酿造方法

专利名称：酿造方法
技术领域：
本申请涉及酿酒方法，其中使用热稳定性蛋白酶以供控制饮料的胶体稳定性。 所述蛋白酶可从拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、芽孢杆菌属(Bacillus)或热子囊菌属 (Thermoascus)获得。所述蛋白酶可在过滤(Iautering)过程中添加至醪液和/或在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前添加至麦芽汁。
背景技术：
许多饮料如啤酒、葡萄酒、果汁等在制造过程中或在储藏中产生沉淀物。该现象称为浑浊物(haze)产生。浑浊物产生一般认为是由于饮料中存在的多酚和蛋白质的相互作用所致。该相互作用导致不可溶或部分可溶的胶体颗粒悬液的形成。由于浑浊物形成一般类似由微生物污染产生的浑浊(cloudness)，一般而言优选饮料特别是啤酒即使长期储藏后仍非常清澈透明。因此开发了减少此种浑浊物形成的工艺。这些工艺靶向所述蛋白质或多酚或两者皆是。硅胶、膨润土、聚乙烯基聚吡咯烷酮(PVPP)等已用于吸收蛋白质和多酚，减少浑浊物形成并促进胶体稳定性。然而此类物质当反复使用时，导致减少的回报(diminishing returns)，并因此导致增加的成本。而且，它们还从所述饮料去除其他所需的化合物，而可影响其品质。酶特别是蛋白酶亦在发酵过程中用于促进饮料特别是啤酒的胶体稳定性。传统而言，蛋白酶像木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶已用于减少冷冻浑浊物形成。然而这些蛋白酶不具特异性，并已显示由于水解负责泡沫形成的蛋白质而对饮料泡沫稳定性有影响。而且，这些还导致饮料味道的变化。另一种方法为使用仅水解亲水性浑浊物形成蛋白质而非疏水性泡沫形成蛋白质的特异性蛋白酶。举例而言，已知一种脯氨酰特异性内肽酶特异性水解浑浊物形成蛋白质从而促进胶体稳定性并保留泡沫稳定性。在发酵过程中使用蛋白酶可使其在最终啤酒中保留活性，而这一般是不合意的。此外，通过巴氏消毒法灭活可导致啤酒味道低劣(burned)。仍有对用于胶体稳定化饮料特别是啤酒的改进的工艺的需要。

发明内容
在一个方面，本发明涉及酿造啤酒的方法，包括在过滤过程中将醪液和/或在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前将麦芽汁与热稳定性蛋白酶相接触。在一个方面，所述蛋白酶可从拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、芽孢杆菌属 (Bacillus)或热子囊菌属(Thermoascus)获得。在一个方面，本发明涉及酿造啤酒的方法，包括在过滤过程中将醪液和/或在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前将麦芽汁与包含对应于SEQ ID NO :1、2或3的氨基酸序列及其与SEQ ID NO :1、2、3具有至少70%同一性的变体的蛋白酶相接触。
在一个方面，所述方法导致啤酒产品中浑浊物的减少。在一个方面，本发明涉及酿造啤酒的方法，包括在过滤过程中将醪液和/或在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前将麦芽汁与热稳定性蛋白酶相接触，由此与以常规方式酿造的啤酒相比时，其胶体稳定性增加。在一个方面，所述接触在淋洗(sparging)时进行。在一个方面，所述接触在过滤之后进行。在一个方面，所述接触在至少60摄氏度(本文下文中称作。C )的温度进行。在另一个方面，所述温度为至少70°C。在又一个方面，所述温度为至少74°C。更优选至少75°C， 更优选至少76°C，更优选至少77°C且最优选至少78°C。在一个方面，所述接触进行10分钟(下文中称作“min”)至5小时的时间，优选地，所述接触为20min至3小时，更优选30min至2小时，且最优选30min至1小时。


图1显示在由经SEQ ID NO 1的蛋白酶处理的醪液所得的麦芽汁和啤酒相比未经处理的醪液(对照)的浑浊物形成测量。Y轴表示比浊法浊度单位(NTU)的值。
具体实施例方式啤酒酿造工艺对本领域技术人员是公知的。常规步骤可用下述方式概述起始材料为发芽的(即经弄湿、发芽然后干燥的)大麦和/或未经发芽的辅料，称为谷物(grist)。 在淀粉糖化(mashing)过程中(此时将谷物磨碎并与水混合，加热并搅拌)，通过麦芽中天然存在的酶的协助，糖类降解为可发酵的糖。在淀粉糖化之后，需要将液体提取物(麦芽汁)与固形物(糟颗粒和辅料)分离以获得清澈的麦芽汁。该工艺称作过滤。在过滤之前， 醪液温度可升至约75-78°C (165-173° F)(称作出醪(mashout))。麦芽汁过滤是重要的， 因为所述固形物富含大量蛋白质、不良修饰的淀粉、脂肪物质、硅酸盐和多酚(鞣质)和蛋白质。在收集第一麦芽汁之后留在糟中的提取物亦可通过在滤饼上部添加入热水来洗出。 该工艺称作淋洗。所述热水流经所述糟，并溶解剩余的提取物。所述经稀释的麦芽汁称作第二麦芽汁，且其提取物下降至第一麦芽汁起始重量的1_2%。在添加啤酒花之后，将麦芽汁煮沸。由此使多种物质包括几种蛋白质变性，且会发生多酚类的沉淀。在冷却并去除沉淀物之后，对制得的啤酒麦芽汁(a)进行通气并添加酵母。在通常持续5-10日的主要发酵 (mainfermentation)之后，去除大部分酵母，并将所谓生啤酒(green beer)在较低温度， 通常为0-5°C下储藏一至12周。在此期间残留的酵母会与多酚类一同沉淀。为了去除残余的过量多酚类，进行过滤。经发酵的啤酒(c)此时可在装瓶之前经充气(carbonize)。二氧化碳不仅贡献于感受到的“醇厚(fullness) ”和“浓郁(body) ”，且作为增味剂，其亦起增强起泡潜力的作用，并在延长产品的储藏期限中起重要作用。术语“啤酒”用于本文旨在至少涵盖从所有制备自未发芽的谷物的醪液以及所有制备自发芽的谷物的醪液，以及所有制备自未发芽和发芽的谷物的混合物的醪液所制备的啤酒。术语“啤酒”还涵盖用辅料制备的啤酒，以及具有所有可能的乙醇含量的啤酒。
不拘于理论，认为在低温或较长时间储藏的啤酒中多酚类和蛋白质的相互作用导致称为浑浊物的聚集物的产生。由于浑浊物形成影响啤酒的品质(亦称作胶体稳定性)，开发了阻止此种浑浊物形成的方法。在酿造工艺中，大多数蛋白质-多酚复合物通过在啤酒陈化过程中冷却液体而沉淀出来。任何残余的多酚和/或蛋白质使用PVPP、硅胶、膨润土等去除。依照本发明，啤酒的胶体稳定性定义为以EBC单位测量的胶体不稳定性变得大于2之前的温热循环的量。一个温热循环对应于大约25日的储藏期限(MEBAK 2. 15. 2. 1, Fociertmethode, Vorausbestimmung derchemisch-physikalischen Stabilitat, Methodensamlung der Mitteleuropaischen Brautechniche Analysekommission (MEBAK), Selbstverlag der MEBAK, Freising ffeihenstephan)。浑浊物在本领域中亦称作“混浊(cloudiness) ”或“浊度(turbidity) ”或“胶体不稳定性”，并因此可互换使用。另一个减少浑浊物形成的方法是通过使用蛋白酶。将具有广谱活性的蛋白酶像木瓜蛋白酶用于剪切蛋白质，可能得到较低和/或更可溶的蛋白质-多酚聚集物。然而这些酶的使用亦影响涉及泡沫稳定性的蛋白质，因此影响最终产物的品质。假设为优选对具有浑浊物活性的蛋白质起作用，而不对泡沫活性蛋白质起作用， 从而保持最终产物泡沫稳定性的特异性蛋白酶，像脯氨酰特异性蛋白酶或丙氨酸特异性蛋白酶也是已知的。优选最终产物不含外源添加的酶活性。因此，酶像上述蛋白酶，通常在淀粉糖化工艺中添加至醪液(水+谷物)。因此他们在淀粉糖化过程中具有活性，而在过滤或煮沸麦芽汁过程中失活或降解。本发明人令人惊讶地发现，将蛋白酶在过滤过程中添加至醪液，和/或在过滤步骤之后，但在煮沸麦芽汁步骤之前添加至麦芽汁，导致良好的胶体稳定性。令人惊讶的是，本发明人发现，当在淀粉糖化起始时添加并不显示任何作用或对胶体稳定性直接起负作用的蛋白酶，当在过滤过程中和/或之后时显示胶体稳定性非常良好的增加。当将酶在淀粉糖化中添加时作用的缺乏可能由几种原因，其一为所述蛋白酶在醪液中受抑制。本发明人还发现，在淀粉糖化中添加的蛋白酶具负作用而当在工艺中较晚添加时具正作用涉及蛋白酶当在工艺早期添加时将基于蛋白质的物质释放于麦芽汁的能力，这导致对胶体稳定性的负面影响，尽管该酶能够降解胶体形成蛋白。本发明人发现，如果在过滤之后或工艺的足够晚期(例如，在过滤过程中，更特别是在淋洗过程中)添加该蛋白酶以限制蛋白物质释放于麦芽汁，这是可以避免的。令人惊讶的是，本发明人发现释放的蛋白质的量必须维持在通过Kjehldl测量蛋白质水平的增加少于10%，优选少于9%，更优选少于8 %，更优选少于7 %，更优选少于6 %，且最优选少于5 %。令人惊讶的是，本发明人发现，在MW为10. OOOKD (条带4-6)附近的释放的蛋白质的量维持在相对较低水平。令人惊讶的是，还发现，并不视为对作用于浑浊物活性蛋白质具特异性并由此并不对泡沫活性蛋白质具有低活性的蛋白质，当在过滤过程中添加至醪液和/或在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前添加至麦芽汁时，不仅可提供良好的胶体稳定作用，还可对啤酒的泡沫稳定性不具任何或仅具略微负面的作用。令人惊讶的是，本发明人发现，亦具热稳定性的蛋白酶当在过滤过程中添加于醪液和/或在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前添加至麦芽汁时提供了良好的胶体稳定作用。令人惊讶的是，在过滤之后施于麦芽汁的蛋白酶的胶体稳定作用可在2小时之内获得，这比当施于发酵时的几日要短得多。本发明人令人惊讶地发现，热稳定性蛋白酶当在过滤过程中添加于醪液和/或在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前添加至麦芽汁时具有非常良好的胶体稳定作用。本发明人还发现，使用在酿造中的过滤过程中和/或之后基本上保留其活性的蛋白酶令人惊讶地导致啤酒胶体稳定性的增加。因此，本发明在一个方面涉及酿造啤酒的方法，包括将醪液在过滤过程中和/或将麦芽汁在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前与可从拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、芽孢杆菌属(Bacillus)或热子囊菌属(Thermoascus)获得的蛋白酶相接触。术语“醪液”、“过滤”和“麦芽汁”具有本领域中的常规含意。蛋白酶在本领域中是已知的。其为具有蛋白酶活性的多肽，并亦称作肽酶、蛋白酶(proteinase)、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可为外切类型的，其从肽任一端起始水解该肽，或为内切类型的，其在多肽链之内起作用(内肽酶)。内肽酶对N或C端封闭的、与所述蛋白酶的特异性相关的肽底物显示活性。术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。其包括任何属于EC 3. 4酶组(包括其十三个亚类中的每一个)的酶。所述 EC 数字指来自 NC-IUBMB，Academic Press, San Diego, Calif.，包括分别出版于 Eur. J.Biochem. 1994，223，15 ；Eur.J. Biochem. 1995，232，1 6 ；Eur.J. Biochem. 1996，237，1 5 ； Eur. J. Biochem. 1997，250，1 6 ；and Eur. J. Biochem. 1999，264,610 650 的增补本 1 5 的 Enzyme Nomenclature 1992。该命名法定期增补并更新；参见万维网(Wffff)地址www. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/index, html。蛋白酶根据其催化机理归类为下述组丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、 天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)和未知或尚未归类的蛋白酶(U)，参见Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner(编)，Academic
(1998)，特别是一般介绍部分。蛋白酶可使用任何其中采用底物的测定法测量，所述底物包含与所述蛋白酶特异性相关的肽键。亦可对所述蛋白酶适用测定PH和测定温度。测定PH值的实例为pH 2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11 或 12。测定温度的实例为 30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90 或 95°C。蛋白酶底物的实例包括但不限于酪蛋白，如天青精交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)和 Protazyme AK0对本发明蛋白酶的起源和/或依照本发明的用途并无限制。因此，术语蛋白酶不仅包括从任何属获得的天然或野生型蛋白酶，但还包括其呈现蛋白酶活性的突变体、变体、片段等，以及合成蛋白酶如改组的蛋白酶和共有蛋白酶(consensus protease)。此种经遗传工程改造的蛋白酶可如本领域通常已知的方法，例如通过定点诱变、PCR(使用含有所需突变的PCR片段作为PCR反应中的一个引物)，或通过随机诱变进行制备。共有蛋白(consensus protein)的制备描述于例如EP 897985。基因改组一般地描述于例如WO 95/2洸25和 W096/00343。蛋白酶基因的重组可如Ness，J. E.等 in Nature Biotechnology,Vol. 20 (12)，pp. 1251 1255，2002所述通过合成改组独立于亲本的特定序列进行。设计了其DNA序列是简并的以提供所有亲本蛋白酶组中所见的所有氨基酸可能性的合成的寡核苷酸，并依照参考文献装配所述基因。改组可对全长序列实施，或仅对序列的部分实施，并于之后与基因其余部分组合以给出全长序列。在一个方面，所述蛋白酶可从拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)获得。Meyer 在 1976 年描述了拟诺卡氏菌(Meyer，1976，ht J Syst Bacteriol，26， 487-493)。达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)为该属的一个种，并不同地称作达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei)、南极拟诺卡氏菌(Nocardiopsis antarctica)或甚至微黄褐链霉菌 (Streptomyces flavidofuscus)。优选地，所述蛋白酶可从拟诺卡氏菌属获得，更优选达松维尔拟诺卡氏菌、白拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba)或南极拟诺卡氏菌，更优选达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种。在另一个方面，所述蛋白酶可从芽孢杆菌属或热子囊菌属获得。可从芽孢杆菌属获得的蛋白酶在本领域是公知的。可从热子囊菌属获得的蛋白酶描述于WO 03/048353。术语“可获得自”本文中与给定来源相连意指由核酸序列编码的多肽是由该来源或由其中存在来自所述来源的核酸序列的重组细胞(亦称作宿主细胞)产生的。在一个优选实施方案中，所述多肽分泌至胞外。取决于在重组产生方法中采用的宿主，本发明的蛋白酶可经糖基化或可为非糖基化的。此外，本发明的蛋白酶亦可包含起始的经修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况下其为宿主介导的过程的结果。所述宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。可用的宿主细胞为细菌细胞如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞或链霉菌细胞，或乳酸细菌细胞；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌属菌种G^seudomonas sp.)。乳酸细菌包括但不限于乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属 (Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属 (Pediococcus)禾口肠球菌属(Enterococcus)的菌禾中。其他宿主细胞可为真菌细胞(包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门 (Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)禾口接合菌门(Zygomycota)(如由 Hawksworth 等，于 Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi,第八版，1995,CAB International, University Press, Cambridge, UK 中所定义)以及卵菌门(Oomycota) (如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi) (Hawksworth 等，1995，见上)。在一个方面，所述真菌宿主细胞为酵母细胞。“酵母”如用于本文中包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)禾口属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽抱纲 (Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，应将酵母定义为如 Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A. , Passmore, S. M.,禾口 Davenport, R.R.编，Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9，1980)中所述。所述酵母宿主细胞可为假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。所述真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括括真菌亚门(Eumycota) 和卵菌亚门(Oomycota)(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可通过发酵进行。丝状真菌宿主细胞的实例为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、 镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、 脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属CThielavia)、弯颈霉属 (Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)菌种的细胞，但不限于此。在本发明的产生方法中，使用本领域已知方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养， 所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物 (Iysate)回收。所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，蛋白酶可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。本发明的蛋白酶可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型 (preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification, J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden 编，VCH Publishers, New York, 1989)。在一个方面，所述蛋白酶包含对应于SEQ ID NO :1的氨基酸序列，及其与SEQ ID NO 1具有至少70%同一性的变体。在另一个方面，所述蛋白酶包含对应于SEQ ID NO :2或3的氨基酸序列及其与相应的亲本序列具有至少70%同一性的变体。术语“变体”旨在表示来源于SEQ ID NO :1或2或3并具有蛋白酶活性的多肽。 通常，所述变体与亲本蛋白酶(在此情况下，为具有SEQ ID N0:1或2或3的蛋白酶)相差一个或多个氨基酸残基，例如，其可为从所述蛋白酶的N端或C端之一或两者的添加或缺失，在蛋白酶氨基酸序列之内一个或多个位点的插入或缺失，或在亲本蛋白酶氨基酸序列之内，或在一端或两端取代一个或多个氨基酸残基。变体可为天然存在的(例如，由基因等位变体编码的多肽变体，所述等位变体为占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式)或通过许多本领域已知技术(例如PCR)人工构建的。本发明的蛋白酶包含与SEQ ID NO :1或2或3的成熟肽部分具有例如，至少约70%的同一性程度的氨基酸序列。在具体实施方案中，与SEQ ID NO :1或2或3或4的同一性程度为至少约 72%、74%、76%、78%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或至少 99%。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是通过为Needleman-Wunsch 比对(即全局比对)的程序“比对^I定的。该程序用于多肽以及核苷酸序列的比对。使用缺省评分矩阵BL0SUM50，其中缺口第一个残基的罚分为-12而缺口其他残基的罚分为_2。“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和 D. J. Lipman(1988), “ Improved Tools for Biological Sequence Analysis" ,PNAS85 2444 2448, L^^ff. R. Pearson (1990) " Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, “ Methods in Enzymology 183:6398)。FASTA 蛋白质比对使用对缺口大小无限制的 Smith-Waterman 算法(参见〃 Smith-Waterman algorithm"，Τ. F. Smith 和 Μ. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147 :195 197)。两个氨基酸序列之间的同一性程度亦可通过Clustal方法(Higgins，1989， CABIOS 5 151 153)使用 LASERGENE. TM. MEGALIGN. T M.软件(DNASTAR, Inc.，Madison, Wis.)使用同一性表和下述多重比对参数来确定缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。 配对比对参数为K元组(Ktuple) =1，缺口罚分=3，窗口(windows) =5，而对角线 (diagonals) = 5。在一个方面，蛋白酶与麦芽汁的接触是在过滤之后进行的。过滤时的温度通常为大约78°C。因此可能在过滤之后需要降低温度以允许酶起作用，降低温度增加了酿造工艺的成本，因此尽可能少地降低温度是有利的，且优选完全不降低。酶施用的温度优选至少为60°C，更优选至少70°C，更优选至少72°C，更优选至少 740C，更优选至少75 °C，更优选至少76 °C，更优选至少77 °C，且甚至更优选至少78 °C。在一个方面，所述蛋白酶为热稳定蛋白酶。热稳定性为酶在更高温度保留其活性的能力的量度。就本发明而言，蛋白酶的热稳定性是使用对所述蛋白酶对其具有活性的蛋白酶底物如例如实施例3中所述的ftOtazyme AK 的测定法来测量的。在一个方面，所述蛋白酶在70°C pH 5. 5(使用实施例3中所述的缓冲系统)温育 10分钟之后保留至少70%活性、如至少75%、如至少76%、如至少77%、如至少78%、如至少79%、如至少80%、如至少81%、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、 如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91%、如至少 92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少 99%。在一个方面，所述热稳定性亦可在70°C温育更长时间期间之后进行测量，如例如使用实施例3中所述的方法进行60分钟。在此类情况下，所述蛋白酶保留其在pH 5.5(使用实施例3中所述的缓冲系统)所具的活性的至少20%，如至少25%、如至少30%、如至少 35%、如至少40%、如至少45%，如至少50%、如至少55%、如至少60%、如至少65%、如至少70%、如至少75%、如至少80%、如至少85%、如至少90%、如至少95%、如至少97%、如至少99%。在一个方面，所述接触是在IOmin至5小时，优选20min至3小时，更优选30min至2小时且最优选30min至1小时的期间进行的。在一个方面，本发明的方法导致与以常规方式酿造的啤酒相比，浑浊物减少。为了量化啤酒中浑浊物的量，常常使用浊度计亦称透程计(hazemeter)。在浊度计中，测量在预先描述的相对于入射光线的方向的角度散射的光的量。浊度测量非常适用于测量由于蛋白质-多酚相互作用的结果而形成的浑浊物。“以常规方式酿造的啤酒”定义为通过其中在淀粉糖化阶段过程中将蛋白酶添加至醪液的酿造方法制得的啤酒。在另一个方面，本发明的方法导致在酿造和储藏过程中用于减少浑浊物形成的处理助剂(processing aids)使用的减少。“处理助剂”为在酿造和/或储藏过程中用于减少浑浊物形成的试剂。处理助剂包括但不限于硅胶、PVPP、膨润土等等。在一个方面，所述减少是百分之100，意指不使用任何处理助剂。在另一个方面，不用硅胶过滤而产生啤酒，且优选不用硅胶和PVPP过滤。在一个方面，本发明的方法得到与以常规方式酿造的啤酒相比泡沫稳定性相同或更高的啤酒。泡沫是由因为在调制啤酒过程中压力释放所致而释放的二氧化碳产生的。泡沫由于表面活性剂像泡沫活性蛋白的存在而变得稳定，所述泡沫活性蛋白聚集于泡沫表面，并在气泡周围形成弹性的膜(skin)。啤酒的泡沫稳定性是通过使用NIBEM方法 (MEBAK 2. 19.2)在给定距离测量泡沫崩溃所需的时间(以秒计)来确定的。该方法在本领域是己知的(MEBAK 2. 19. 2.，Schaumbestimmung nach NIBEM, Methodensamlung der Mitteleuropaischen Brautechniche Analysekommission (MEBAK), Selbstverlag der MEBAK, Freising Weihenstephan)。实施例实施例1:SEQ ID NO :1的蛋白酶当在淀粉糖化过程中添加或添加至成品啤酒时在啤酒胶体稳定中的作用目标为调查是否上述蛋白酶在醪液或在成品啤酒中的使用显示类似的蛋白水解活性和是否胶体稳定性有任何差异。蛋白酶如US5312748中所述获得。蛋白水解酶活性是通过公知的Anson血红蛋白方法确定的，参见 Journal of General Physiology，22，79-89 (1959)。一个 Anson 单位 (AU)，是在9. O的pH值和25°C的温度在10分钟的反应时间中，以这样的起始速度消化血红蛋白而使得每分钟生成的无法用三氯乙酸沉淀的分解产物的量与一毫当量的酪氨酸与酚试剂给出相同颜色的蛋白水解酶的量。以实验室规模用100%麦芽进行了淀粉糖化试验。根据表1所示的淀粉糖化实验方案，将醪液用蛋白酶以对应于5mg纯酶蛋白(EP)/kg麦芽蛋白酶(SEQ ID N0:1)的量处理。将对照也依照所示的概貌(profile)但不添加蛋白酶进行淀粉糖化。表1 淀粉糖化概貌时间(min)温度(°c)0523052406270628072110721167813120P)发酵(12 5日，酵母菌株W 35/70)，将麦芽汁(12 (Turbidimeter Hach型2100AN)测量麦芽汁和啤酒的浑浊物。此外，在最终发酵成的啤酒中浑浊物形成潜力通过依照 Siebert 1997 (J. Am. Soc. Brew. Chem. 55 (2) :73-78,1997)公开的方法添加鞣酸强制形成浑浊物来测量。结果在图1中给出。从结果来看，令人惊讶的是，显然蛋白酶并未显示对麦芽汁或啤酒浊度的影响。甚至添加鞣酸亦无任何差异，这表明将鞣质添加至醪液并不能增强胶体稳定性。实施例2 蛋白酶当在过滤过程中或之后但在煮沸麦芽汁之前添加时对啤酒胶体稳定性和泡沫稳定性的作用从通常的100%良好修饰的德国清淡比尔森(pilsner)麦芽工业规模煎剂淀粉糖化工艺依照下述概貌回收麦芽汁在62°C开始淀粉糖化(mashing-in)20分钟，将温度上升至65°C (I0C /分钟)，在65°C放置15分钟，将20%的醪液煮沸20分钟并与维持在65°C主醪液混合，得到72°C的淀粉糖化温度，维持30分钟，将20%的醪液煮沸并与维持在72°C的主醪液混合，得到78°C的温度，并起始过滤。在淋洗过程中添加水，得到1 5的麦芽对水的比例。将麦芽汁稀释至Plato 12，并分为三个批次。批次A的麦芽汁不用酶处理(对照)，批次B的麦芽汁在70°C用5mg酶蛋白/kg对应于0. 019AU/kg麦芽的SEQ ID NO 1的麦芽蛋白酶温育2小时，而批次C的麦芽汁在60°C用5mg酶蛋白/kg麦芽的对应于2. 7g Brewers Clarex/IOOL 啤酒的从 DSM(Het Overloon 1 6411 TE Heerlen (NL))获得的脯氨酸特异性蛋白酶Brewers Clarex温育2小时。在酶温育终止之后，将麦芽汁与啤酒花(8% α酸)煮沸(酶灭活)一小时。以中试规模工艺对三个麦芽汁批次进行相同的酿造工艺。 将15χ106细胞/mL通常的底部发酵酵母类型(W34 70”)投料于麦芽汁中。发酵在12°C进行140小时，并用PVPP(15g/hL)稳定化所述三个啤酒批次。手工将所述啤酒装瓶于0. 5L 烧瓶。所得啤酒样品的胶体稳定性是依照MEBAK 2. 15. 2. 1 (0°C /40°C /OV )的步骤确定的。在多至15个温热循环之后以EBC(European Brewery Convention)单位测量浑浊物形成。着重于胶体稳定性的啤酒储藏期限可通过在浑浊物测量值超过2. OEBC单位之前啤酒可经历的温热循环数来估计(一个温热循环对应于大约25日的储藏期限)。
权利要求
1.一种酿造啤酒的方法，包括将醪液在过滤过程中和/或将麦芽汁在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前与热稳定性蛋白酶相接触。
2.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶可从拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、芽孢杆菌属(Bacillus)或热子囊菌属(Thermoascus)获得。
3.权利要求1的方法，其中热稳定性意指纯蛋白酶的蛋白酶活性在依照实施例3在 70°C温育10分钟之后，在pH5. 5测量时为参照活性的至少70%。
4.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶包含对应于SEQID NO 1或其与SEQ ID NO 1 具有至少70%同一性的变体的氨基酸序列。
5.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶包含对应于SEQID NO 2或其与SEQ ID NO 2 具有至少70%同一性的变体的氨基酸序列。
6.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶包含对应于SEQID NO 3或其与SEQ ID NO 3 具有至少70%同一性的变体的氨基酸序列。
7.权利要求1的方法，其中麦芽汁中蛋白质的量，定义为依照实施例6中的raiK，增加了少于10%。
8.权利要求1的方法，其中所述GATA，依照实施例6测量，为至少25%。
9.权利要求1的方法，其中胶体稳定性相对于以常规方式酿造的啤酒增加。
10.权利要求1的方法，其中所述方法导致相对于以常规方式酿造的啤酒减少使用或不使用处理助剂。
11.权利要求1的方法，其中所述啤酒是不经硅石过滤而产生的。
12.权利要求1的方法，其中所述啤酒具有与以常规方式酿造的啤酒相等或更高的泡沫稳定性。
13.权利要求1的方法，其中所述接触是在过滤之后进行的。
14.权利要求1的方法，其中所述接触是在淋洗过程中进行的。
15.权利要求1的方法，其中所述接触是在至少60°c的温度进行的。
16.权利要求1的方法，其中所述接触是在至少70°C的温度进行的。
17.权利要求1的方法，其中所述接触是在至少75°C的温度进行的。
18.权利要求1的方法，其中所述接触进行10分钟至5小时的时间。
19.权利要求2的方法，其中所述蛋白酶可从达松维尔拟诺卡氏菌、桔橙热子囊菌或地衣芽孢杆菌获得。
全文摘要
一种酿造啤酒的方法，包括将醪液在过滤过程中和/或将麦芽汁在过滤之后但在煮沸麦芽汁之前与热稳定性蛋白酶相接触。
文档编号C12N5/00GK102325876SQ201080008535
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者A.M.弗雷德里克森, H.P.赫尔德-汉森, L.贝克加德, P.R.奥斯特加德, S.克雷兹 申请人:诺维信公司