯仿处理和氯仿处理，在得到的上清液中添加其十分之一量的3M醋酸钠(pH 4. 8)，进一步添加其2. 5倍量的乙醇。将该溶液在_80°C下静置1小时。然后，使用微量高速离心机 (KUB0TA社制，KUB0TA3740)在14000rpm、4°C下离心分离10分钟，将得到的沉淀用70%乙醇洗涤后，干燥。将其溶解到灭菌milliQ水(20yL)中，得到DNA溶液。进一步，使用上述文献(TomarU，Y.等Q008))记载的十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)进行精制。首先，向上述DNA溶液中添加TE缓冲液(IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，ImM EDTA (pH 8.0)),使其总量为 200 μ L。向该 DNA 溶液中添加 CTAB 溶液(1. 6Μ NaCl, 0. IM EDTA, 2w/v% CTAB, 200 μ L)，在 65°C下恒温放置1小时。向该溶液添加氯仿G00 μ L)，振动搅拌5分钟后，使用前述的微量高速离心机在14000rpm、4°C下离心分离10分钟。向该溶液中添加2倍量的乙醇，在_80°C 下静置1小时。然后，使用相同的微量高速离心机，在14000rpm、4°C下离心分离10分钟，将得到的沉淀用70%乙醇洗涤后，干燥。将该沉淀溶解到灭菌milliQ水(300yL)中，得到 DNA溶液。(2) CdebDNA病毒启动子的分离将上述⑴得到的CdebDNA病毒的基因组DNA的序列信息使用Blast (DDBJ)与数据库比较，进一步使用ORF finder (NCBI)，检索CdebDNA病毒DNA所含的0RF，检测出编码可认为与病毒的复制有关的蛋白质的区域。将该序列中的认为是翻译起始点的ATG序列的上游+107至-370的区域，通过使用了 CdPlL/attBl引物(序列号2)和CdPl_2R/attB4引物(序列号3)的PCR反应进行扩增。并且，在序列号2中5-31的碱基序列和序列号3中 5- 的碱基序列，显示为用于后述的质粒的构筑的BP clonase反应所必要的attB序列。另外，得到的CdebDNA病毒启动子的碱基序列如序列号1所示。并且，序列号1中所示的ATG 为起动密码子，不含在启动子中。PCR反应的条件如以下所示。作为PCR反应液，混合10X缓冲液(TaKaRa社制， 5 μ L)、dNTP Mix (TaKaRa 社制，4 μ L)、Ex Taq (TaKaRa 社制，0· 25 μ L, 5U/ μ L)、CdebDNA 病毒的基因组DNA (1 μ L)、以及2种引物(1 Opmol/ μ L，各5 μ L)，最后添加混合灭菌miIliQ水使总量为50 μ L。接着，重复在98. 0°C下10秒、在45. 0°C下30秒、72. 0°C下60秒的循环 40次，最后在72. 0°C下反应5分钟。为了确认片断的扩增，进行了电泳。电泳使用TAE缓冲液(三醋酸缓冲液)和琼脂糖S (二 7 # > ”一 >社制)1. 5%凝胶。作为电泳用试剂，使用向PCR产物各9 μ L分别添加IOX加样缓冲液(TaKaRa社制)IyL混合而成的混合物。另外，作为DNA分子量标记使用IOObp Ladder (，夕■一)(Τ0Υ0Β0社制，代码No. DNA_030x，2 μ L)，同时进行电泳。另夕卜， 使用Mupid电泳槽(ADVANCE社制)，在100V的条件下电泳约30分钟。电泳结束后，使用溴化乙锭，通过常规方法(Sambrook and Russell 2001)染色，在紫外线照射下拍摄照片。实施例2含有本发明涉及的CdebDNA病毒启动子的载体的制备(1)各输入性克隆质粒的制备使用Multisite Gateway (注册商标)Pro Kit (invitrogen 社制)制备分别导入了由上述实施例1得到的CdebDNA病毒启动子、作为导入基因的耐博莱霉素基因(ble) (Drocourt，D.等，Nucleic Acids Research, 18, p. 4009 (1990)),以及筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)的 fcp 终止子(Poulsen, N.等，FEBSJournal，272， pp. 3413-3423(2005))的输入性克隆质粒。具体地，利用30% PEG8000/30mM氯化镁溶液(invitrogen社制)将具有用于质粒的构筑的clonase反应所必要的attB序列的、上述实施例1中得到的CdebDNA病毒启动子溶液精制。即，向CdebDNA病毒启动子溶液(25 μ L)中添加灭菌milliQ水(75 μ L)形成100 μ L的溶液。向该溶液中添加混合30% PEG8000/30mM氯化镁溶液(50 μ L)，使用微量高速离心分离机(KUB0TA社制，KUB0TA3740)在HOOOrpm下离心分离15分钟。然后，取出上清液，将得到的沉淀溶解到灭菌milliQ水(10 μ L)中。接着，将该溶液(50fmoles)与供体载体(invitrogen社制，pD0NR221 P1-P4, IOOng/μ L)混合，通过向该溶液中添加灭菌 milliQ水形成总量为SyL的混合液。并且，该供体载体具有用于质粒的构筑的BP clonase 反应所必要的attP序列。向该混合液中进一步添加混合BP clonase (商标)Il酶混合物 (Enzyme Mix) (invitrogen社制，2 μ L)，在25°C下反应1小时。然后，向反应液中添加蛋白水解酶!((invitrogen社制，1 μ L)，在37°C下处理10分钟。将该反应液(2. 5 μ L)混合到 One Shot (注册商标)Mach 1 (注册商标)TIk化学感受态细胞(T1E chemically competent cells) (invitrogen社制，25 μ L)中，在冰上静置30分钟。然后，在42°C下进行30秒热激处理后，立刻转移至冰上，静置2分钟。然后，添加SOCGnvitrogen社制，250mL)，在37°C 下振动培养1. 5小时。将培养的菌液075 μ L)涂抹到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB琼脂培养基(1%胰蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl、l. 5%琼脂)。将该培养基在7 ^千^ 工一力一恒温箱(夕4〒？夕社制)内在37°C下倒置培养一晚(10小时左右)。将得到的菌落用接种环接种到LB液体培养基(IOmL)上，在37°C下振动培养一晚。使用Pure Yield 质粒中量纯化系统(PlasmidMinipr印System) (Promega社制)从该培养液(3mL)提取导入了具有LRclonase反应所必要的attL序列的CdebDNA病毒启动子的输入性克隆质粒。另外，与上述实施例1同样地扩增具有用于质粒的构筑的BP clonase反应所必要 attB序列的耐博莱霉素基因(ble)，与上述同样地导入到作为具有BP clonase反应所必要的attP序列的供体载体的pD0NR221 P4r_P3r，得到导入了具有LR clonase反应所必要的 attL序列的抗生素耐药性基因的输入性克隆质粒。进一步，与上述实施例1同样地扩增具有用于质粒的构筑的BP clonase反应所必要attB序列的筒柱藻的fcp终止子，与上述同样地导入到作为具有BP clonase反应所必要的attP序列的供体载体的pD0NR221 P3-P2，得到导入了具有LR clonase反应所必要的 attL序列的终止子的输入性克隆质粒。(2)目标质粒的制备fflil^ffi Gateway (iiil ) Vector Conversion System with One Shot ( 册商标)ccdB Survival (注册商标)感受态细胞(invitrogen社制)，向pBluescript SK-(Stratagene社制)中组合具有LR clonase反应所必要的attR序列的Reading Frame Casette，制备目标质粒。首先，对于pBluescript SK-Q μ g)，使用限制性内切酶EcoRI 20U (Τ0Υ0Β0社制， ου/μ L)在37°C下消化3小时。通过按照常规方法向该反应液中添加乙醇，使DNA沉淀回收。接着，使用T4DNA聚合酶使末端平滑化。即，向回收的DNA中添加10X缓冲溶液 (5 μ L)、2. 5mM dNTP (TAKARA 社制，2 μ L)、T4DNA 聚合酶(Τ0Υ0Β0 社制，0. 5U/ μ L，1 μ L)以及灭菌milliQ水(42yL)，制备总量为50yL的反应液。将该反应液在12°C下恒温放置15 分钟。立刻向该反应液中添加灭菌milliQ水(350 μ L)，按照常规方法进行苯酚/氯仿处理和氯仿处理后，持续进行乙醇沉淀回收DNA。接着，为了防止用限制性内切酶剪切后的质粒再次环化，使用 CIAP(TaKaRa 社制，Calfintestine Alkaline Phosphatase)进行该剪切碎片的5’末端的脱磷酸处理。向实施了平滑化处理的DNA中添加10XCIAP缓冲液(5 μ L) 和CIAP (0. IU/μ L, 1 μ L)，制备反应液，利用灭菌milliQ水使得总量为50 μ L。将该反应液在37°C下恒温放置15分钟，继续在56°C下恒温放置15分钟后，再次添加CIAP (0. IU/ μ L， 1口0，在371下恒温放置15分钟，继续在56°C下恒温放置15分钟。向该反应液中分别添加10% SDS溶液O. 5yL)、500mM EDTA溶液(0. 5 μ L)、蛋白水解酶K溶液QOmg/μ L， 0. 5μ L)后，在56°C下恒温放置30分钟，继续在75°C下恒温放置10分钟。然后，按照常规方法实施苯酚/氯仿处理和氯仿处理。接着，通过乙醇沉淀回收DNA，溶解到灭菌milliQ水 (10 μ L)中。将得到的具有平滑末端的pBluescript SK-和 Reading Frame Casette A (invitrogen 社制，RfA)混合，使用 pGEM-T Vector Systems Kit (Promega 社制)附带的 T4DNA连接酶连接。首先，向高压釜灭菌后的0. 2mL容量的PCR用试管中添加2 X快速连接缓冲液(Promega社制，5 μ L) ^pBluescript SK-(lOOng/μ L, 0. 5 μ L)、RfA (5ng/μ L，2 μ L)、 T4DNA连接酶(卩1~011^83社制，3。/^1^，1口1^)和灭菌milliQ水(1. 5 μ L)，制备总计为10 μ L 的反应液。将该反应液在室温下保存1小时，在4°C下恒温放置一晚(16小时以上)。将该连接性(’彳夕.'一 * 3 > )溶液(5μ L)混合到 ccdB SurvivalCompetent Cells (invitrogen 社制，50 μ L)，在冰上静置30分钟。然后，在42°C进行30秒热激处理后，立刻转移到冰上，静置2分钟。接着，添加S0C(250mL)，在37°C下振动培养1. 5小时。将培养的菌液(300 μ L) 涂抹到含有25 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂培养基上。将该培养基在、 千〉工一力一恒温箱内在37°C下倒置培养一晚。将得到的菌落用接种环接种到LB液体培养基(IOmL)上，在37°C下振动培养一晚。使用Pure Yield质粒中量纯化系统(Promega社制)从该培养液(3mL)提取目标质粒。(3)表达克隆质粒载体的制备通过使用Multisite Gateway Pro Kit (invitrogen 社制)在上述实施例 2(1)中得到的输入性克隆质粒与上述实施例2 (2)中得到目标质粒之间进行LRclonase反应，制备启动子、抗生素耐药性基因以及终止子连接而成的表达克隆质粒载体。具体地，将分别组合了启动子、抗生素耐药性基因、终止子的三种输入性克隆质粒 (分别lOfmoles)和目标载体(20fmoles)混合，进一步通过添加灭菌milliQ水制备总量为8μ L的混合液。向该溶液中添加混合LR ClonaseII PLUS Enzyme Mix (invitrogen社制，2yL)，在25°C下反应16小时。然后，向该反应液中添加蛋白水解酶!((invitrogen社制，1 μ L)，在37°C处理10分钟。将该反应液(2. 5 μ L)混合到One Shot (注册商标)Mach 1(注册商标)TIkK学感受态细胞(invitrogen社制，25 μ L)中，在冰上静置30分钟。然后，在42 °C下进行30秒热激处理后，立刻转移至冰上，静置2分钟。然后，添加SOC (250mL)， 在37°C下振动培养1. 5小时。将培养的菌液075 μ L)涂抹到含有50 μ g/mL氨苄西林的LB 琼脂培养基。将该培养基在7 ^千- 一力一恒温箱内在37°C下倒置培养一晚。将得到的菌落用接种环接种到LB液体培养基(IOmL)上，在37°C下振动培养一晚。使用Pure Yield 质粒中量纯化系统(Promega社制)从该培养液(3mL)提取表达克隆质粒载体。G) DNA序列的确认为了确认制备得到了作为目标的表达克隆质粒载体，使用双脱氧法(Dideoxy)确定碱基序列。使用上述实施例2 (3)制备的表达克隆质粒载体(200ng)为模板，进行循环序列测定PCR。其反应条件如以下所示。反应液(IOyL)由模板DNAdOOng/μ LJyL)、Big Dye 终结者循环测序(Big Dye Terminator CycleSequencing)ver. 3. 1 (AppliedBiosystems 社制，0. 5 μ L)、5X序列测定缓冲液O μ L)、引物(1. 6pmol/ μ L，0. 66 μ L)、灭菌蒸馏水 (4.84yL)构成。引物使用Μ13Μ3引物(序列号4)。作为反应条件，在95°C下加热5分钟后，进行96°C下10秒、50°C下5秒、60°C下4分钟的反应40个循环。反应后，将反应液转移至1. 5mL容量的微量离心管，添加3M醋酸钠(1 μ L)、99· 5%乙醇(25 μ L)和125mM EDTA 溶液(1 μ L)，用手指弹的方式进行充分混合后，在室温下放置15分钟。在14000rpm、4°C 下离心分离20分钟后，用黄色枪头(4 - 口一f 7 )小心除去上清液，添加70%乙醇 (35 μ L)，充分混合。再次，在14000rpm、4°C下离心分离10分钟后，用黄色枪头将上清液完全除去，在开盖的状态下，在室温下放置10分钟，使沉淀干燥。向干燥的颗粒中添加甲酰胺(Applied Biosystems社制，10 μ L)，使用高知大学综合研究中心基因实验设施内的ABI PRISM(注册商标)3100-AVant Genetic Analyzer (Applied Biosystems社制)进行解析。预先，使用基因解析软件Vector NTI Advance Ver 10. O (invitrogen 社制，http://www. invitrogen. com/vntigateway)，向目标质粒的碱基序列中组合启动子、抗生素耐药性基因以及终止子的碱基序列，由此，制作表达基因质粒载体的碱基序列。接着，通过使用Vector NTI Advance Ver 10. O的AlignX进行校正(τ·，O >卜)，将该在计算机上制作的表达克隆质粒载体的碱基序列与通过上述方法实验确定的表达克隆质粒载体的碱基序列进行比较，确认到上述实施例2C3)制备的表达克隆质粒载体中导入了目标基因。
得到的表达克隆质粒载体的结构如图1所示。实施例3含有本发明涉及的CdebDNA病毒启动子的载体的制备使用耐^ 一义七才7〗J * >基因(nat) (Krugel等，1993年)作为抗生素耐药性基因，作为终止子使用来自假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的fcp终止子 (Poulsen, N.等，Journal of Phycology, 42, pp. 1059-1065 (2006))，与上述实施例 2 同样地制备含有CdebDNA病毒启动子的载体。得到的表达克隆质粒载体的结构如图2所示。比较例1-4含有以往病毒启动子的载体的制备与上述实施例2同样地操作，制备具有羽纹目硅藻的内在性启动子，另外，导入了耐博莱霉素基因(ble)作为抗生素耐药性基因和筒柱藻的fcp终止子作为终止子的质粒载体(比较例1)、以及制备具有辐射目硅藻的内在性启动子，另外，导入了耐7 —> 七才^ * >基因(nat)作为抗生素耐药性基因和来自假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的fcp终止子作为终止子的质粒载体(比较例2)。另外，与上述实施例2同样地操作，制备具有来自花椰菜花叶病毒的启动子(CaMV 启动子)，另外，导入了耐博莱霉素基因(ble)作为抗生素耐药性基因和筒柱藻的fcp终止子作为终止子的质粒载体(比较例3)、以及制备导入了耐^ 一才^ 'J ν >基因(nat) 作为抗生素耐药性基因和来自假微型海链藻的fcp终止子作为终止子的质粒载体(比较例 4)。实施例4羽纹目硅藻的遗传转化使用上述实施例2、上述比较例1以及上述比较例3的质粒载体，将羽纹目硅藻三角褐指藻进行遗传转化。具体地，使各质粒载体附着到平均粒径l.lym的钨粒子M17上。另外，将羽纹目硅藻三角褐指藻以每个培养基5X107细胞涂抹到固体培养基上。使用粒子枪(Bio-Rad社制， Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System)，将上述钨粒子以 He 气压 1350psi 或IlOOpsi打入细胞内。接着，用含有博莱霉素150μ g/mL的1. 0%琼脂f/2培养基培养该细胞。结果如表1所示。另外，用PCR确认用上述含抗生素培养基繁殖的细胞的菌落进行了遗传转化。使用IOOmL的培养基培养繁殖的菌落，回收藻类细胞后，通过与上述实施例1 (1)同样的方法， 提取基因组DNA。以得到的基因组DNA作为模板，使用与导入的抗生素基因(ble)特异性结合的引物进行PCR。PCR反应的条件基本上与上述实施例1(2)同样地操作，使循环次数为 40次，退火温度为60°C。对得到的扩增DNA分析后的电泳照片如图3所示。图3中，“M”为分子量标记，“1”为导入了抗生素基因(ble)的质粒载体的泳道，“2”为三角褐指藻野生菌株的泳道，“3-5”为用含有来自花椰菜花叶病毒的启动子和抗生素基因(ble)的质粒载体进行遗传转化的菌株的泳道，“6-8”为用含有本发明涉及的启动子和抗生素基因(ble)的质粒载体进行遗传转化的菌株的泳道。实施例5辐射硅藻目硅藻的遗传转化使用实施例3、上述比较例2以及上述比较例4的质粒载体，与上述实施例4同样地操作，将辐射目硅藻角毛藻进行遗传转化。但是，向培养细胞的培养基添加500yg/mL ) 一义七才；^丨」* >。结果如表1所示。
[表 1]
权利要求
1.一种启动子，其特征在于，该启动子具有下述(1)-(3)任意一项的结构，(1)构成非编码区域的多核苷酸，所述非编码区域位于编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游；(2)缺失、置换或添加了上述多聚核苷酸(1)的一个或多个核苷酸的多聚核苷酸，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸；(3)在严格的条件下与上述多聚核苷酸(1)杂交，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。
2.根据权利要求1所述的启动子，其中，上述多聚核苷酸(1)具有序列号5的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的启动子，其中，上述多聚核苷酸(1)具有序列号1的碱基序列。
4.一种载体，其特征在于，该载体含有权利要求1-3中任意一项所述的启动子，以及编码任意蛋白质的基因。
5.一种藻类的遗传转化方法，其特征在于，该遗传转化方法包括制备权利要求4所述的载体的工序，以及将上述载体导入藻类细胞的工序。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种可适用于广泛种类的藻类的、且高效的遗传转化技术。本发明涉及的启动子以具有构成非编码区域的多核苷酸等为特征，所述非编码区域位于编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游。
文档编号C12N15/09GK102292440SQ20108000517
公开日2011年12月21日 申请日期2010年1月22日 优先权日2009年1月23日
发明者外丸裕司, 足立真佐雄, 长崎庆三 申请人:国立大学法人高知大学