用于检测脱氧核糖核酸酶活性的方法和制品的制作方法

文档序号:391858阅读:486来源:国知局
专利名称:用于检测脱氧核糖核酸酶活性的方法和制品的制作方法
用于检测脱氧核糖核酸酶活性的方法和制品相关专利申请的交叉引用本申请要求于2009年2月沈日提交的美国临时专利申请No. 61/155,666的权利, 将该临时专利申请以引用方式并入本文。
背景技术
DNA核酸酶(DNA酶)在生物细胞中普遍存在,参与许多细胞功能,包括例如DNA 复制和修复。某些微生物(例如粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、化月农链球菌(Streptococcus pyogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、爺病键刀菌(Fusarium solani)能产生分泌出细胞的DNA酶。DNA核酸酶(DNA酶)被用于许多研究和诊断应用中。已开发出DNA酶活性测定法来监测该酶。在研究应用中,DNA酶测定法常常采用放射性标记的DNA底物,并需要将反应的产物与未反应的底物分离开来,然后才对酶活性进行定量。Tolim和Myers开发了基于 DNA染料配体的差异荧光输出的连续DNA酶测定法(Nuc. Acid Res. 31 :elll,2003)。他们的测定法需要分光荧光计来检测DNA酶活性。DNA核酸酶已被用于检测会将该酶分泌到细胞或细胞集落周围环境中的微生物, 如金黄色葡萄球菌。包含营养物、琼脂和如下指示剂系统的培养基已被用于检测金黄色葡萄球菌,所述指示剂系统包含DNA (通常为高分子量的DNA或大的寡核苷酸)以及100 μ g/ mL甲苯胺蓝0或50μ g/mL甲基绿。培养方法通常需要费力的程序来制备琼脂,而琼脂一旦制备必须在相对较短时间内使用。因此对于用来检测DNA酶活性和检测能产生DNA酶的微生物的稳定制品及简单低廉的方法存在着需求。

发明内容
鉴于当前用来检测DNA酶活性的一般方法需要复杂的技术和/或昂贵的设备,本发明包括可用低成本的成像系统来执行的简单方法。在一些实施例中,本发明方法提供DNA 酶活性的定量或半定量测定。在一些实施例中,本发明方法提供微生物的定量或半定量测定。另外,本发明包括用来检测产DNA酶微生物的简单廉价的制品和方法。本发明人已观察到,在本领域通常使用的甲基绿浓度下,一些产DNA酶微生物的生长会被显著抑制。 本发明人已发现了使用出乎意料地低的浓度的甲基绿来检测产DNA酶微生物的方法。较低浓度的染料使得产DNA酶微生物可更好地生长,和/或使得产DNA酶微生物可从环境胁迫或代谢胁迫中更好地恢复过来,从而使得可更快地检测产DNA酶微生物。另外,通过使用成像系统和通过对用来采集、分析和/或显示图像的光的波长进行偏置,本发明方法提供更简单、更早期和更一致的DNA酶活性检测。
因此,在一个方面,本发明提供检测微生物的方法。该方法可包括提供干组合物和怀疑含有微生物的样品。该干组合物可包含冷水可溶性胶凝剂及包括甲基绿和DNA的DNA 酶指示剂系统。该方法可进一步包括使预定体积的包含样品的水性液体与该干组合物接触以形成水凝胶,将该再水化的水凝胶温育一段时间,然后检测微生物。在一些实施例中,该干组合物可进一步包含营养物、选择剂或指示剂。在一些实施例中,该方法可进一步包括提供营养物、选择剂、指示剂或者前述两者或更多者的任意组合的步骤;其中该包含该样品的水性液体进一步包含该营养物、该选择剂、该指示剂或者前述两者或更多者的任意组合。在一些实施例中,选择剂可包含抗生素。在一些实施例中,抗生素选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、 头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢 (moxlactam)、头孢吡肟(cefipime)、头孢匹罗和苯唑西林。在一些实施例中,该方法可进一步包括提供成像系统和用该成像系统获取该水凝胶的图像。在这些实施例中,检测微生物可包括显示(例如在计算机显示器上)、打印或分析该水凝胶的图像。在一些实施例中,该方法可进一步包括对一种或多种类型的微生物进行计数。在另一个方面,本发明提供检测脱氧核糖核酸酶活性的方法。该方法可包括提供包含DNA酶指示剂系统(其包括甲基绿和DNA)的水凝胶以及怀疑含有脱氧核糖核酸酶活性的离散来源(discrete source)的样品。甲基绿在该水凝胶中可占至少约5 μ g/mL至不超过49 μ g/mL。该方法还可包括使该样品与该水凝胶接触预定的时间段,然后检测脱氧核糖核酸酶活性。在另一个方面,本发明提供检测脱氧核糖核酸酶活性的方法。该方法可包括提供包含DNA酶指示剂系统(其包括甲基绿和DNA)的水凝胶、怀疑含有脱氧核糖核酸酶活性的离散来源的样品以及成像系统。该方法还可包括使该样品与该水凝胶接触预定的时间段。 该方法还可包括用该成像系统获取该水凝胶的图像和检测脱氧核糖核酸酶活性的离散来源,其中检测脱氧核糖核酸酶活性包括显示、打印或分析该水凝胶的图像。在任何上述实施例中,该水凝胶可进一步包括营养物、选择剂、抗生素和/或指示剂。在任何上述实施例中,该方法可进一步包括提供营养物、选择剂、指示剂或者前述两者或更多者的任意组合的步骤;其中接触预定的时间段包括使该样品和该水凝胶与该营养物、该选择剂、该指示剂或者前述两者或更多者的任意组合接触。在任何上述实施例中,选择剂可包含抗生素。在任何上述实施例中,抗生素选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢、头孢吡肟、头孢匹罗和苯唑西林。在任何上述的包括成像系统的实施例中,该成像系统可包括照明源,该获取该水凝胶的图像的步骤可包括照明该水凝胶。在任何上述的包括成像系统的实施例中,照明该水凝胶可包括用有限波段的可见光波长照明该水凝胶。在任何上述的包括成像系统的实施例中,该水凝胶可用选自约625nm至约740nm范围内的波长的可见光波长进行照明。在任何上述的包括成像系统的实施例中,获取该制品的图像可包括使用偏置滤波器来照明该水凝胶或者来采集该图像。在任何上述的包括成像系统的实施例中,分析该图像可包括分析选定波长的该图像。在另一个方面,本发明提供检测制品。该检测制品可包括主体构件,该主体构件包括具有上表面和下表面的自支撑防水基材。包含冷水可溶性胶凝剂和DNA酶指示剂系统的干涂层可均勻地粘附至该主体构件的至少一个表面的一部分上。该DNA酶指示剂系统可包含DNA和甲基绿。在一些实施例中,在与预定体积的液体接触后,该胶凝剂可形成水凝胶, 在该水凝胶中甲基绿的浓度为至少约5 μ g/mL至约100 μ g/mL。在一些实施例中,该涂层还可包含营养培养基、指示剂、选择剂或前述两者或更多者的任意组合。在一些实施例中,该选择剂可对金黄色葡萄球菌的生长具有选择作用。在一些实施例中,该选择剂可包含抗生素。在一些实施例中,抗生素选自头孢噻吩、头孢唑啉、 头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、 头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢、头孢吡肟、头孢匹罗和苯唑西林。在另一个方面,本发明提供试剂盒。该试剂盒可包括检测制品,该检测制品包含干涂层,该干涂层包含冷水可溶性胶凝剂、DNA和甲基绿。在一些实施例中,该检测制品可进一步包含营养物、选择剂、指示剂或前述两者或更多者的任意组合。在一些实施例中,该试剂盒可进一步包含抗生素。词语“优选的”和“优选地”指在某些情况下,可提供某些有益效果的本发明实施例。然而,在相同的情况或其它情况下,其它实施例也可能是优选的。此外,对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其它实施例是不可用的,且并非意图将其它实施例排除在本发明范围之外。本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种(个)或
多种(个)”可互换使用。因此,例如,怀疑含有“一种”微生物的样品可被解释为意指该液体可包含“一种或多种”微生物。术语“和/或”意指所列要素的一个或全部,或所列要素的任何两个或更多个的组
I=I O本文通过端点表述的数值范围包括该范围内的所有数值(比如,1-5包含1、1.5、 2,2.75,3,3. 80、4、5 等)。本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以下具体实施方式
更具体地举例说明了示例性实施例。在本专利申请全文的几处,通过例子列表提供指导,可以不同组合使用这些例子。在每一种情况下,所引用的列表均仅用作一个代表性的组,不应被理解为是排他性列表。


本发明将结合下面所列的附图进行进一步的阐述,其中在几个视图中相同的结构由相同的数字指代。图1是包括隔离物的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。图2是包括网格图案的自支撑基材的一个实施例的顶视图。图3是薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。
图4是包括隔离物的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。图5是根据本发明的具有隔离物的检测制品的一个实施例的顶部透视图(局部分解图)。图6是根据本发明的检测系统的一个实施例的框图。图7a是用绿色发光二极管照明的PETRIFILM板的黑白图像的示图,其中所关注的选定区域由线条A表示。图7b是位于图7a的线条A上的像素的像素强度数据的曲线图。图8a是用红色发光二极管照明的PETRIFILM平板的黑白图像的示图,其中所关注的选定区域由线条A表示。图8b是位于图8a的线条A上的像素的像素强度数据的曲线图。
具体实施例方式在详细说明本发明的任何实施例之前,应当理解,本发明并不将其应用局限于以下描述所提及的或附图所示出的具体构造和组件布置方式。本发明能有其他的实施例,并且能够以多种方式进行实践或实施。另外应该理解的是,本文中所用的用语和术语的目的是为了进行说明,不应被认为是限制性的。本文的“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其变型的使用旨在涵盖随后所列的项及其等同物以及附加项。除非指明或另外限定,否则术语“支承”和“连结”及其变型按广义使用,均涵盖直接和间接的支承和连结。应理解,其他的实施例也可采用,且可在不偏离本发明范围的情况下作出结构变化或逻辑变化。另外,诸如“前部”、“后部”、“顶部”和“底部”等之类的术语仅用于描述相对于彼此的元件,而绝非旨在细述设备的特定取向、指示或暗示必需或必要的设备的取向或者指定在使用中将要如何使用、安装、显示或布置本文描述的本发明。本发明整体涉及用于检测和区分样品中的微生物的方法和制品。具体而言,本发明涉及产DNA酶微生物的检测和区分。在一些实施例中,本发明公开的方法和制品可用于检测能产生被称为耐热核酸酶(TNA酶)的热稳定性DNA酶的微生物。在一些实施例中,产 DNA酶微生物的检测包括对样品中的产DNA酶微生物进行计数。合适的样品可获自或源自多种来源。术语“来源”通常用来指需要测试微生物的食物或非食物。来源可以是固体、液体、 半固体、凝胶状材料及其组合。在一些实施例中,来源可由捕集元件提供,该捕集元件用于例如从所关注的表面或者从空气采集该来源。在一些实施例中,液体组合物可包括捕集元件,该捕集元件可进一步被破碎分开(例如在搅动或溶解过程中)以增强该来源和任何所关注的微生物的回收。所关注的表面可包括多个表面的至少一部分,所述表面包括但不限于墙壁(包括门在内)、地板、天花板、排水沟、冷却系统、导管(例如空气导管)、通风孔、盥洗室座位、把手、门把手、栏杆、床栏杆(例如在医院中)、工作台面、桌面、用餐表面(例如盘子、碟子等)、工作表面、设备表面、服装等,以及它们的组合。该来源的全部或一部分可用于该方法中。当使用该来源的一部分时,这有时可以称作该来源的“样品”。但是,术语“样品”在本文中一般用来指从该来源获取并被引入到培养板装置中以进行微生物检测的那部分材料体积或质量。术语“食物”通常用于指固体、液体(例如,包括但不限于溶液、分散体、乳状液、悬浮液等以及它们的组合)和/或半固体可食用组合物。食物的例子可包括(但不限于)肉类、家禽、蛋、鱼、海鲜、蔬菜、水果、预加工食品(如汤、调味汁、糊)、谷物产品(如面粉、谷类食物、面包)、罐装食物、奶、其他乳制品(如奶酪、酸奶、酸奶油)、脂肪、油类、甜点、调味品、 香料、面食、饮料、水、动物饲料、其他合适的可食用材料以及它们的组合。术语“非食物”通常用于表示不在“食物”定义之内且通常认为不可食用的所关注的源。非食物来源的例子可包括但不限于临床样品、细胞裂解物、全血或其部分(例如血清)、其他体液或分泌物(例如唾液、汗液、皮脂、尿液)、粪便、细胞、组织、器官、活组织切片、植物材料、非饮用水、木材、土壤、沉淀物、药品、化妆品、膳食补充剂(例如人参胶囊)、 医药品、传染体、其他合适的非可吃材料以及它们的组合。“样品获取装置”在本文中以最广义的含义使用,指用来收集液体、半固体或固体样品材料的器具。样品获取装置的非限制性例子包括拭子、擦拭物、海绵、勺子、刮刀、压舌板、过滤器、移液管、移液管头和虹吸管。术语“传染体”通常用于指能够携带和/或传播传染性有机体的无生命物体或基质。传染体可包括(但不限于)布、拖把头、毛巾、海绵、抹布、餐具、硬币、纸币、手机、衣物 (包括鞋子)、门把手、女性用品、尿布等以及它们的部分或它们的组合。术语“微生物”通常用来指任何能够在培养基中生长和繁殖的用显微镜可见的原核或真核生物体,包括但不限于细菌(例如运动型细菌、细菌营养体、革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌)、细菌孢子或内生孢子、真菌(例如酵母、丝状真菌、真菌孢子)中的一者或多者。在一些情况下,特别要关注的微生物是病原性的那些,术语“病原体”用于指任何病原微生物。病原体的例子可包括但不限于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员,或者微球菌科(Micrococcaceae)的成员,或者以下各属葡萄球菌属Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp. )、{段单胞杆菌属(Pseudomonas spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、夕少门氏菌属(Salmonella spp.)、军团菌属(Legionella spp.)、志贺氏菌属 (Shigella spp.)、耳口尔森氏菌属(Yersinia spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、埃希氏菌属(Escherichia spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、李斯特菌属(Listeria spp.)、 弯曲杆菌属(Campylobacter spp·)、不动杆菌属(Acinetobacter spp·)、弧菌属(Vibrio spp·)、梭菌属(Clostridium spp.)和棒杆菌属(Corynebacteria spp·)。病原体的具体例子可包括(但不限于)大肠杆菌,其包括肠出血性大肠杆菌例如血清型0157:H7、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、赌状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、小肠结肠炎耳口尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、艰难梭菌(Clostridium difficile、耐万古霉素肠球菌 (Enterococcus)、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌和阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)。 可能影响微生物生长的环境因素可包括营养物质存在与否、PH值、含水量、氧化-还原电位、抗微生物化合物、温度、大气气体组成和生物结构或屏障。DNA酶指示剂系统
本发明的制品和方法包括DNA酶指示剂系统。该DNA酶指示剂系统包含DNA和甲基绿。任选地,该指示剂系统可进一步包含粘合剂如λ-角叉菜胶和/或缓冲剂。在使用时,将该DNA酶指示剂系统与胶凝剂如琼脂或冷水可溶性胶凝剂(例如瓜耳胶、黄原胶、刺槐豆胶以及它们的组合)进行混合。在一些实施例中,将与胶凝剂混合的该DNA酶指示剂系统如本文所述涂覆在基材上。甲基绿与DNA分子形成稳定的复合物。当甲基绿复合的DNA解聚(例如通过酶促水解)时,甲基绿变成无色的。Smith等人(1969. Appl. Microbiol. ,18 991)证明产DNA酶细菌可在含有DNA和甲基绿的微生物培养基中检测到。该指示剂系统中的DNA通常容易商购获得(例如,鲑精DNA可获自 Sigma-Aldrich, St. Louis,M0),且可以是任何具有足够分子量的DNA,使得它能够与甲基绿形成绿色的复合物。甲基绿的盐形式(例如甲基绿氯化锌盐)可用于该指示剂系统,且可获自例如 Sigma-Aldrich (St. Louis)。培养装置本发明包括用于DNA酶活性的检测的制品。该检测制品包括用于生长和检测微生物的培养装置。本发明的培养装置包括例如薄膜培养板装置。薄膜培养板装置通常比传统的琼脂平皿更加紧凑,且通常含有干燥的可再水化的培养基以支持某些微生物的生长。薄膜培养板装置的非限制性例子包括美国专利No. 4,565,783、No. 5,089,413和 No. 5,681,712中公开的带涂层基材装置;将所述专利中每一个都以引用方式全文并入本文。图1示出根据本发明的薄膜培养装置的一个实施例。培养装置110包括主体构件, 该主体构件包括具有上下表面(分别为11 和112b)的自支撑防水基材112。基材112 可为相对坚硬的膜(例如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯),该膜不会吸水或者以别的方式被水影响。基材112可为透明的或不透明的,这取决于是否想要透过该基材观察细菌菌落。为有利于细菌菌落的计数,基材212可在其上印刷有网格图案(例如方格),如图2中所示。参见图1,基材112可在其上表面11 上涂覆有一层粘合剂114,该粘合剂的作用是将干胶凝剂、DNA酶指示剂系统和/或营养物以均勻单层的形式保持以便容易水化。粘合剂114应以优选小于粉末化胶凝剂和/或营养物的粒子直径的厚度涂覆到基材112上。目的是施加足够的粘合剂以将粒子粘附到基材,但又不太多而造成粒子完全嵌在粘合剂中。 冷水可溶性粉末的均勻单层116是所期望的,其表面积充分暴露以便水化。图1中还示出了可任选的在覆盖片122上的粘合剂层114'和冷水可溶性粉末层116'。当用水溶液(例如该样品和/或含水助悬介质,如水或缓冲液)进行水化时,胶凝剂形成水凝胶。在一些实施例中,粘合剂114可包含水基粘合剂组合物。优选地,水基粘合剂层 114当被含水测试样品湿润时充分透明,以使得能够观察微生物菌落。该水基粘合剂组合物可掺入一种或多种亲水剂,包括营养物、选择剂、指示剂(例如DNA酶指示剂系统、酶底物、 染料)或者它们的组合。本领域技术人员参考本说明书,根据所要培养和/或选择性检测 (例如染色)或抑制的具体微生物,将显而易见地知道水基粘合剂组合物中使用的具体营养物和/或选择剂。示例性的一类有用的选择剂包括这样的染料,其可被生长中的微生物代谢或者以其他方式与生长中的微生物反应,由此造成微生物菌落被着色或者发荧光,以易于由技术人员或由自动读数器检测和/或定量。这种染料的非限制性例子包括氯化三苯基四唑、对甲苯基四唑红、四唑紫、藜芦基四唑蓝、中性红、酚红、氯酚红和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二钠盐。但是应认识到,取决于所要鉴定的具体生物体,也可使用其他合适的染料。本领域普通技术人员会认识到,任何根据本发明使用的指示剂、染料、选择剂、酶底物或营养物不应实质上抑制DNA酶活性,也不应实质上干扰本文所述的DNA酶指示剂系统的观察和成像。可采用缓冲试剂如碳酸钠来提供显示中性pH的培养基,并可采用“Cab-0-Sil M-5”作为加工助剂,如美国专利No. 4,565,783中所描述,将该专利以引用方式全文并入本文。当然,可根据所要培养的微生物的类型,对用于粉末116的具体涂层混合物(例如营养物、指示剂和/或胶凝剂)加以调整。设想到,本发明的制品可包括区分性指示剂。本文所用的“区分性指示剂”指添加到培养基中的会指示某些微生物的存在而不会指示其他微生物的存在的试剂。区分性指示剂的非限制性例子包括染料(例如着色剂、PH指示剂、氧化还原指示剂)、酶底物(例如磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核酸酶、脂肪酶等的发色底物或荧光底物)以及当被某些微生物代谢时会产生可检测的反应(例如与菌落相关的PH变化)的特定营养物(例如发酵性碳水化合物、氨基酸)。在一些实施例中,可将一种或多种区分性指示剂在涂覆到基材上的水基组合物中添加至薄膜培养装置。在一些实施例中,可将一种或多种区分性指示剂添加至液体样品,然后液体样品加到培养装置。在一些实施例中,可在培养装置进行水化后,将一种或多种区分性指示剂加至培养装置。涉及到使用加至水化后的培养装置的区分性指示剂的方法的一个例子是其中将用于检测耐热核酸酶的制品加到温育后的培养装置的方法,如美国专利 No. 6,022,682中所述,将该专利以引用方式全文并入本文。在本发明范围内还设想到,粉末116可任选包括为执行某些用于微生物鉴定的生化测试所必需的试剂。这种在特定类型的微生物存在下发生颜色变化的试剂(例如酶底物)可包括在粉末116或粘合剂114中。在本发明的另一个实施例中,粉末116可包含这样的涂层,其包括胶凝剂和营养物的混合物、选择剂和/或指示剂,其已被溶解或悬浮于溶液中,涂覆并干燥到基材112上。 在这个实施例中,涂层实质上是无水的(即涂层一旦被允许与周围环境平衡,其水分含量不超过大约脱水涂层的水分含量)。如图1所示,主体构件可包括施加到基材112的上表面的隔离物118,该隔离物 118包括在中部切穿以暴露基材112上的粉末116的圆形孔120。孔120的壁提供预定大小和形状的槽以限定水化后的培养基。隔离物118应足够厚以形成所需体积的槽,例如1、 2或3毫升。聚乙烯闭孔泡沫塑料是隔离物118的优选材料,但也可使用任何疏水性(非湿润性)、对微生物惰性且能够承受灭菌的材料。在一些实施例中(未显示),隔离物118可包括多个孔20(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个孔),每个孔可接种上不同的液体样品。隔离物118可包括相对较厚的设计,如美国专利No. 5,681,712中所述的那些设计,将该专利以引用方式全文并入本文。较厚的带孔隔离物118的一个目的是对布置在隔离物118的孔120中的膜(例如微孔过滤膜)(未显示)进行定位和保护。较厚的隔离物 118的另一个目的是为了减少或防止覆盖片122与生长中的微生物集落的接触(即提供生长表面和覆盖片122之间的“顶部空间”,这还可使得对生长中的微生物菌落的通气增加)。隔离物118的厚度应足以围住在对培养装置接种时加到该装置的液体体积。取决于膜(当使用时)的厚度,隔离物可为至少约0. 5mm厚、约Imm厚、约1.5mm厚和约2mm厚。图3示出了薄膜培养装置310的另一个实施例。该实施例包括基材312、粘合剂 314、冷水可溶性粉末316和覆盖片322,如图1中所述。DNA酶指示剂系统可被包括在冷水可溶性粉末316中。与图1的培养装置110相反,图3的装置310不包括用于在接种过程中限定该样品的隔离物。可将模板例如加重环(未显示)暂时施加到覆盖片322的外面, 该模板在闭合后用以在冷水可溶性粉末316形成凝胶的时候将样品限定到特定区域。在一些实施例中,装置310可接种上多份(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20份)不同的液体样品,使用适当的隔离物和模板来将各样品限定到培养装置310的粉末316的不同部分。当用水溶液(例如该样品和/或含水助悬介质,如水或缓冲液)进行水化时,包含胶凝剂的冷水可溶性粉末形成水凝胶。图4示出了根据本发明的薄膜培养装置的另一个实施例410。培养装置410包括主体构件411,该主体构件包括具有上下表面41 和412b的自支撑基材412。基材412在其上表面41 上涂覆有一层粘合剂414。包含一种或多种胶凝剂的冷水可溶性粉末416以薄的相对均勻的层粘附到粘合剂414。一旦接种上含水测试样品(未显示),该层冷水可溶性粉末416 (其可包括DNA酶指示剂系统)快速水化形成复水的培养基(未显示),而该培养基继而能够长出在液体接种物中或在膜(如测试样品微生物过滤器(未显示))的表面上存在的微生物。隔离物418部分地覆盖基材412和覆盖粉末416的表面,具有孔420。另外,薄膜培养装置410任选包括覆盖片422,以覆盖在加入含水测试样品后形成的复水培养基。图4还示出了膜似6和生长在其上的微生物菌落428。在图示的实施例中,膜似6是微孔膜,液体样品已被滤过该膜以使样品中的任何细菌(如果存在的话)截留在膜上。合适的微孔膜不会实质上干扰DNA酶活性或者干扰DNA酶活性与DNA酶指示剂系统之间的相互作用。另外,合适的微孔膜当与水凝胶接触时是实质上透明的。如美国专利No. 5,232,838中所述,有可能在本发明的装置中使用透气膜层,前提条件是该透气膜不会实质上干扰DNA酶活性或者对DNA酶活性的观察和成像。透气层可 “夹”在基材和冷水可溶性粉末之间,在透气膜层的两面上均有粘合剂涂层(未显示)。在一个实施例中,可根据例如美国专利No. 4,565,783中所述的方法,如下制备薄膜培养板装置产生液体涂覆混合物,将该液体涂覆混合物涂覆到基材上,干燥该经涂覆的基材并任选地附接覆盖片。这个实施例的示例性装置在图4中示出。图4示出了适合与本发明的培养基一起使用的薄膜培养装置410的一个实施例。 制备该装置的方法在美国专利No. 4,565,783中描述,将该专利以引用方式全文并入本文。薄膜培养装置410包括具有自支撑防水基材412的主体构件。基材412优选为由不会吸水的防水材料(如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯)制成的相对刚性的材料。其他合适的防水材料包括含有防水聚乙烯涂层的基材如纸张。基材412的上表面用液体组合物涂覆, 然后进行干燥以在基材412上提供干涂层417。干涂层417包含本文所述的冷水可溶性胶凝剂,且还可包括营养物、选择剂、指示剂或前述两者或更多者的任意组合。用于产生干涂层417的液体组合物可容易地如下进行干燥将液体组合物在约220 T的烘箱中加热,直到组合物中基本上所有水分都被蒸发掉。然而,如果在水分已蒸发后加热组合物,则组合物的某些组分(例如营养物、指示剂)可能开始降解。在基材412上可涂覆一层粘合剂(未显示)。该粘合剂可起到将干涂层417保持到基材412的作用。粘合剂当水化时应充分透明,以使得可查看在经涂覆的基材412的表面上生长的细菌菌落。该粘合剂还应以这样的厚度涂覆在基材412上,该厚度让该基材均勻地涂覆有干涂层417,而又不完全使涂层嵌在粘合剂中。在泡沫中具有圆形开口的泡沫隔离物418被粘附到基材412的涂覆有培养基的表面。覆盖基材412的周边的该泡沫隔离物限定出样品要接种的区域,并起到防止样品从基材泄漏的作用。在一个替代实施例中,装置可不包括容纳样品的泡沫层。在这个装置中,样品的量只通过培养基的各组分被容纳在基材上。覆盖片422附接到泡沫隔离物418的上表面的边缘。覆盖片422优选由透明的薄膜或片材制成,以便于计数基材上存在的细菌菌落。另外,覆盖片422优选对细菌和水蒸汽具有不透性,以避免各组分受污染和变质的风险。用作覆盖片422的优选材料是双轴向拉伸聚丙烯。任选地,覆盖片422可涂覆有一层粘合剂,该粘合剂可涂覆上包含胶凝剂、营养物、选择剂和指示剂(例如DNA酶指示剂系统)或前述两者或更多者的任意组合的干燥组合物(例如粉末)(未显示)。在使用时,将预定量的接种物(通常为约1毫升的液体接种物)加到图4所示的装置,加入方式是将覆盖片向后拉,然后将含水测试样品或水分配到干涂层417上。接种物可任选包含营养物、选择剂、指示剂或前述两者或更多者的任意组合。然后再将覆盖片422 放回涂层417上,接种物均勻地散布在泡沫隔离物418的圆形开口内。用于此操作的简便工具是加重的圆形模板。随着接种物接触涂层417并分散在该涂层上,涂层发生水化而形成凝胶。凝胶中存在的营养物可支持微生物的生长。接着将接种了的装置温育预定的时间, 然后可透过透明的覆盖片422计数生长在基材上的细菌菌落的数目。用于形成装置410的干涂层417的涂层混合物可包含DNA酶指示剂系统,且任选包含培养基、指示试剂、选择剂或者前述两者或更多者的任意组合。优选的涂层混合物,当进行涂覆、干燥和用适当体积的样品再水化时,包含营养培养基和DNA酶指示剂系统,如表 1所示。^l.示钢卜件的营吝养基的組成
权利要求
1.一种检测微生物的方法,包括提供干组合物和怀疑含有微生物的样品;其中所述干组合物包含冷水可溶性胶凝剂和DNA酶指示剂系统,该DNA酶指示剂系统包括甲基绿和DNA ;使预定体积的包含所述样品的水性液体与所述干组合物接触以形成水凝胶; 将所述水凝胶温育一段时间;以及检测微生物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中在与所述预定体积的水性液体接触后,在所述水凝胶中甲基绿的浓度为约5 μ g/mL至约100 μ g/mL。
3.根据权利要求1所述的方法,其中在与所述预定体积的水性液体接触后,在所述水凝胶中甲基绿的浓度为约5 μ g/mL至约60 μ g/mL。
4.根据权利要求1所述的方法,其中在与所述预定体积的水性液体接触后,在所述水凝胶中甲基绿的浓度为约5 μ g/mL至约20 μ g/mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述干组合物还包含营养物、选择剂或指示剂。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其还包括提供营养物、选择剂、指示剂或者前述两者或更多者的任意组合的步骤;其中所述包含所述样品的水性液体还包含所述营养物、所述选择剂、所述指示剂或者前述两者或更多者的任意组合。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其中所述选择剂包含抗生素。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述抗生素选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、 头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、 头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢、头孢吡肟、头孢匹罗和苯唑西林。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,还包括 提供成像系统;以及用所述成像系统获取所述水凝胶的图像;其中检测微生物包括显示、打印或分析所述水凝胶的图像。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,还包括对一种或多种类型的微生物进行计数。
11.一种检测脱氧核糖核酸酶活性的方法,包括 提供包含DNA酶指示剂系统的水凝胶,所述DNA酶指示剂系统包括甲基绿和DNA,其中在所述水凝胶中甲基绿的浓度为至少约5 μ g/mL且小于49 μ g/mL ;和怀疑含有脱氧核糖核酸酶活性的离散来源的样品; 使所述样品与所述水凝胶接触预定的时间段;以及检测脱氧核糖核酸酶活性的离散来源。
12.—种检测脱氧核糖核酸酶活性的方法,包括 提供包含DNA酶指示剂系统的水凝胶,所述DNA酶指示剂系统包括甲基绿和DNA ;怀疑含有脱氧核糖核酸酶活性的离散来源的样品;和成像系统;使所述样品与所述水凝胶接触预定的时间段;用所述成像系统获取所述水凝胶的图像;以及检测脱氧核糖核酸酶活性的离散来源,其中检测脱氧核糖核酸酶活性包括显示、打印或分析所述水凝胶的图像。
13.根据权利要求12所述的方法,其中在所述水凝胶中甲基绿的浓度为至少约5μ g/ mL 至约 100μ g/mL。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法,其中所述脱氧核糖核酸酶活性的离散来源是微生物。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法,其中所述水凝胶还包含营养物、选择剂、抗生素或指示剂。
16.根据权利要求11-14中任一项所述的方法,还包括提供营养物、选择剂、指示剂或者前述两者或更多者的任意组合的步骤;其中接触预定的时间段包括使所述样品和所述水凝胶与所述营养物、所述选择剂、所述指示剂或者前述两者或更多者的任意组合接触。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法,其中所述选择剂包含抗生素。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述抗生素选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢、头孢吡肟、头孢匹罗和苯唑西林。
19.根据权利要求9至18中任一项所述的方法,其中所述成像系统包括照明源,且其中获取所述水凝胶的图像包括对所述水凝胶进行照明。
20.根据权利要求19所述的方法,其中对所述水凝胶进行照明包括用有限波段的可见光波长对所述水凝胶进行照明。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述有限波段的可见光波长选自约625nm至约 740nm范围内的波长。
22.根据权利要求20所述的方法,其中所述有限波段的可见光波长选自约630nm至约 650nm范围内的波长。
23.根据权利要求19所述的方法,其中对所述水凝胶进行照明包括使用偏置滤波器来照明所述水凝胶或者来采集所述水凝胶的图像。
24.根据权利要求9至23中任一项所述的方法,还包括提供图像分析系统的步骤;其中分析所述图像包括用所述图像分析系统分析所述图像。
25.根据权利要求M所述的方法,其中分析所述图像包括分析所述图像的选定波长。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述选定波长在约625nm至约740nm的范围内选择。
27.根据权利要求25所述的方法,其中所述选定波长在约630nm至约650nm的范围内选择。
28.一种检测制品,包括一种主体构件,包括具有上表面和下表面的自支撑防水基材;其中包含冷水可溶性胶凝剂和指示剂系统的干涂层均勻地粘附至所述主体构件的至少一个表面的一部分上,其中所述指示剂系统包含DNA和甲基绿。
29.根据权利要求观所述的制品,其中在与预定体积的液体接触后,所述胶凝剂形成水凝胶,且在所述水凝胶中甲基绿的浓度为约5 μ g/mL至约100 μ g/mL。
30.根据权利要求四所述的制品,其中在与预定体积的液体接触后,所述胶凝剂形成水凝胶,且在所述水凝胶中甲基绿的浓度为约5 μ g/mL至约60 μ g/mL。
31.根据权利要求四所述的制品,其中在与预定体积的液体接触后,所述胶凝剂形成水凝胶,且在所述水凝胶中甲基绿的浓度为约5 μ g/mL至约20 μ g/mL。
32.根据权利要求观-31中任一项所述的制品,其中所述涂层还包含营养培养基、指示剂、选择剂或者前述两者或更多者的任意组合。
33.根据权利要求32所述的制品,其中所述选择剂对金黄色葡萄球菌的生长具有选择作用。
34.根据权利要求33所述的制品,其中所述选择剂选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢、头孢吡肟、头孢匹罗和苯唑西林。
35.一种试剂盒,包括具有干涂层的检测制品,所述干涂层包含冷水可溶性胶凝剂、DNA 和甲基绿。
36.根据权利要求35所述的试剂盒,其中所述检测制品还包含营养物、选择剂、指示剂或者前述两者或更多者的任意组合。
37.根据权利要求35或36所述的试剂盒,还包含抗生素。
全文摘要
本发明提供可用于检测DNA酶活性的离散来源的制品和方法。可检测出产DNA酶微生物。所述装置还可包括用于区分微生物群体或种类的选择剂和/或指示剂。使用方法包括检测或计数产DNA酶微生物。
文档编号C12Q1/14GK102333884SQ201080009588
公开日2012年1月25日 申请日期2010年2月22日 优先权日2009年2月26日
发明者帕特里克·A·玛奇, 米歇勒·L·罗索尔, 迈克尔·E·休斯 申请人:3M创新有限公司
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