细胞的遗传学分析的制作方法

专利名称：细胞的遗传学分析的制作方法
细胞的遗传学分析背景在细胞的异质混合物中特定细胞的细胞核酸如mRNA或基因组DNA的分析通常是如下进行的通过原位分析若干个分析物，通常是1-10个；或通过从背景群中机械分离期望的细胞，然后收集并分析所分离的细胞的内容物。直接在未纯化的混合物中分析细胞的原位分析方法包括原位杂交(ISH)。ISH通常用于在细胞或组织切片中检测特定mRNA或DNA序列，并且其受一次实验中可以测量的分析物数目的限制。通常，在一个实验中进行1个或2个分析物的I SHaoung WS 3rd Methods Enzymo 1. (1989) 168 :702_10，其整体通过引用并入本文)。原位分析方法的特征均在于直接分析细胞样品背景中的细胞内容物，而没有细胞纯化并且没有收集或储存用于后续分析的细胞内容物。原位分析方法通常是经由人工的显微观察进行的并且不易于高通量扩大化或自动化。在收集细胞内容物之前纯化细胞的机械分离方法包括基于抗体的磁珠细胞纯化(例如，MACS 细胞分离，Miltenyi Biotec, Germany)、流式细胞分选、激光显微切割或机械显微切割。一旦细胞被分离，便可进行高度复杂的分析，诸如完整的基因表达概况分析。这些多种细胞分离方法的每一种具有其自身的益处和局限。例如，磁珠纯化和流式分选需要相对大量的细胞以便正确工作，很少达到分离的细胞的绝对纯度并且选择参数一般局限于几个表面标志物。激光显微切割可以分离单个细胞或许多细胞，但是可以加工的样品数目受限，并且一般适用于具有特定需要的组织样本(Luo等人，NatMed. (1999)5(1) 117-22，其整体通过引用并入本文)。机械显微切割在可以加工的细胞数目和样品数目两方面都受限。对于所有这些分离方法来说，由于许多感兴趣的细胞在加工期间丢失的产率问题而使分析细胞、尤其是稀有细胞成为挑战。不同细胞类型的复杂混合物中特定细胞的核酸分析的一个应用是循环肿瘤细胞和播散肿瘤细胞的遗传学分析。这些细胞由原发性肿瘤脱落并存在于血液循环或淋巴循环中或位于各种组织中。播散肿瘤细胞被认为是转移的原因。鉴于大多数因癌症疾病所引起的死亡是由于转移而不是原发性肿瘤所致，循环和播散肿瘤细胞成为具有强烈诊断兴趣的主题。例如，Veridex LLC (Warren, NJ)开发了一项FDA批准的诊断测试，该测试列举了循环乳腺肿瘤细胞的数目作为预后工具。然而，除了检测循环肿瘤细胞的存在的诊断价值之外，还高度期望的是能够将这些细胞从分子上分类。这种信息可以揭示更好的预后信息并指导治疗选择。例如，是赫塞汀治疗靶的Her-2受体仅在乳腺癌患者的一个亚群体中过表达，剩余的乳腺癌患者群体对赫塞汀治疗无反应。这个实例强调了对个体化的癌症治疗的需要。循环肿瘤细胞和播散肿瘤细胞的分子概况分析在鉴定合适标志物的发现期和在执行所鉴定的标志物的诊断期均提出重大的技术挑战。这种挑战在于期望的细胞的贫乏，贫乏至1/100，000乃至1/10，000, 000，这需要格外有效的方法来纯化。目前，循环肿瘤细胞的遗传学分析或分子概况分析主要在通过抗体介导的分离富集的肿瘤细胞上进行。整体通过引用并入本文的Smirnov等人，Cancer Res. (2005)65(12) 4993-7报道了通过从人血免疫磁性分离而富集的循环肿瘤细胞的基因表达概况分析。所报道的研究的局限是富集的肿瘤细胞纯度不够，该富集的肿瘤细胞数目不如污染的白细胞多。只有在获得至少100个肿瘤细胞并且背景为小于1，000-10，000个白细胞时才能产生有用的基因表达数据。这些局限将患者的选择限制在具有> 100个/7.5ml血液的高循环肿瘤细胞计数的那些患者中，这是一个严重的限制；因为研究显示大多数癌症患者在 7. 5ml血液中具有小于10个循环肿瘤细胞(Allard等人，Clin Cancer Res. (2004) 10(20) 6897-904，其整体通过引用并入本文)。此外，白细胞的污染将分析局限于被肿瘤细胞高度表达的基因。最后，使用针对特定抗原如EpCAM的抗体正向选择循环肿瘤细胞具有固有的弱点。已知的是循环肿瘤细胞在暴露的表面抗原的量方面显示出显著的异质性，这导致捕获这些细胞的可变效率(Allard等人，Clin Cancer Res. (2004) 10(20) :6897-904)，继而威胁到测定的灵敏性。使用抗体选择来分离循环肿瘤细胞的不同系统是CTC芯片(Nagrath等人， Nature. (2007)450(7173) :1235_9，其整体通过引用并入本文)，该CTC芯片由具有通过深离子刻蚀(deep ion etching)制造的78，000个微柱(micropost)的流动室组成。微柱被 EpCAM的抗体覆盖。在血液被抽吸通过室时，循环肿瘤细胞保留在微柱上。通过RT-PCR对捕获的细胞进行少量基因的分析。发表的数据显示了分离的循环肿瘤细胞的不同纯度，6个癌症类型的平均纯度为56% (Nagrath等人，Nature. (2007)450(7173) :1235_9，其整体通过引用并入本文)。同样，样品不纯将威胁基因表达谱的品质。而且，此方法易受肿瘤细胞所展示的EpCAM量的变化而引起的灵敏度可变性的影响。概述本文所述的系统、方法和装置各自可以具有几个方面，没有一个方面单独地负责期望的属性。不限制由随后的权利要求所表达的本公开内容的范围，现在将简要地讨论本公开内容较显著的特征。在考虑了本讨论之后，尤其是阅读了标题为“详述”的部分之后， 本领域的技术人员将理解这种技术的特征如何提供优势，包括相对快速和精确地分析细胞群中的细胞，包括稀有细胞。本文所公开的一些实施方案涉及对异质细胞群中存在的细胞进行特定遗传学分析的方法。在一些实施方案中，鉴定感兴趣的细胞，通过用足以引起靶细胞裂解的能量辐照所鉴定的细胞而使所鉴定的细胞释放它们的细胞内容物到周围培养基中，对含有释放的核酸的培养基取样并分析存在于取样的培养基中的核酸。在一些实施方案中，可以通过下列方法达成细胞的裂解降低孵育培养基的摩尔渗透压浓度以使细胞通过渗透作用吸收水分并随后通过添加促溶剂，如使蛋白变性的硫氰酸胍；或通过添加表面活性剂，如破坏细胞膜并使蛋白变性的十二烷基磺酸钠而破裂。注意尽管本文的许多实例涉及的是核酸分析，但任何细胞内容物均可以通过这些方法来分析，包括蛋白、代谢产物等。一些实施方案涉及从异质细胞群中的稀有细胞中分离核酸的方法。例如，方法可以包括(a)将异质细胞群分配到多个室(bin)中，使得含有稀有细胞的室中稀有细胞的浓度增加至少X倍，其中X是室的数目除以异质细胞群中稀有细胞的数目；(b)对每个室的基本上整个区域快速成像以确定哪些室含有稀有细胞；(C)添加试剂到含有稀有细胞的室中以使细胞裂解并从稀有细胞中释放核酸到培养基；以及(d)只从含有已被裂解的稀有细胞的室中收集含有释放的核酸的培养基，从而从稀有细胞收集核酸。在一些方面，方法可以包括例如(a)将异质细胞群分配到多个室中，使得含有稀有细胞的室中稀有细胞的浓度增加至少X倍，其中X是室的数目除以异质细胞群中稀有细胞的数目；(b)对每个室的基本上整个区域快速成像以确定哪些室含有稀有细胞；(C)通过参考各室的成像来定位含有稀有细胞的室中稀有细胞的位置；(d)将聚焦能量束导向含有稀有细胞的室中稀有细胞的位置，以引起稀有细胞的特异性裂解而没有其他细胞的显著裂解，并且从稀有细胞释放核酸到培养基中；以及(e)从含有已被裂解的稀有细胞的室中收集含有释放的核酸的培养基，从而从稀有细胞的核酸收集达到稀有细胞核酸与非稀有细胞核酸相比最多Y倍的富集，其中Y是所述室中未裂解的非稀有细胞的数目。在一些方面，X可以是例如，大约 10、30、100、300、1，000,3, 000,10, 000,30, 000 和 100，000。室可以是例如多孔板的孔。又一些实施方案涉及包括下列步骤的方法例如(a)将异质细胞群放在易于成像的表面上；(b)对表面的基本上整个区域快速成像；(c)通过参考表面的成像来定位稀有细胞在表面上的位置；(d)将聚焦的能量束导向稀有细胞的位置以引起稀有细胞的特异性裂解而没有其他细胞的显著裂解，并且从稀有细胞释放核酸到培养基；以及(e)收集含有从已被裂解的稀有细胞释放的核酸的培养基，从而从稀有细胞的核酸收集达到稀有细胞核酸与非稀有细胞核酸相比最多Y倍的富集，其中Y是在表面上未裂解的非稀有细胞的数目。在一些方面，Y 可以是例如，大约 10、30、100、300、1，000,3, 000、10，000,30, 000 和 100，000。方法还可以包括使异质细胞群与选择性结合稀有细胞的剂接触，其中所述剂产生作为光特性的可检测的信号。而且，方法还可以包括添加RNA酶抑制剂。一些实施方案涉及从异质细胞群中的稀有细胞中分离核酸的方法。方法可以包括例如，(a)将异质细胞群分配到多个室中，使得含有稀有细胞的室中稀有细胞的浓度增加至少X倍，其中X是室的数目除以异质细胞群中稀有细胞的数目；(b)对每个室的基本上整个区域成像以确定哪些室含有稀有细胞；(c)添加试剂到含有稀有细胞的室中以使细胞裂解并从稀有细胞中释放核酸到培养基中；以及(d)只从含有已被裂解的稀有细胞的室中收集含有释放的核酸的培养基，从而从稀有细胞收集核酸。而且，一些实施方案涉及从异质细胞群中的稀有细胞分离核酸的方法，该方法可以包括例如(a)将异质细胞群分配到多个室中，使得含有稀有细胞的室中稀有细胞的浓度增加至少X倍，其中X是室的数目除以异质细胞群中稀有细胞的数目；(b)对每个室的基本上整个区域成像以确定哪些室含有稀有细胞；(c)定位含有稀有细胞的室中稀有细胞的位置；(d)将能量束导向含有稀有细胞的室中稀有细胞的位置，以引起稀有细胞的特异性裂解而没有其他细胞的显著裂解，并且从稀有细胞释放核酸到培养基中；以及(e)从含有已被裂解的稀有细胞的室中收集含有释放的核酸的培养基，从而从稀有细胞收集核酸。在一些方面，所述定位可以例如通过参考各室的成像来进行。在一些方面，收集可导致从稀有细胞的核酸收集达到稀有细胞核酸与非稀有细胞核酸相比最多Y倍的富集，其中Y是所述室中未裂解的非稀有细胞的数目。在一些方面，Y可以是例如，大约10、30、100、300、1，000、 3，000、10，000,30, 000 或 100，000。在一些实施方案中，方法还可以包括例如，使异质细胞群与选择性结合稀有细胞的剂接触，其中所述剂产生作为光特性的可检测的信号。并且，在一些实施方案中，方法还可以包括例如，在步骤(a)和(e)之间的任一阶段添加RNA酶抑制剂。在一些方面，X可以是例如，大约 10、30、100、300、1，000,3, 000、10，000,30, 000 或 100，000。在一些方面，室可以是例如，多孔板的孔。一些实施方案涉及从异质细胞群中的稀有细胞中分离核酸的方法。方法可以包括例如(a)将异质细胞群放在易于成像的表面上；(b)对表面的基本上整个区域成像； (c)通过参考表面的成像来定位稀有细胞在表面上的位置；(d)将聚焦的能量束导向稀有细胞的位置，以引起稀有细胞的特异性裂解而没有其他细胞的显著裂解，并且从稀有细胞释放核酸到培养基中；以及(e)收集含有从已被裂解的稀有细胞释放的核酸的培养基，从而从稀有细胞收集核酸。在一些实施方案中，上面和本文其他地方所述的方法还可以包括例如用纳米粒子标记来标记细胞。而且，可以使用纳米粒子标记来改善能量束介导的细胞裂解的效率。又一些实施方案涉及分析细胞内容物的方法。方法可以包括例如，提供包含感兴趣的细胞的细胞群用于分析；定位所述细胞群中的至少一种感兴趣的细胞；将能量束导向所述至少一种感兴趣的细胞的位置，其中所述能量束具有足以至少部分裂解所述至少一种感兴趣的细胞的能量，所述至少部分裂解足以从细胞释放内容物；以及分析从感兴趣的细胞释放的内容物。在一些方面，感兴趣的细胞可以是例如，但不限于有核血细胞、原代细胞、细胞系、肿瘤细胞、患病的细胞、感染的细胞、重组细胞、转染的细胞、工程化的细胞或突变的细胞。在一些方面，细胞群可以是例如但不限于来自下列的细胞群血液、淋巴、脑脊液、骨髓、手术样本、活组织检查、细胞培养物、细胞库、工程化的细胞群以及类似物。在一些方面，方法还可以包括例如使细胞群与对至少一种感兴趣的细胞特异性的标记接触。标记可以包括例如，一种或多种多克隆或单克隆抗体、抗体片段、凝集素、配体、 蛋白、肽、脂质、氨基酸、核酸、修饰的核酸如锁定核酸(LNA)、合成的小分子或用于标记的任何其他部分。不限于此，在一些方面，标记可以包括例如下列的一种或多种辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、Cy3或Cy5、异硫氰酸荧光素、藻别蓝蛋白 (phycoallocyanin)、藻红蛋白、罗丹明、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6_羧基罗丹明(R6G)、德克萨斯红、ALEXAFluor染料、BODIPY荧光团、俄勒R绿(Oregon Green)、香豆素和香豆素衍生物或TAMRA。在一些方面，标记还可以包括纳米粒子。在一些方面，纳米粒子可改善能量束介导的细胞裂解的效率。在一些方面，定位可以包括例如将细胞群成像。而且，定位可以包括例如，基于标记的存在定位至少一种感兴趣的细胞。在一些方面，方法还可包括提供RNA酶抑制剂。在一些方面，细胞群可以例如被分配到多于一个的室中。在一些方面，方法还可以包括例如添加Fc受体阻断试剂。在一些方面，至少一种感兴趣的细胞可以例如以小于约1/10,000的浓度存在于细胞群中。在一些方面，至少一种感兴趣的细胞可以例如以约1/100，000个细胞与约 1/100, 000, 000个细胞之间的浓度存在于细胞群中。在一些方面，方法还可以包括例如收集至少所述释放的细胞内容物。例如，细胞内容物可以是但不限于核酸、多肽、蛋白、脂质、细胞器等。在一些方面，分析可以包括例如下列的一种或多种PCR、RT-PCR、定量RT-PCR、微阵列分析、核酸酶保护分析、Quantigene分析、Taqman SNP测定、PCR-限制性片段长度多态性、RNA 测序、DNA 测序、下一代测序(next generation sequencing)、单分子实时(SMRT) DNA测序技术或Nanostring技术。
一些实施方案涉及被构造成执行上面和本文其他地方所述的一种或多种方法及本文所述的方法的一个或多个单独步骤或特征的装置、系统和仪器。上文是概述，因此必定含有简化、概括和细节省略；因此，本领域的技术人员将了解该概述只是示例性的，绝不旨在限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其他方面、特征和益处将在本文所述的教导中变得明显。提供概述是为了引入简化形式的概念选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。此概述不旨在鉴定所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助。附图简述通过下面的说明和所附的权利要求书与附图的结合，本公开内容的上述和其他特征将变得更加完全明显。应理解这些附图仅描述了根据本公开内容的几个实施方案，因此不应被理解为限制其范围，将通过使用附图以另外的特征和细节来描述公开内容。

图1是描绘在不同的处理后组织培养孔中RNA酶活性的图。图2是描绘不同的培养基配方对来自裂解的细胞的RNA产率的影响的图。图3是在人PBMC的背景中免疫染色的SW480细胞的图像。箭头指示SW480细胞。图4是显示在来自单个裂解的SW480细胞的Ki_ras基因的密码子12中存在突变的序列轨迹(sequence trace)。图5是描绘金纳米粒子标记对激光介导的裂解效率的影响的图。图6是显示16个单肿瘤细胞样品中的5种选择的基因的检测的表。详述在详述、附图和权利要求书中描述的示例性实施方案不意在限制。本文的教导可以大量不同的方式应用，包括例如权利要求所定义和涵盖的方式。应明显的是本文的方面可以多种多样的形式具体化，并且本文所公开的任何具体结构、功能或结构和功能仅仅是代表性的。基于本文的教导，本领域的技术人员应了解本文所公开的方面可以不依赖于任何其他方面来实现，并且两个或更多个这些方面可以多种方式组合。例如，本领域的技术人员可以使用任何合理数目或组合的本文所列的方面来实现系统或仪器或实践方法。此外， 可以使用本文所列的一个或多个方面之外的其他结构、官能性或结构和官能性来实现这种系统或仪器或实践这种方法。可以在不背离本文所呈现的主题的精神或范围的条件下利用其他实施方案并进行其他改变。应容易地理解，如本文所大致描述的和附图所例示的本公开内容的各方面可以按多种不同的构造来排列、取代、组合并设计，所有这些都明确地涵盖在本公开内容中并且构成本公开内容的一部分。应理解所公开的实施方案不限于下面所述的实施例，因为其他实施方案可以落入公开内容和权利要求书中。本文所公开的一些实施方案涉及对异质细胞群中存在的细胞进行特定遗传学分析的方法。在一些实施方案中，鉴定感兴趣的细胞，通过用足以引起靶细胞裂解的能量辐照鉴定的细胞而使所鉴定的细胞释放它们的细胞内容物到周围培养基中，对含有释放的核酸的培养基取样并分析取样的培养基中的物质，例如存在于取样的培养基中的核酸。在一些实施方案中，“稀有细胞”在给定的细胞群中以贫乏至1/1，000至1/100，000, 000的程度存在。在一些优选的实施方案中，稀有细胞在给定的细胞群中以贫乏至1/100，000至 1/1，000，000的程度存在。在其他优选的实施方案中，稀有细胞在给定的细胞群中以贫乏至 1/1，000，000 至 1/10，000，000 的程度存在。
用于分析稀有细胞的方法的独特特性在于待分析的细胞不需要在分析之前被纯化或以任何方式进行机械处理。此外，方法可以是极为特异性的。分析的特异性取决于待裂解的细胞的辐照的精确度。例如，使用激光可以靶向并特异性地裂解在混合细胞群中的单个细胞，使得细胞分析能够具有极高的特异性。此外，感兴趣的细胞的特异性鉴定可仅用于检测目的，而不是例如用于机械分离。这种属性可以容许在细胞标记的强度方面具有较大的容限，因为不需要考虑机械限制。而且，不同标记的组合可以容易地用于本技术。最后， 功能标记如分泌产物的量度(Hanania 等人，Biotech，and Bioengineering, 91 (7)，2005，其整体通过引用并入本文)可以在一些实施方案中用于循环肿瘤细胞鉴定。分泌产物可以被捕获在细胞表面上或在待分析的细胞附近，并且随后例如使用标记的抗体检测，如整体通过引用并入本文的美国专利第7，425，426号中所描述的。如上面所提及的，方法可用于分析来自细胞的物质，例如来自在其他细胞的混合物中存在的感兴趣的细胞的核酸。核酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物或它们的混合物。RNA是核糖核苷酸的聚合物，通常50-10，000个核苷酸长，并且DNA是脱氧核糖核苷酸的聚合物，通常50-220，000, 000个核苷酸长。不限于此，可以用这种技术从裂解的细胞获得的核酸包括信使RNA(mRNA)；微RNA ；tRNA ；rRNA ；病毒RNA ；由插入的构建体表达的 RNA,如短发夹RNA (shRNA)；或转染到细胞中的RNA，如siRNA ；基因组DNA、线粒体DNA和病毒 DNA。获得的核酸可以通过多种方式分析，包括但不限于PCR、RT-PCR、使用Taqman 探针或Sybr Green化学法的定量RT-PCR、使用例如来自kquenom(San Diego、CA) 的Mass Array系统的定量RT-PCR、微阵列分析、核酸酶保护分析、Quantigene分析 (Panomi cs)、Taqman SNP测定、PCR-限制性片段长度多态性、RNA测序、DNA测序、使用 Illumina基因组分析仪或ABI Solid仪器或Roche 454仪器或来自Helicos Biosciences Corporation (Cambridge, ΜΑ)的 Helicope 仪器的下一代测序、单分子实时(SMRT) DNA 测序技术(Pacific Biosciences, Menlo Park, CA)禾口 Nanostring 技术(Nanostring Technologies, Seattle, WA)。细胞可以具有任何来源，包括原核细胞和真核细胞。非限制性实例包括哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、非人灵长类细胞和人细胞。细胞可以从例如血液、淋巴、脑脊液、骨髓、 手术样本、组织活检或类似物获得。待分析的细胞还可以从例如细胞培养物、细胞文库和工程化细胞群获得。在本文所公开的方法中使用之前，可以通过例如，密度离心、免疫磁性富集、通过固定的抗体捕获的富集、荧光激活细胞分选(FACS)、膜过滤、无关细胞的凝集以及无关细胞的化学裂解来纯化细胞。细胞可以包括例如，有核血细胞、原代细胞、细胞系、肿瘤细胞、患病细胞、感染的细胞、转染的细胞、工程化细胞、突变的细胞以及类似细胞。从靶细胞释放细胞内容物可以通过用足以部分地引起细胞裂解的辐照剂量辐照靶细胞来达成。优选的辐照源是具有足以引起细胞裂解的波长和能量的激光。在一些实施方案中，可用于本公开内容的方法的激光是传递具有等于选自下列的组或在下列的组的任何范围之间的波长的辐照的激光:100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、 1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800 和 3000nm。在一些实施方案中，例如波长可以在约355nm与约^40nm之间，优选355nm和1064nm之间，最优选355和532nm之间。在一些实施方案中，可用于本公开内容的方法的激光能够传递具有选自下列的组的能量密度的辐照剂量小于、大于、等于或介于下列数值的任何数值0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6、 0. 7,0. 8,0. 9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、30、40、50、60、70、80、90 和 100J/cm2。在一些实施方案中，可用于本公开内容的方法的激光能够递送具有选自下列的组的辐照度的辐照剂量小于、大于、等于或介于107、108、IO9UOltl和IO11WZcm2的任何数值。如本文所用，术语辐照度是指单位面积的能量，通常以瓦特/平方厘米为单位表示。在一些实施方案中，可以使用 LEAP 细胞加工工作站(LEAP Cell Processing Workstation(Cyntellect Inc.， San Diego,CA))来鉴定和辐照细胞。而且，可以使用整体通过引用并入本文的美国专利第 6，514，722号中所公开的装置、系统和方法。可以使用激光来引起稀有细胞的特异性裂解而没有其他细胞的显著裂解。在一些实施方案中，没有其他细胞的显著裂解是指细胞群中小于10%的非稀有细胞被激光裂解。 在一些优选的实施方案中，没有其他细胞的显著裂解是指细胞群中小于9% j^j^j^、 5^^4^^3%或2%的非稀有细胞被激光裂解。在更优选的实施方案中，没有其他细胞的显著裂解是指细胞群中小于1 %的非稀有细胞被激光裂解。在甚至更优选的实施方案中，没有其他细胞的显著裂解是指比稀有细胞更少的非稀有细胞被激光裂解。在一些实施方案中，本文所述的方法将在每分钟对如下面积的生物样本进行成像至少等于或介于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和 20 平方厘米中的任何数值。在一些实施方案中，本文所述的方法每分钟对包含如下数目的生物样本细胞的细胞群进行至少5万、10万、25万、50万、1百万、2千万、4百万或8百万细胞。RNA酶抑制剂是抑制任何或所有已知的RNA酶的活性的蛋白、蛋白片段、肽或小分子,所述RNA酶包括RNA酶A、RNA酶B、RNA酶C、RNA酶Tl、RNA酶H、RNA酶P、RNA酶I和 RNA酶III。已知的但非限制性的RNA酶抑制剂的一些实例包括AcriptGuard(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI)、Superase-in (Ambion, Austin, TX)、Stop RNA 酶抑制剂(5PRIME Inc, Gaithersburg, MD)、ANTI-RNA 酶(Ambion)、RNA 酶抑制剂(克隆的) (Ambion)、RNaseOUT (Invitrogen, Carlsbad, CA)、核糖核酸酶 Inhib III (Invitrogen)、 RNasin (Promega, Madison, WI)、保护剂 RNA 酶抑制剂(Protector RNase Inhibitor, Roche Applied Science, Indianapolis, IN)、胎盘 RNA 酶抑制剂(USB，Cleveland, OH)和 ProtectRNA (Sigma, St Louis，M0)。在一些实施方案中，可以将RNA酶抑制剂以如下的浓度添加到细胞的位置，例如，含有待分析的细胞的孔足以显著抑制孔中的RNA酶活性 1-100 %，优选20-100 %，最优选50-100 %的浓度。在一些实施方案中，感兴趣的细胞的鉴定可以使用特异性结合感兴趣的细胞但是不结合混合物中不被分析的其他细胞的剂来完成。标记剂可以是任何合适的剂，包括例如多克隆抗体或单克隆抗体或其片段，如Fab、F (ab' )2、Fd和Fv。例如，标记剂可以是卵磷脂。标记剂可以使用能够产生可检测信号的任何部分来标记，例如在适当光下可检测的信号，如荧光、化学发光、荧光寿命、荧光偏振、衍射以及类似信号。标记剂还可以使用酶标记物标记，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶以及类似酶。在一些方面，荧光团是优选的。合适的荧光团可以包括例如优选的Cy3或Cy5、异硫氰酸荧光素、藻别蓝蛋白、优选的藻红蛋白、罗丹明、6-羧基-X-罗丹明(R0X)、6-羧基罗丹明(R6G)、 德克萨斯红、ALEXAFluor染料、BODIPY荧光团、俄勒R绿、香豆素和香豆素衍生物、TAMRA以及类似荧光团。
在一些实施方案中，还可以使用Fc受体阻断试剂。例如，阻断试剂可以防止对靶细胞或标记细胞的细胞介导的杀伤。在用针对肿瘤细胞上的表面抗原的一抗对肿瘤细胞和原代人PBMC的混合物染色之后观察到对加标肿瘤细胞的细胞介导的杀伤。这种作用是明显的，因为清楚地观察到PBMC如单核细胞或巨噬细胞对肿瘤细胞的粘附。这种粘附可能是由所用的抗体介导的，即便这种抗体是小鼠单克隆抗体。在一些方面，使用Fc受体阻断试剂的添加来防止这种可能不期望的作用。Fc受体阻断试剂阻断抗体的Fc-区域与细胞上存在的Fc受体的相互作用。Fc受体阻断试剂可以是例如在受体结合方面与用于细胞标记的抗体竞争的免疫球蛋白。此外，还可以使用结合并阻断Fc受体的特异性抗体。抑制抗体的Fc区域与Fc受体结合的小的合成分子也可以用作Fc受体阻断试剂。合适的阻断试剂包括例如，来自Miltenyi Biotec (Auburn, CA)的FcR阻断试剂。用于表达概况分析的微阵列以本领域的那些技术人员已知的几种不同形式出现。 非限制性实例在美国专利第5，445，934,7, 378，236和6，326，489中给出，这些专利通过整体引用将其所有的方法、材料和教导并入本文。大部分微阵列使用空间排列的DNA段来通过杂交测量溶液中相应的cDNA或cRNA(统称为“靶”)的量。微阵列上的点所产生的信号与样品中特定序列，通常是细胞基因的表达相关。通常，一个微阵列上测定几百乃至几千种不同的cDNA或cRNA的表达。微阵列还可以用于估计基因组DNA中的基因的拷贝数变化(Pinkel等人，1998，其整体通过引用并入本文)、单核苷酸多态性的存在(I^stinen等人，2000，其整体通过引用并入本文)和基因组DNA甲基化状态(Yan等人，2001，其整体通过引用并入本文)。新颖的微阵列包括基于珠子的阵列，如Veracode系统(Illumina，San Diego, CA) ο Nanostring(Seattle, WA)上市了一种“反向”随机排列的微阵列，其中DNA靶在平坦表面上被固定和分析。任何这种微阵列均可以并入本文所公开的方法、系统和设备。在一些实施方案中，可以将纳米粒子并入方法、材料、设备和系统中来例如帮助裂解细胞。纳米粒子可用于促进激光介导的细胞裂解。纳米粒子是尺寸介于Ι-lOOOnm，优选 2-500nm,最优选3-lOOnm范围的粒子。纳米粒子可以由多种材料制成，包括贵金属，如金和银；和半导体材料，如磷化铟和硫化镉。可以经由本领域的技术人员已知的不同方法制造纳米粒子。实例包括经由受控的金溶液沉淀形成的金纳米粒子(Turkevich等人，1951，其整体通过引用并入本文)。可以包被纳米粒子来稳定在悬浮液中的粒子或降低纳米粒子的细胞毒性。例如，可以用牛血清白蛋白来包被金纳米粒子以稳定悬浮液。可以将纳米粒子连接在分子上以促进它们与细胞的缔合。与纳米粒子连接的合适的分子的非限制性实例包括抗体、抗体片段、蛋白、肽、卵磷脂、脂质、氨基酸、核酸、修饰的核酸如锁定核酸(LNA)和合成的小分子。用于连接所述分子与纳米粒子的一些非限制性方法是本领域的技术人员已知的。连接可以是例如共价的或可逆的，包括静电相互作用或疏水相互作用。在一些实施方案中，可以在激光辐照靶细胞之前的过程中的任何点将纳米粒子添加到细胞中。例如，可以在初始的细胞染色步骤期间或在细胞被分散到孔中之后添加纳米粒子。设计了筛选纳米粒子的合适的表面修饰的方法。用终浓度为1 μ M的钙黄绿素AM 加载多种细胞类型并将所述多种细胞类型接种到多孔板中。将一系列浓度范围内具有不同表面修饰的纳米粒子添加到不同的孔中。在LEAP仪器上用激光脉冲辐照细胞，并且在激光处理后以钙黄绿素AM阳性细胞的减少来测量细胞裂解。用于增加激光介导的细胞裂解的不同纳米粒子涂层的效能通过由纳米粒子浓度对裂解效率剂量反应曲线获取的EC50值来测量。 实施例实施例1来自人血的循环肿瘤细胞的分析在一个实施方案中，收集来自患者的人血并使用任何合适的方法耗竭红细胞，包括本领域的技术人员已知的方法，例如通过使用含氯化铵的缓冲液裂解红细胞。将红细胞耗竭的血液样品与标记的抗体混合，所述标记的抗体特异性鉴定循环肿瘤细胞并且可通过光特性如荧光检测。藻红蛋白结合的抗-EpCAM抗体是这种抗体的一个实例。这种抗体可以从例如多种市售来源获得。还可以使用未标记的一抗和针对一抗的标记的二抗的混合物。实例包括小鼠抗-EpCAM—抗和藻红蛋白标记的山羊抗小鼠二抗。洗涤后，可以将细胞分配到多孔板中，例如以10-100，000个细胞/孔的密度分配到384孔板中。可以通过例如对板成像鉴定肿瘤细胞来鉴定肿瘤细胞。如果期望，可以将RNA酶抑制剂添加到含有一个或多个肿瘤细胞的孔中，然后裂解肿瘤细胞，例如通过用足以基本上裂解靶细胞的激光脉冲辐照它们。可以抽吸培养基。可以通过任何合适的方法分析收集的RNA，包括例如通过 RT-PCR进行选定数目的基因分析、通过微阵列基因表达概况分析、通过下一代测序或任何其他合适的方法。在一些实施方案中，所产生的数据可用于例如，癌症筛选、癌症诊断、癌症预后、治疗监测、治疗选择；或在发现期鉴定用于癌症筛选、癌症诊断、治疗监测和治疗选择的合适标志物。实施例2慢病毒转染的细胞的分析在另一实施方案中，将100至100，000, 000种不同的DNA构建体如shRNA、 shRNAmir (Thermo Fisher Scientific,Huntsville,AL)或 cDNA 的慢病毒文库转染到细胞群中。一段时间之后，可以使用光特性形式的功能读数来鉴定含有感染的DNA构建体的具有期望特性的细胞，所述光特性形式的功能读数如荧光报道蛋白如绿色荧光蛋白的水平改变。期望特性可以包括例如蛋白的表达或分泌、碳水化合物或脂质的表达、信号传导途径的激活或失活、蛋白的细胞内分布、蛋白、碳水化合物或脂质的结合特性。如果期望，可以将 RNA酶抑制剂添加到含有待分析的细胞的孔中。可以通过例如用足以裂解靶细胞的激光脉冲辐照来裂解鉴定的细胞。可以例如抽吸并收集培养基。可以通过例如PCR、PCR和测序、 RT-PCR、RT-PCR和测序、微阵列分析、下一代测序或任何其他合适的方法来鉴定裂解的细胞中所存在的DNA构建体。实施例3表达蛋白变体的细胞的分析在另一实施方案中，通过例如成像来分析表达感兴趣的蛋白变体的DNA文库的细胞群以鉴定表达具有期望特性的蛋白变体的细胞。期望的特性可以包括例如蛋白表达的水平；蛋白的细胞内分布和细胞外分布；蛋白的折叠；蛋白的热稳定性；用诸如细胞因子、 趋化因子、白细胞介素、生长因子、神经递质和脂质的外源剂刺激细胞后蛋白定位的改变。 如果要分析DNA，则可以通过用足以裂解靶细胞的激光脉冲辐照鉴定的细胞而使其裂解。可以抽吸培养基并可以通过例如PCR、或PCR和后续测序鉴定裂解的细胞中所含有的DNA构建体。如果要分析RNA，可以以足以显著地抑制孔中的RNA酶活性的浓度将RNA酶抑制剂添加到孔中，并且可以通过例如用足以裂解靶细胞的激光脉冲辐照鉴定的细胞来使其裂解。可以抽吸培养基并可以通过例如RT-PCR、或RT-PCR和后续测序以及类似方法来鉴定裂解的细胞中所含有的核酸构建体。实施例4组织培养细胞的分析在另一实施方案中，将从组织分离的原代细胞培养在细胞培养板中。可以将配体添加到含有细胞的细胞培养孔中，所述配体可以是例如，肽、蛋白、蛋白片段、小分子、脂质、大麻素、氨烷基吲哚、类花生酸、天然提取物、分馏的组织提取物以及类似物。 可以通过例如光特性的改变来鉴定响应于配体添加的细胞，光特性的改变如通过诸如 FLU04 (Invitrogen)的Ca2+响应性染料测量的胞内Ca2+的升高或减少；细胞形状改变；细胞表达的报道基因的信号改变；或诸如碘化丙啶的可检测染料向细胞内的流入。可以响应于配体添加将RNA酶抑制剂以显著抑制孔中RNA酶活性的浓度添加到含有细胞的孔中。可以通过用足以裂解靶细胞的激光脉冲辐照鉴定的细胞而使其裂解。可以通过例如抽吸收集培养基，并且可以使用下列方法对释放到培养基中的RNA进行概况分析例如，RT-PCR、定量 RT-PCR、微阵列分析、下一代测序、Nanostring 技术、Quantigene 测定(Panomics，Fremont, CA)、Quantiplex测定(Panomics)或任何其他合适的方法。来自响应细胞和非响应细胞的表达数据的比较可以容许例如负责对添加的配体的响应性的mRNA和相应蛋白的鉴定。此外，来自响应细胞的表达数据可以鉴定响应细胞的类型。实施例5“分配” fe术分析来i KMmmmmmm,在另一实施方案中，收集来自患者的人血、耗竭红细胞并与特异性鉴定循环肿瘤细胞并可通过诸如荧光的光特性检测的标记的抗体混合。藻红蛋白结合的抗-EpCAM抗体是这种抗体的一个实例。洗涤后，可以将细胞接种到多孔板中，例如以每孔100-10,000的密度分配到384孔板中。对多孔板成像以鉴定肿瘤细胞。在一些方面，可以利用分配。分配是指将样品分割为子样品，并将子样品放入室中或独立的分割的封闭区域，如多孔板的孔。在一些实施方案中，该方法对每个室的基本上整个区域成像以确定哪些室含有稀有细胞。如本文所用，“每个室的基本上整个区域”可以包括例如大于、等于或介于下列数值的任何数值或范围的室区域65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%,99. 6%,99. 7%,99. 8%,99. 9%和 100%。由于将血液样品分散到大量孔中的分配效应，稀有肿瘤细胞的浓度将在其所存在的稀有孔中增加。如果每个孔中的血细胞数为5，000，则单个肿瘤细胞的浓度在其所存在的孔中将为1/5,000 并且在其所不存在的孔中为0。在可以发现肿瘤细胞的某些孔中肿瘤细胞频率的显著增加可以因此增加遗传学分析的灵敏度。使用例如RLT缓冲液Oiiagen)裂解含有一个或多个肿瘤细胞的孔。通过如下方法提取和分析RNA和/或DNA 例如PCR、PCR和测序、RT-PCR、 RT-PCR和测序、定量RT-PCR、微阵列分析、下一代测序、Nanostring技术、Quantigene测定、 Quantiplex测定或任何其他合适的方法。实施例6RNA酶抑制剂和RNA载体对从裂解细胞回收RNA的作用.
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这个实施例描述了通过试剂配方优化从裂解的HeLa细胞回收RNA。单个细胞可以含有IO-IOOpg的总RNA。在细胞培养板孔中的单个细胞的裂解产生了如下的相关问题释放的少量的RNA可能会由于吸附到表面上或通过被存在于培养基中或由裂解的细胞释放的RNA酶降解而丢失。如下进行RNA酶活性测试用具有10%胎牛血清(Invitrogen)的100 μ 1完全培养基(MEM-Invitrogen)将 384-孔 C-lect 板(Cyntellect, San Diego, CA)在 37 °C 下在细胞培养箱中孵育过夜。孵育后，使用手工多头移液器(manual multipipettor)用 Hank' s平衡盐溶液(HBSS-Invitrogen)洗涤孔3次。根据厂家的建议混合RNAse Alert 试剂(Ambion)并将其添加到组织培养孔中。在37°C下孵育30分钟后，在Genios酶标仪 (Tecan)上对样品读数。结果显示在图1中。测试条件是+/-HBSS洗涤和+/-终浓度为1 单位 / μ 1 的 RNA 酶抑制剂(“RNA 酶 hh，，)(ScriptGuard -Epicentre Biotechnologies) 的添加。结果显示a)完全培养基含有与RNAse Alert试剂盒中的阳性对照程度一样的大量RNA酶活性，为50X 10_6单位的RNA酶A/孔；b) RNA酶抑制剂的添加显著降低RNA酶活性的量；c)用HBSS洗涤孔三次确实降低了但没消除孔中的RNA酶活性；以及d)用HBSS洗涤孔和添加RNA酶抑制剂导致了最低量的RNA酶活性。由此实验可以得出如下结论RNA酶抑制剂的添加可以促进从孔中裂解的细胞回收RNA。将大约200个HeLa细胞/孔接种到384-孔C-Iect板(Cyntellect)上。接种后当天，用钙黄绿素AM(Invitrogen)对细胞染色并用HBSS洗涤孔。通过用具有10. 4 μ J能量和直径为17. 2μπι的激光点的532nm激光脉冲使用LEAP仪器(Cyntellect)靶向20个HeLa 细胞而裂解它们。收集一半培养基(HBSS)，使用foieasy微柱(Qiagen，Valencia，CA)从中提取RNA。通过定量作为总RNA的指数的GAPDH mRNA来估计RNA产量。GAPDH mRNA使用绝对定量的 Sybr 绿 RT-PCR 测定在 ABI 7500 实时 PCR 仪器(Applied Biosystems,Foster City, CA)上定量。使用高容量cDNA合成试剂盒(Applied Biosystems)进行反转录并使用 Maxima SYBR 绿 qPCR 混合物(Fermentas，Glen Burnie，MD)进行 Sybr 绿 PCR。以多种组合来测试下列培养基配方+/-1 X RNA酶抑制剂(RNA酶hh，ScriptGuard, IU/μ 1)、+/-RNA 载体(PI，IOOng/孔的聚肌苷酸，SIGMA)、+/_2XRNA酶抑制剂。作为阳性对照，通过添加含有IOOng聚肌苷酸的RLT(I neaSy试剂盒，Qiagen)裂解孔中的所有细胞，在foieasy微柱上纯化RNA并如上通过RT-PCR分析。将GAPDHmRNA的量针对阳性对照标准化并表示为预期量的百分比。结果显示在图2中。数据显示a)裂解HBSS中的20个细胞导致了 4.0%的 GAPDH mRNA产率；b)只添加聚肌苷酸未显著改善RNA产率；c) RNA酶抑制剂的添加导致RNA 产率的巨大改善，为53. 3% ；并且d)增加RNA酶抑制剂的量未改善RNA产率。结论是添加 RNA酶抑制剂显著改善自裂解细胞的RNA产率。实施例7人血细胞中稀有肿瘤细胞的突变分析为了测试分析相关模型中稀有细胞的遗传内容物的能力，将来自人结肠直肠细胞系的细胞SW480混入人外周血单核细胞(PBMC)。已知SW480细胞具有Ki_ras基因的突变 (McCoy ^Α “ Characterization of a human colon/lung carcinoma oncogene (Α π 癌/肺癌癌基因的表征).“Nature. 1983302(5903) :79-81 ；其整体通过引用并入本文)； Ki-ras基因的突变在结肠直肠癌、肺癌和胰腺癌中是常见的(Bos等人，Nature (1987) 327 293-297 ；Slebos 等人，N. Engl. J. Med. (1990)323 :561-565 ；以及 Almoguera 等人， Cell (1988) 53力49_554，它们的每一个整体通过引用并入本文)。为检测突变，通过RT-PCR 扩增含有突变的Ki-ras mRNA的片段并对PCR产物测序(Eton Bioscience, San Diego, CA)。突变是Ki-ras基因的密码子12中的G —T转变。为鉴定SW480细胞，使用藻红素结合的抗EpCAM抗体(eBioscience, San Diego, CA)。EpCAM代表上皮细胞粘附分子。它由上皮细胞特异性表达并常用于鉴定和分离循环癌细胞。将SW480细胞混合在具有新鲜 PBMC(AllCells, Hayward, CA)的悬浮液中并用浓度为1 μ M的钙黄绿素AM(Invitrogen) 和浓度为1.25ι^/μ1的EpCAM抗体染色。在HBSS中洗涤3次后，将细胞以每孔产生1600 个PBMC和平均一半的SW480细胞的密度分散到384-孔C-Iect板(Cyntellect)中。将板在LEAP仪器(Cyntellect)上成像。鉴定含有单个SW480细胞的孔并添加RNA酶抑制剂 (ScriptGuard-Epicentre Biotechnologies)和聚肌酐酸(sigma)的混合物直至在 20 μ 1 的总体积中终浓度分别为1单位/ μ 1和IOOng/孔。通过用具有6. 9 μ J的能量和Mym 的点直径的532nm激光脉冲辐照单个SW480细胞而使它们裂解。裂解后，从孔中抽吸出一半的培养基并与来自toeasy试剂盒^jiagen)中的RLT混合。使用厂家的方案用foieasy 微柱纯化RNA。使用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)和钛PCR试剂盒 (Clontech, Mountain View, CA)通过 RT-PCR 扩增跨越 Ki-ras mRNA 中的突变的片段。使用第一引物对内部的PCR引物利用巢式PCR第二轮扩增PCR扩增子。可以使用该步骤是因为在SW480细胞中Ki-ras丰度相对较低。使用PCRquick试剂盒^liagen)纯化巢式PCR产物并通过测序(Eton Bioscience)进行分析。图3显示在大约1，600个PBMC的背景中的单个SW480细胞(箭头)。图像最初是两种颜色，SW480细胞是绿色，且PBMC是红色。裂解 SW480细胞并通过RT-PCR分析并测序。图4显示由分析在1，600个PBMC的背景中通过激光介导的裂解而裂解的单个SW480细胞而获取的序列轨迹中突变的存在。碱基85在突变基因型中是‘A’，且在正常基因型中是‘C’。序列轨迹由PCR扩增子的反义链产生，并且因此‘A’对应于mRNA中的‘U’且‘C’对应于Ki-ras mRNA中的‘G’。由于384-孔板共含有 1, 600 X 384个PBMC = 614，400个PBMC，检测1，600个PBMC的孔中一个SW480细胞的突变的能力就转化为分析每614，400个PBMC中一个SW480细胞的能力。实施例8使用金纳米粒子标记的激光介导的裂解的改善对于在激光辐照后发生的细胞裂解，激光脉冲必须产生机械破坏细胞的应力或冲击波。产生这种应力或冲击波所需的激光能量取决于细胞、细胞所接触的培养基或底物的激光吸收。纳米粒子介导的光解已经被描述为清除来自患者样品的肿瘤细胞的治疗方法 (Letfullin等人，2006 ；其整体通过引用并入本文)。纳米粒子用作产生靶肿瘤细胞和非靶健康细胞之间的光对比的手段，使得主要是靶细胞被破坏(Oraevsky等人，2008 ；其整体通过引用并入本文)。此实施例中使用纳米粒子结合的抗体以通过降低诱导细胞裂解所需的激光功率来促进激光介导的靶细胞裂解。激光功率的降低减少了无意中引起邻近的非靶细胞裂解的风险，从而改善了靶细胞分析的特异性。为测试使用纳米粒子标记进行激光介导的细胞裂解的改善，用浓度为1. 25ng/yl 的EpCAM抗体(eBioscience)和浓度为1 μ M的钙黄绿素AM(Invitrogen)标记悬浮液中的 SW480细胞。在HBSS中洗涤3次后，一组细胞用浓度为1. 15ng/y 1的金标记的二抗(山羊抗小鼠30nm-Ted Pella，Redding, CA)染色，并且一组用5ng/μ 1的藻红蛋白标记的二抗(eBioscience)染色。在HBSS中洗涤3次后，将在HBSS中的染色的细胞接种到384-孔 C-Iect板(Cyntellect)中。通过在LEAP激光处理之前和之后定量钙黄绿素AM-阳性细胞的数目来测量细胞裂解效率。图5显示在不同的染色和激光功率条件下激光介导的细胞裂解效率的图。裂解效率表达为杀伤的靶细胞的百分比。使用纳米粒子标记，在两种激光功率设置下裂解效率都为93%。在不存在纳米粒子标记(图5中的藻红蛋白组)的条件下， 裂解效率在2. 9 μ J为10%并且在6. 9 μ J为66%。因此，纳米粒子标记改善了激光介导的细胞裂解效率并降低了有效的细胞裂解所需要的激光功率。如果纳米粒子标记足够强和特异，则通过用适当量的能量辐照整个细胞群而不是将聚焦能量导向特定靶细胞即可实现靶细胞的特异性裂解。有许多光动力治疗的实例，其中将感光剂有时是金纳米粒子添加到细胞中，以便只有靶细胞吸收致死量的能量而邻近的未标记的非革巴细胞不被伤害。实例可见于Combinatorial treatment of photothermal therapy using gold nanoshells with conventional photodynamic therapy to improve treatment efficacy =An in vitro study(使用金纳米壳的光热治疗与常规光动力治疗的联合治疗改善治疗效率体外研究)，James Chen Yong Kah，等人，Lasers in Surgery and Medicine，第 40 卷，第 584—589 页，2008 禾口 Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles(使用金纳米粒子的等离子光热治疗)，Xiaohua Huang，等人，Lasers in Medical Science，第23卷，第217-2 页，2007 ；它们整体通过引用并入本文。在此实施方案中，没有成像、定位靶细胞或将激光束特异性导向稀有靶细胞的步骤的更简单的装置和方法可用于实践该技术。实施例9使用纳米粒子促进的激光介导的裂解进行的循环肿瘤细胞模型中单个肿瘤细胞的基因表汰分析使用纳米粒子标记和随后的激光介导的裂解来检测混入人PBMC中的单个肿瘤细胞的有限组的基因的表达。将人乳腺癌细胞MCF-7混入人PBMC并用浓度均为0. 625ng/μ 1 的EpCAM抗体(eBioscience)和藻红蛋白标记的EpCAM抗体(eBioscience)的混合物染色。 每Iml细胞悬浮液中添加100 μ 1 FcR阻断试剂(Miltenyi，Auburn, CA)。在具有2% FBS 的HBSS中洗涤后，用金标记的二抗(山羊抗小鼠，30nm，Ted Pella)对细胞染色并用具有 2% FBS的HBSS再洗涤一次。最后，将细胞重悬在含有100 μ 1/mlFcR阻断试剂和0. 27ng/ μ 1 RNA酶AO^ermentas)的HBSS中以抑制在染色过程中从裂解的细胞释放的RNA。将细胞混合物以2000个细胞/孔接种到384-孔C-Iect板中。将板在LEAP上成像。在检测到 MCF-7 细胞的孔中，添加 kriptGuard RNA 酶抑制剂(Epicentre biotechnologies)至终浓度为3单位/ μ 1和IOOng/孔的聚肌苷酸(Sigma)。通过用2. 9 μ J激光脉冲在LEAP仪器上辐照裂解单个MCF-7细胞。抽吸总的孔体积的一半，并添加至TargetAmp 1. 0反应物中并根据厂家的建议(Epicentre Biotechnologies)处理以扩增mRNA。使用高容量cDNA合成试剂盒(Applied Biosystems)将扩增的RNA反转录成cDNA。然后使用Maxima STOR绿 qPCR 混合物(Fermentas)在 ABI 7500 实时 PCR 仪器(Applied Biosystems)上对 5 种选择的基因进行定量PCR。待分析的基因是基于它们与癌症的相关性和它们在MCF-7细胞中的表达而从文献中选择的。基因为(基因符号)CCDC6、KRT19、MUCl、EpCAM和TFF-I。分析了来自单个裂解的MCF-7细胞的16个样品，并且分析了其中MCF-7细胞存在于孔中但未裂解的6个阴性对照。如果基因具有<36的交叉循环数，则认为基因被表达。对于被分类为阳性的细胞，必须表达5种基因中的至少3种。在16个单个肿瘤细胞样品中，15个被分类为阳性(图6)，对应于94%的成功分类率。在6个阴性样品中，没有一个被分类为阳性。参考文献下列参考文献整体通过引用并入本文Allard 等人，“Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases (肿瘤细胞在所有主要癌但不是健康受治疗者或具有非恶性疾病的患者的外周血中循环)· “ Clin Cancer Res. (2004) 10(20) :6897-904.Almoguera等人，“Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras genes.(大多数的人外分泌胰腺癌含有突变的c-K_ras基因).〃 Cell (1988)53 :549-554Bos 等人，‘‘Prevalence of ras gene mutations in human colon cancers ( A 结肠癌中ras基因突变的流行率)“Nature (1987) 327 :293-297Hanania等人，“Automated in situ measurement of cell-specific antibody secretion and laser-mediated purification for rapid cloning of highly-secreting pr0dUcers(细胞特异性抗体分泌的自动原位测量和用于快速克隆高分泌性生产者的激光介导的纯化)· “ Biotechnol Bioeng. (2005)30 ；91 (7) :872-6.Letfullin 等人’ “Laser-induced explosion of gold nanoparticles potential role for nanophotothermolysis of cancer(激光诱导的金纳米粒子的爆发 癌症的纳米光热解的可能作用).“Nanomed. (2006) 1 (4) :473-80.Luo等人，“Gene expression profiles of laser-captured adjacent neuronal subtypes (激光捕获的邻近神经元亚型的基因表达谱)"Nat Med. (1999)5(1) :117-22McCoy 等人’ “Characterization of a human colon/lung carcinoma oncogene (人结肠 / 肺癌癌基因的表征)."Nature. 1983302(5903) :79-81Nagrath ^Α " Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology (通过微芯片技术分离癌症患者中稀有的循环肿瘤细胞).〃 Nature. (2007)450(7173) :1235-9.Pastinen 等人，“A system for specific, high-throughput genotyping by allele-specific primer extension on microarrays (用于通过在微阵歹Ij上白勺等位基因特异性引物延伸而特异性高通量地基因分型的系统).“Genome Res. (2000) 10(7) 1031-42.Pinkel 入，‘‘High resolution analysi s of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays ( 使用与阵例的比较基因 组杂交高分辨率地分析DNA拷贝数变异).‘‘Nat Genet. (1998)20(2) :207-11Slebos 等人， “K_ras oncogene activation as a prognostic marker in adenocarcinoma of the lung(K_ras癌基因激活是肺腺癌中的预后标志物)〃 N.Engl. J. Med. (1990)323 :561-565.
Smirnov 等人，“Global gene expression profiling of circulating tumor cells (循环肿瘤细胞的全基因表达概况分析)“，Cancer Res. (2005)65(12) :4993-7.Turkevich等人，“A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold(胶体金合成中的成核和生长过程的研究)",Discuss. Faraday. Soc. 1951,11,55-75.Yan 等人，“Dissecting complex epigenetic alterations in breast cancer using CpG island microarrays (使用CpG岛微阵列剖析乳腺癌中的复杂的后生改变)· 〃 Cancer Res. (2001) 1 ；61 (23) :8375-80.Young WS 3rd. “ In situ hybridization histochemical detection of neuropeptide mRNA using DNA and RNA probes (使用 DNA 和 RNA 探针的神经肽 mRNA 的原位杂交组织化学检测)〃 Methods Enzymo 1. (1989) 168 :702-10.美国专利第5，445，934 号；7，378，236 号；6，326，489 号；7，425，426 号；6，514，722 号;
美国专利公布第US2007795857 号对于本文基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域的技术人员可以在适于内容和/或申请的情况下将复数转化为单数和/或将单数转化为复数。为了清晰的目的将各种单数/复数的互换清楚地列在本文中。本领域的技术人员应了解，通常，本文且尤其是所附的权利要求书(例如，所附的权利要求书的主体)中所用的术语一般意为“开放性”术语(例如，术语“包括”应解释为 “包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于” 等)。本领域的技术人员还理解的是如果引入的权利要求描述意图具有特定数目，则这种意图应清楚地在权利要求书中描述，并且不存在这种描述时则没有这种意图存在。例如，为帮助理解，下面所附的权利要求书中可以含有引入性的短语“至少一种”和“一种或多种”的使用来引入权利要求描述。然而，这种短语的使用不应理解为暗指通过不定冠词“一种”或“一个”引入权利要求描述将含有这种引入的权利要求描述的任何具体权利要求限制在仅含有一个这种描述的实施方案中，即便在同一权利要求包括引入性短语“一种或多种”或“至少一种”和不定冠词如“一种”或“一个”(例如，“一种”和/或“一个”应解释为意指“至少一种”或“一种或多种”)时也如此；这种情况对于用于引入权利要求描述的定冠词的使用也适用。此外，即使明确地描述了引入的权利要求描述的具体数目，本领域的技术人员也将认识到这种描述通常应解释为意指至少所述的数目(例如，没有其他修饰词的“两种描述”的无限定描述通常意指至少两种描述或两种或更多种描述)。此外，在其中使用与“A、B和C 等的至少一种”类似的常规描述的那些情况下，这种句子结构通常意指本领域的技术人员将理解该常规描述的含义(例如，“具有A、B和C的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B —起、A和C 一起、B和C 一起、和/或A、B和C 一起等的系统)。在其中使用与“A、B和C等的至少一种”类似的常规描述的那些情况下，这种句子结构通常意指本领域的技术人员将理解该常规描述的含义(例如，“具有A、B或C的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B —起、A和C 一起、B和C 一起、和/或A、B和C 一起等的系统)。本领域的技术人员还将理解实质上任何不连续的代表两个或更多个可选的术语的字和/或短语无论在说明书、权利要求书或附图中都应理解为涵盖包括一种所述术语、所述术语的任一种或两种术语的可能性。例如，短语 "A或B”将理解为包括“A”或“B”或"A和B”的可能性。 尽管本文公开了多个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于本领域的技术人员也将是明显的。本文所公开的多个方面和实施方案是为了示例的目的，而不旨在限制， 真正的范围和精神由随后的权利要求表示。
权利要求
1.一种从异质细胞群中的稀有细胞分离核酸的方法，所述方法包括(a)将所述异质细胞群分配到多个室中，以便使在含有所述稀有细胞的室中所述稀有细胞的浓度增加至少X倍，其中X是室的数目除以所述异质细胞群中稀有细胞的数目；(b)对每个室的基本上整个区域成像以确定哪些室含有所述稀有细胞；(c)添加试剂到含有所述稀有细胞的室中以使细胞裂解并从所述稀有细胞释放核酸到培养基中；以及(d)只从含有已被裂解的稀有细胞的室中收集含有释放的核酸的培养基，从而从所述稀有细胞收集核酸。
2.一种从异质细胞群中的稀有细胞分离核酸的方法，所述方法包括(a)将所述异质细胞群分配到多个室中，以便使在含有所述稀有细胞的室中所述稀有细胞的浓度增加至少X倍，其中X是室的数目除以所述异质细胞群中稀有细胞的数目；(b)对每个室的基本上整个区域成像以确定哪些室含有所述稀有细胞；(c)定位所述稀有细胞在含有所述稀有细胞的室中的位置；(d)将能量束导向所述稀有细胞在含有所述稀有细胞的室中的位置，以引起所述稀有细胞的特异性裂解而没有其他细胞显著裂解，并从所述稀有细胞释放核酸到培养基中；以及(e)从含有已被裂解的稀有细胞的室中收集含有释放的核酸的培养基，从而从所述稀有细胞收集核酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述定位是通过参考所述室的图像进行的。
4.根据权利要求2-3所述的方法，所述方法还包括使所述异质细胞群与选择性结合所述稀有细胞的剂接触的步骤，其中所述剂产生作为光特性的可检测的信号。
5.根据权利要求2-4所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)和(e)之间任一阶段添加RNA酶抑制剂的步骤。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中X选自下列的组大约10、30、100、300、1，000、 3，000、10，000,30, 000 和 100，000。
7.根据权利要求1-6所述的方法，其中所述室是多孔板的孔。
8.根据权利要求2-7所述的方法，其中所述收集导致从所述稀有细胞的核酸收集达到稀有细胞核酸与非稀有细胞核酸相比最多Y倍的富集，其中Y是所述室中未裂解的非稀有细胞的数目。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中Y选自下列的组大约10、30、100、 300、1，000,3,000、10，000,30, 000 和 100，000。
10.一种从异质细胞群中的稀有细胞分离核酸的方法，所述方法包括(a)将所述异质细胞群置于易于成像的表面上；(b)对所述表面的基本上整个区域成像；(c)通过参考所述表面的图像定位所述稀有细胞在所述表面上的位置；(d)将聚焦能量束导向所述稀有细胞的位置，以引起所述稀有细胞的特异性裂解而没有其他细胞的显著裂解，并从所述稀有细胞释放核酸到培养基中；以及(e)收集含有从已被裂解的稀有细胞中释放的核酸的培养基，从而从所述稀有细胞收集核酸。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，所述方法还包括用纳米粒子标记来标记细胞，其中所述纳米粒子标记用于改善能量束介导的细胞裂解的效率。
12.—种分析细胞内容物的方法，所述方法包括提供包含感兴趣的细胞的细胞群用于分析；定位所述细胞群中的至少一个感兴趣的细胞；将能量束导向所述至少一个感兴趣的细胞的位置，其中所述能量束具有足以至少部分裂解所述至少一个感兴趣的细胞的能量，所述至少部分裂解足以从细胞释放内容物；以及分析从所述感兴趣的细胞释放的内容物。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，所述方法还包括使细胞群与对所述至少一个感兴趣的细胞特异性的标记接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标记包括下列的一种或多种多克隆或单克隆抗体、抗体片段、凝集素、配体、蛋白、肽、脂质、氨基酸、核酸、修饰的核酸如锁定核酸 (LNA)、或合成的小分子。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述标记还包括纳米粒子，其中所述纳米粒子改善能量束介导的细胞裂解的效率。
16.根据权利要求15-21中任一项所述的方法，其中所述定位包括对所述细胞群成像。
17.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述定位包括基于所述标记的存在定位所述至少一个感兴趣的细胞。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，所述方法还包括提供RNA酶抑制剂。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的方法，其中将所述细胞群分配到多于一个的室中。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，所述方法还包括添加Fc受体阻断试剂。
21.根据权利要求12-20中任一项所述的方法，其中所述至少一个感兴趣的细胞以小于约1/10,000的浓度存在于所述细胞群中。
22.根据权利要求12-21中任一项所述的方法，其中所述至少一个感兴趣的细胞以在约1/100，000细胞与约1/10，000, 000细胞之间的浓度存在于所述细胞群中。
23.根据权利要求12-22中任一项所述的方法，所述方法还包括至少收集所述核酸。
全文摘要
一些方面涉及对异质细胞群中的选择的细胞进行遗传学分析的方法。首先可以分配细胞群。通过成像鉴定所选择的细胞，并然后通过用能量束辐照来特异性靶向和裂解所选择的细胞，从而导致特异性释放它们的细胞内容物到培养基中。然后可以对培养基取样并测定期望的核酸。
文档编号C12Q1/68GK102341505SQ201080009822
公开日2012年2月1日 申请日期2010年1月8日 优先权日2009年1月9日
发明者加里·布莱特, 古斯塔夫·安吉尔博格, 弗雷德里克·坎曼, 曼弗雷德·科勒, 詹姆士·林顿 申请人:英特拉克森公司