专利名称：在具有腺毛的植物中产生萜烯和萜类的制作方法
在具有腺毛的植物中产生萜烯和萜类领域本公开内容一般涉及在遗传改造的具有腺毛的植物中产生同源或异源的萜烯 (terpenes)和萜类(terpenoids)、和/或高价值小分子。更具体地，遗传改造的具有腺毛的植物包含并表达编码在同源或异源的萜烯和萜类、和/或高价值小分子的生物合成中具有活性的蛋白的基因。背景大多数植物在其叶表面上具有称为毛状体的特化的毛发样结构。这些结构参与大量适应性功能，包括保护不受草食动物和微生物侵害。存在两种主要类型的毛状体腺毛和非腺毛。腺毛不像非腺毛那么普遍，能够合成和储存大量的次生代谢物作为植物精油的部分。精油是一种挥发性的复杂混合物，特征是强烈的气味，主要包括萜烯。萜烯和其化学改性形式(通称为“萜类”)是生物合成地来源于同样的基本五-碳异戊二烯构件的有价值的烃类。毛状体中发生的生物合成途径具有使得它们成为代谢工程的有吸引力的靶的多种特征。首先，毛状体仅为产生大量特化的小分子而设计，使得它们成为萜烯和来源于萜烯的其他烃类的理想生产系统。第二，毛状体是非必需结构，表示对其内源途径的修饰将不会不利地影响植物健康。第三，由于毛状体的天然保护结构，对其他植物组织有毒的化学物可在植物精油中产生和富集，而不对植物细胞产生细胞毒性。胡椒薄荷(p^permint)是可用作产生油类和高价值小分子的通用平台的具有腺毛的植物的一个实例。从胡椒薄荷(MenthaXpiperita)叶蒸馏的精油用在多种消费品中(如，口香糖、牙膏和漱口水)，用作糖果和药品工业中的调味剂，和用作芳香疗法的活性成分来源。胡椒薄荷油主要由对薄荷烷型单萜(monoterpenes)组成，含有少量(smaller quantities)其他单蔽禾口微量(minor quantities)倍半蔽(sesquiterpenes) (Rohloff, 1999)。精油在特化的盾状腺毛中合成和积聚(Gershenzon等，1989 ；McCaski 11等，1992)。 这些毛状体包含以8细胞盘排列的分泌细胞，它们负责合成精油。精油被排入通过表皮材料的预形成层的分离而形成的新生腔(Amelimxen，1965)。精油从胡椒薄荷盾状腺毛的挥发是可忽略的(Gershenzon等，2000)。尽管类异戊二烯天然产物表现出巨大的结构多样性，关键中间产物的生物合成所基于的生化原理是相对简单的。术语类异戊二烯用于形式上来源于异戊二烯O-甲基丁-1，3-二烯)的化合物，其构架通常可以任何类异戊二烯分子的重复出现来辨别 (Ruzicka,1953)0所有类异戊二烯结构生物合成地来源于“活性异戊二烯”(Lynen等， 1958 ；Chaykin等，1958)即异戊烯基二磷酸(IPP)、和其异构体二甲烯丙基二磷酸(DMAPP) (
图1)。起始分子DMAPP与链延伸分子IPP之间的缩合反应产生多种异戊二烯基二磷酸，其用作产生类异戊二烯终产物的萜烯合酶和次级修饰酶的前体。通用的C5中间产物IPP和 DMAPP可经由两种不同途径产生。在酵母、真菌、古细菌和动物中，甲羟戊酸(MVA)途径负责合成类异戊二烯中间产物，而在大多数真细菌中不依赖MVA的途径起作用。两种途径在植物和某些藻类中都发生，其中MVA途径的酶存在于胞质/ER区室，不依赖MVA途径的酶位于质体(Lange等，2000a)。因为在胡椒薄荷腺毛中产生高水平的IPP和DMAPP (McCaskill和 Croteau, 1995)，存在利用这些毛状体作为产生来源于IPP和DMAPP前体的各种萜烯和萜类的“绿色工厂”的可能。尽管利用植物作为产生小分子的“绿色工厂”的观念已经引起巨大兴趣，迄今有多种问题阻碍了代谢改造的努力(1)当萜烯和萜类以非特异性方式积聚时，其积聚导致细胞毒性；( 当萜类以非特异性方式产生时，其通常为了储存而转化为共轭物 (conjugate)，导致积聚水平低；和(3)当在大多数植物中产生时，萜类作为挥发物排出，这导致积聚水平低。概述本发明的一个实施方案是基于首次在遗传改造的具有腺毛的植物中成功产生新的异源萜烯和/或萜类。具有毛状体的植物物种天然地进化了储存大量精油的能力。本文描述的结果显示，异源萜烯和萜类(该植物天然不产生的萜烯和萜类)被产生和积聚在转基因植物的精油中。该转基因植物通过转化在异源萜烯和/或萜类的生物合成中具有活性的一种或多种基因来产生。典型地，生物合成途径通常或“天然地”存在于其他物种的植物中，但在根据本发明遗传改造的具有腺毛的植物中通常(天然地)不存在或不运转。例如，通过用来自青蒿(Artemisia annua.)的以下基因之一转化薄荷植物，已在该转基因植物中产生和积聚多种异源单萜和倍半萜紫穗槐-1，4-二烯合酶(ADQ基因、 (-)_芳樟醇合酶、(+)_柠檬烯合酶、(-)_柠檬烯7-羟化酶或Y-蛇麻烯合酶。在转基因植物中产生的异源单萜和倍半萜包括紫穗槐-1，4-二烯、(-)_芳樟醇、(+)_柠檬烯、 (-)_紫苏醇和Y-蛇麻烯，这些都不是薄荷植物中通常产生的。这些结果显示，遗传改造的具有腺毛的植物是用于产生有价值的异源萜烯和萜类的适当的宿主。具有腺毛的植物还可用于产生其他有价值的小分子，例如，来源于萜类或苯并素生物合成途径的小分子，诸如松香二烯(abietadiene)、紫穗槐-1,4- 二烯(amorpha-1，4-diene)、5_ 表-马兜铃烯 (5-epi-aristolochene)、青蒿酸(artemisinic acid)、脱氧青蒿酸(dehydroartemisinic acid)、青蒿素(artemisinin)、反式香梓樣烯(trans-alpha-bergamotene)、β-红没药烯(beta-bisabolene)、α -和γ -红没药烯、(+)-冰片基二磷酸((+) -bornyl diphosphate)、 δ-杜丰公！；希(delta—cadinene)、 (-)((_)—camphene)、 (+) -3- W 'M ((+)-3-carene)、α -禾口 β-石竹烯(caryophyllene)、蓖麻烯(casbene)、对映-咖萨-12， 15—二;I；希(ent-cassa-12,15-diene) (epi_cedrol)、菊基二 舞酸(chrysanthemyl diphosphate)、1，8-桉树脑(1，8-cineole)、(-)-柯巴基二磷酸((-)-copalyl diphosphate)、对映-柯巴基二磷酸(ent-copalyl diphosphate)、β -荜澄茄烯 (beta-cubebene)、荜澄酉享(cubebol)、elisabethatriene、β -按叶酉享(beta-eudesmol)、 法呢醇(farnesol)、α -和β -法呢烯(farnesene)、栊牛儿醇(geraniol)、栊牛儿基芳樟酉享(geranyllinalool)、germacradienol/ 土臭味素(geosmin)、大根香叶烯 (germacrene) A、C 禾口 D、棉酷(gossypol)、α -古芸烯(alpha-gur junene)、(+)-5(6)， 13-halimadiene-15_ol、α-、β -禾口 Y-蛇麻烯(humulene)、epi-isozizaene、对映-贝壳杉烯(ent-kaurene)、左旋海松二烯(Ievopimaradiene)、(_)_ 梓檬烯((_)-limonene)、 (-)_ 异薄荷烯醇((-)-isopiperitenol), (+)-柠檬烯((+)-limonene),(-)-芳樟醇 ((-)-Iinalool)、长叶烯(Iongifolene)、对薄荷烧-3,8- 二醇(p-menthane-3，8-diol)、(+)-薄荷呋喃((+) -menthofuran)、(_) _ 薄荷酮((_) -menthone)、(_) _ 薄荷酮、顺式依兰油二烯(cis-muuroladiene)、月桂烯(myrcene)、E-橙花叔醇(E-nerolidol)、 努特卡酮(nootkatone)、β -罗勒烯(beta-ocimene)、广藿香醇(patchoulol)、并环萜烯(pentalenene)、β _ /K 芹烯(beta-phellandrene)、(_)_ 紫苏醇((-)-periIlyl alcohol)、海松-9(11)，15- 二烯(pimara-9 (11)，15-diene)、顺式海松 _7，15- 二烯 (syn-pimara-7，15-diene)、α-和 β -菔烯(pinene)、(+)-胡薄荷酮((+)-pulegone)、顺 ζJj^MBI (cis-rose oxide)、胃映 _ 111 ^ ^ (ent-sandaracopimaradiene)、 δ _ 床烯(delta-selinene)、stemar-13-ene、stemodene、类蔽菌素(terpenticin)、γ - ijS Ftn (gamma-terpinene) > α ~ i βπ If (alpha—terpineol)、i 品油 j；希(terpinolene)、四氧大麻 )酸(tetrahydrocannabinoic acid)、单端抱霄;I；希(trichodiene)、 (+)-瓦伦;I；希 ((+) -valencene)、马鞭草烯酮(verbenone)、岩兰螺旋二烯(vetispiradiene)、α -岩兰酮 (alpha—vetivone)、绿花白千层酉享(viridif lorol)禾口 α -姜烯(alpha—zingiberene)。在本发明的一些实施方案中，萜烯和/或萜类是萜烯生物合成途径前体的衍生物，其实例包括但不限于异戊烯基二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸、栊牛儿基二磷酸、法呢基二磷酸、栊牛儿基栊牛儿基二磷酸和角鲨烯。此外，通过遗传改造来操纵具有腺毛的植物的遗传组分，例如，以包含和表达编码催化不同目标修饰反应的一种或多种酶的基因，可导致产生具有期望的化学组成和特性的具体的目标化合物。在一些实施方案中，本发明提供一种遗传改造的具有腺毛的植物(如，薄荷植物)，所述植物包含编码在至少一种或多种异源或同源的萜烯或萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白的一种或多种可表达基因，其中所述异源或同源萜烯或萜类在所述遗传改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并储存在所述遗传改造的具有腺毛的植物的所述腺毛的油中。可表达基因的实例包括紫穗槐-1，4-二烯合酶、(-)-芳樟醇合酶、(+)-柠檬烯合酶、(-)_柠檬烯7-羟化酶或Y-蛇麻烯合酶。异源或同源萜烯的实例包括单萜、倍半 IS、二IS (diterpenes)、三1 (triterpenes)禾口多i (polyterpenes),诸如,如,紫種槐一1, 4-二烯、(-)_芳樟醇、(+)_柠檬烯、(-)_紫苏醇和/或Y-蛇麻烯。在其他实施方案中，本发明提供一种产生一种或多种萜烯和萜类的方法，包括以下步骤i)选择具有腺毛的植物(如，薄荷植物)；和ii)遗传改造具有腺毛的植物以包含和表达编码在至少一种或多种萜烯和萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白的一种或多种基因。所述萜烯和萜类在具有腺毛的植物的腺毛中合成并储存在具有腺毛的植物的腺毛的油中。适当基因的实例包括紫穗槐-1，4-二烯合酶、(-)_芳樟醇合酶、(+)_柠檬烯合酶、(-)_柠檬烯7-羟化酶或Y-蛇麻烯合酶。异源或同源萜烯的实例包括单萜、倍半萜、二萜、三萜和多萜，诸如，如，紫穗槐-1，4-二烯、(-)-芳樟醇、(+)-柠檬烯、(-)-紫苏醇和/或Y-蛇麻烯。在一些实施方案中，所述具有腺毛的植物还包含抑制所述具有腺毛的植物中一种或多种生物合成途径的一种或多种酶的表达的RNA序列。在其他实施方案中，本发明还提供一种产生一种或多种萜烯和萜类的方法，包括以下步骤培养本发明的遗传改造的具有腺毛的植物，从具有腺毛的植物的所述腺毛的油回收一种或多种萜烯和萜类。这一方法可包括用一种或多种茉莉酮酸酯(jasmonates)处理所述遗传改造的具有腺毛的植物的步骤。附图描述
图IA和B. A，为胡椒薄荷中单萜生物合成供应前体的质体不依赖甲羟戊酸途径的概述。以下酶参与这一途径(1)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶；(幻1_脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶；(3) 2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷转移酶;
胞苷5’ - 二磷酸)-2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸激酶；⑶2C-甲基-D-赤藓醇 2，4_环二磷酸合酶；(6) (E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基二磷酸合酶；(7) (E)_4_羟基-3-甲基-丁-2-烯基二磷酸还原酶；(8)异戊烯基二磷酸异构酶；(9)栊牛儿基二磷酸合酶。“Lpl”代表反应的胞内位置白色体。B，胡椒薄荷腺毛中对薄荷烷单萜代谢的概述。以下酶参与这一途径(1)(-)_柠檬烯合酶；(幻(_)_柠檬烯3-羟化酶；(3) (_)-反式异薄荷烯醇(㈠-trans-isopiperitenol)脱氢酶；(4)(-)-反式异胡椒酮 ((-)-trans-isopiperitenone)还原酶；(5) (+)_顺式异胡薄荷酮异构酶；(6) (+)-薄荷呋喃合酶；(7a) (+)-胡薄荷酮还原酶((-)-薄荷酮-形成活性)；(7b) (+)-胡薄荷酮还原酶 ((+)—异薄荷酮—形成活性)；(8a)(-)-薄荷酮(-)-薄荷醇还原酶((-)-薄荷醇-形成活性)；(8b)(-)-薄荷酮(-)-薄荷醇还原酶((+)-新异薄荷醇—形成活性)；(9a)(-)-薄荷酮(+)-新薄荷醇还原酶((+)-新薄荷醇-形成活性)；(9b)(-)-薄荷酮(+)-新薄荷醇还原酶((+)-异薄荷醇-形成活性)。“Lpl” =白色体；“ER” =内质网；“Mit” =线粒体； “Cyt”=胞质(反应的胞内位置)。(+)_薄荷呋喃对(+)_胡薄荷酮还原酶的抑制由弧形表
7J\ ο图2A-D.以实时定量PCR确定的参与胡椒薄荷单萜生物合成的基因的表达谱，利用胡椒薄荷β-肌动蛋白基因(AW255057)作为内源对照。以30天样品(温室条件下生长的野生型植物)获得的RNA的平均信号强度用作校准物(基于现有知识参与单萜生物合成的基因的表达水平在这一叶发育阶段一致地低(但可检测))。使用以下缩写和简称DXS， 脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶；DXR，1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶；CMK，4，4-(胞苷5’ - 二磷酸)-2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸激酶；HDS，(E) -4-羟基-3-甲基-丁 _2_烯基二磷酸合酶；LS，(-)-柠檬烯合酶；L3H，(-)-柠檬烯3-羟化酶；PR，(+)-胡薄荷酮还原酶；MFS，(+)_薄荷呋喃合酶。A，温室对照；B，低光强度；C，低水处理；D，低光强度和高夜间温度。图3A-F.温室生长的野生型㈧和MFS7转基因植物⑶、以及在(C)低水处理、⑶ 低光照和(E)低光照与高夜间温度组合条件下生长的野生型植物的实验确定的单萜谱。X 轴是出叶后的天数；Y轴是单萜(yg/叶)。以下符号用于表示单萜谱(-)_柠檬烯，菱形； (+)-胡薄荷酮，方形中的对钩；(+)-薄荷呋喃，方形中的加号；(-)-薄荷酮，方形；(-)-薄荷醇，三角形。图F概括腺毛密度和大小分布的数据(11 = ，以及出叶30天时的总精油产量(n = 3)。图4.茉莉酮酸甲酯(MeJA)处理对胡椒薄荷叶中精油产量的影响。缩写和简称 Con =未处理对照植物；MeJA =用MeJA处理的植物。图5A-C.从以下获得的精油的气相OiC)色谱:Α，非转基因对照植物、B，表达紫穗槐二烯合酶的转基因株系和C，包含抗疟疾药前体紫穗槐二烯的可信标准混合物(下图)。 紫穗槐二烯以精油的大约8%在转基因植物中积聚，而非转基因对照植物不含任何可检测水平的该代谢物。转基因植物中新代谢物的身份通过气相色谱/质谱(GC-MQ分析证实 (与可信标准物的质谱比较)。
详述第一次，转基因的具有腺毛的植物被成功地遗传改造以产生异源萜烯和萜类。具体地，已经制造了产生和积聚紫穗槐-1，4- 二烯、(-)_芳樟醇、(+)_柠檬烯、(-)_紫苏醇和 Y-蛇麻烯的示例转基因薄荷植物，这是分别以编码在产生萜烯的生物合成途径中具有活性的蛋白，即紫穗槐-1，4-二烯合酶(ADQ、(-)-芳樟醇合酶、(+)_柠檬烯合酶、(-)_柠檬烯7-羟化酶或Y-蛇麻烯合酶的基因转化植物的结果。转基因植物积聚异源萜烯和萜类而不受有害作用影响或因为挥发而减少产量，可能是因为萜烯被隔绝在植物腺毛中。这些结果证明利用遗传改造的具有腺毛的植物作为产生萜烯和萜类的宿主的可行性。本发明涵盖在包含和表达编码在同源或异源萜烯和萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白的基因的遗传改造的具有毛状体的植物中产生同源和异源萜烯和萜类(和相关衍生物)的方法，以及该遗传改造的具有腺毛的植物本身，和其后代。通常，本发明的方法在具有腺毛的植物中实施，所述植物的实例包括但不限于以下属的植物辣椒属(Capsicum)、葛缕子属(Carum)、棉属(Gossypium)、潷草属(Humulus)、 素馨属(Jasminum)、薰衣草属(Lavandula)、母菊属(Matricaria)、薄荷属(Mentha)、 荆芥属(N印eta)、罗勒属(Ocimum)、牛至属(Origanum)、紫苏属(Perilla)、刺蕊草属 (Pogostemon)、迷迭香属(Rosmarinus)、鼠尾草属(Salvia) > ^n M (Solanum)、百里香属 (Thymus)等等。在一些实施方案中，具有腺毛的植物是薄荷植物，例如，薄荷属的薄荷植物。本发明的实施中可利用的薄荷物种包括但不限于水薄荷(Mentha aquatica)、野薄荷(Mentha arvensis)、亚洲薄荷(Mentha asiatica)、澳洲薄荷(Mentha australis)、力口拿大薄荷 (Mentha canadensis)(Mentha cervina)(Mentha citrata) JjJ Bf ^fnf (Mentha crispata) > Mentha cunninghamia>(Mentha dahurica) > Mentha diemenica> Mentha gattefossei> Mentha grandiflora> ^jnf (Mentha haplocalyx) > H ^ifjfff (Mentha j apon i ca) > ill # ^ ^ (Mentha kopetdaghensis) >(Mentha laxiflora)、欧薄荷(Mentha longifolia)、长叶薄荷(Mentha sylvestris)、胡椒薄荷 (Mentha piperita)、唇萼薄荷(Mentha pulegium)、禾斗西嘉薄荷(Mentha requienu)、东北 ^jnf (Mentha sachalinensis) > Mentha satureioides、(Mentha spicata) > 1) ^' 薄荷(Mentha suaveolens)或灰薄荷(Mentha vagans)。还可使用薄荷栽培种，实例包括但不限于水薄荷(Water mint)、水薄荷(Marsh mint)、姜味薄荷、薄荷(Corn Mint)、野薄荷、日本薄荷、中国薄荷(Field Mint)、Pudina、亚洲薄荷、澳洲薄荷、哈特普列薄荷、柠檬薄荷、皱叶薄荷、兴安薄荷(Dahurian Thyme)、Slender mint、森林薄荷、长叶薄荷、唇萼薄荷、科西嘉薄荷、园林薄荷、Native Pennyroyal、留兰香、Curly mint、苹果薄荷、菠萝薄荷、 Erosp i CEltEl、O本发明的具有腺毛的植物是遗传改造的。“遗传改造”是指与被根据本发明遗传改造之前植物的遗传物质相比，植物的遗传物质(如，DNA、RNA等等)已被改变或修饰。被如此遗传改造的植物可以是天然或“野生型”植物，或可以是此前已被(或同时地)以某种方式遗传改造的植物(如，表现对疾病、杀虫剂、艰难生长条件诸如干旱的抗性；或以包含阻碍一种或多种蛋白或酶产生的抑制性RNA ；等等)。可选地，被本发明方法遗传改造的植物可以是为其它植物品种、物种等等的杂交种或杂种的植物，是天然存在的杂种或特意培育的杂种，如，通过选择和将两个品种或物种杂交。遗传改造的植物和其后代都被本发明涵
至
ΓΤΠ ο在本发明的一些实施方案中，进行的遗传改造修饰了植物，使其包含(通常表达或过表达)与植物中已经存在的遗传物质相同或相似的遗传物质(即，同源遗传物质)，但该遗传物质在遗传改造后以不同的量或形式存在，如，可能引入目标基因的另外拷贝，或可能向植物的现有遗传物质引入突变，等等。因为引入这样的同源序列而在植物中产生的产物(如，萜烯和/或萜类)称为同源产物，如，同源萜烯和萜类。在本发明的其他实施方案中，进行的遗传改造修饰了植物，使其包含(通常表达或过表达)植物中通常不存在的遗传物质，导致产生转基因植物。“转基因”是指植物(或其后代)被遗传改造以包含和表达一种或多种异源的目标核酸序列，即，天然不见于植物中的核酸序列。这种核酸的实例包括但不限于编码或包含编码蛋白或肽的基因(可称为转基因、外来基因、异源基因、过客基因等等)的序列；沉默或抑制RNA ；编码tRNA的序列； 编码不同遗传元件诸如启动子、增强子和其他转录和/或翻译控制序列的序列；等等。这样的异源核酸序列来自于另一生物体，如，来自于另一植物物种或品种，或甚至来自于非植物物种。在一些实施方案中，异源核酸序列编码在目标萜烯和/或萜类的生物合成中具有活性(即，参与，可能是所需或必需的)，但通常(天然地)不见于或不由该植物产生的蛋白， 通常是酶。例如，该蛋白可以是催化萜烯或萜类生物合成途径中一个或多个步骤的酶。这些产物称为异源产物，如，异源萜烯和/或萜类。异源蛋白或酶可能直接参与萜烯/萜类产生的生物合成途径，或可能以间接方式调节生物合成，如，通过参与竞争性途径和增加竞争性途径的活性，通过催化随后进入萜烯/萜类生物合成途径的前体的形成，等等。通常，植物的遗传改造进行的方式导致向植物的染色体掺入包含一种或多种目标核酸序列(通常是基因)的DNA，尽管不必总是这种情况。DNA还可能驻留其中或是染色体外元件的部分。在遗传改造的植物中，基因是可表达的，即，它们以允许或导致或促进该基因在植物中转录为RNA(如，mRNA)的方式缔合于(可操作地连接于)其他适当的遗传元件诸如启动子、增强子等等。通常转录随后是成功翻译活性形式的蛋白或酶，除了当基因编码预期作为抑制物作用的RNA诸如iRNA或siRNA时。此外，被引入遗传改造的植物的目标核酸可能包含编码控制其他基因表达的因子的遗传序列。可使用本领域已知的许多方法的任一种转化具有腺毛的植物。例如，可使用农杆菌属(Agrobacterium)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)、中生根瘤菌(Mesorhizobium)或根瘤菌属(Rhizobium)介导的转化方法，如本领域已知的。(例如，Broothaerts等，2005 ； Gelvin等，2005对植物转化技术的描述)。可选地，用于转化植物的其他方法也是已知的， 包括但不限于利用包被有DNA的小的金属如，金或钨颗粒(或其他小颗粒)的颗粒轰击， 将颗粒射入幼嫩植物细胞或植物胚胎；电穿孔，藉以利用电击在植物细胞膜中制造短暂的孔，允许DNA进入；和病毒转导，其中将期望的遗传物质包装入适当的植物病毒，允许该修饰的病毒感染植物。在后一种情况，如果遗传物质是DNA，其可与染色体重组以产生转化体细胞。然而大多数植物病毒的基因组由单链RNA构成，该单链RNA在受感染细胞的胞质中复制。对于这种基因组，该方法是一种转染形式而不是真正的转化，因为所插入的基因不进入细胞核，也不整合到宿主基因组中。受感染的植物的后代不含病毒，也不含所插入的基因。 因此，基因表达局限于被转染的植物，不传递到下一代。
具有毛状体的植物被遗传改造以包含一种或多种基因，例如，编码参与目标萜烯或萜类的合成的蛋白的基因。一种或多种基因可以被过表达，即，表达的水平高于或大于当基因在其自然或天然宿主中存在时通常观察到或获得的水平。一种或多种基因的表达通常被启动子(和可能的其它控制元件)驱动，该启动子/控制元件可能是天然缔合于该基因的(如，启动子/控制元件驱动和/或调节基因在植物或基因来自的生物体，即，该基因在自然界中存在的生物体中的表达)。可选地，可联合该基因采用异源启动子和控制元件。本发明的实践中可采用的启动子的实例包括但不限于多种细胞类型或组织特异性启动子(实例包括但不限于泛在启动子(在生物体的几乎所有组织或细胞中具有活性的；实例包括但不限于花椰菜花叶病毒35S启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、乙醇脱氢酶启动子；GelVin，2005)和细胞类型或组织特异性启动子(实例包括但不限于毛状体特异性启动子(Wang 等，2002 ；Gutierrez-Alcala 等，2005 ；Shangguang 等，2008)。在本发明的一个实施方案中，一种或多种基因是对被遗传改造的植物中一种或多种目标靶基因的序列“反义”的。对靶基因“反义”的基因的表达可以，例如用于经由RNA干扰(RNAi)敲低或敲除靶基因的表达。这种RNA的表达减少或消除一种或多种靶基因的表达。这一策略可用于，例如减少或消除否则干扰萜烯或萜类生物合成途径的酶的不需要的活性，所述干扰如，通过竞争萜烯/萜类合成所需的底物的干扰，或通过产生抑制萜烯/萜类合成的物质，或导致萜烯/萜类的不需要的修饰或催化等等。RNAi可减少或消除这一活性。在一些实施方案中，具有腺毛的植物被遗传改造和产生精油，精油可被储存在例如植物腺毛中，精油可包含一种或多种同源或异源萜烯或修饰的萜烯(如，萜类)。一种或多种同源或异源萜烯/萜类可包括但不限于半萜(hemiterpene)(—个异戊二烯单元)和其含氧的萜类衍生物(半萜类(hemiterpenoids))诸如异戊烯醇和异戊酸等等；单萜(两个异戊二烯单元)诸如栊牛儿醇、柠檬烯和萜品醇等等；倍半萜(三个异戊二烯单元)诸如法呢烯和法呢醇等等；二萜(四个异戊二烯单元)诸如咖啡醇、咖啡豆醇、西柏烯、紫杉烯等等；二倍半萜(sesterterpenes)(五个异戊二烯单元如，栊牛儿基法呢醇等等；三萜(六个异戊二烯单元)诸如角鲨烯等等；四萜(tetraterpenes)(八个异戊二烯单元)诸如无环番茄红素、单环Y胡萝卜素和二环α-和β-胡萝卜烯类；和多萜(多个异戊二烯单元的长链，诸如杜仲胶(天然胶乳)。萜烯可以以分子的萜类形式，可以是线性或环状的。萜烯/ 萜类可以是对具有腺毛的植物内源或外来的。腺毛精油中储存的萜烯还可对腺毛细胞组织比对植物的其他细胞组织具有减少的细胞毒性。萜类对植物细胞培养物的毒性已经在许多出版物中证明(Scragg Α.Η.等1997)。另外，腺毛精油中储存的同源或异源萜烯/萜类可具有减少的挥发。一种或多种基因的过表达可增加精油产生。一种或多种基因的过表达可改变精油与野生型植物精油相比的组成。一种或多种基因的过表达可在精油中富集目标萜烯/萜类，即，目标萜烯/萜类与植物精油混合或与植物精油一起储存或构成植物精油的部分。目标萜烯/萜类可以是转基因的具有毛状体的植物的总精油产量的至少约5<%、10%、15%、 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85% 或 90%。 转基因的具有毛状体的植物的每个叶可产生至少约900 μ g精油。温室中的良好产量通常被认为是从约1，500到约2，200 μ g精油/叶。取决于生长区域，这可表示为在田地中的产量为>约100磅/英亩。在本发明的一些实施方案中，该基因是包括紫穗槐-1，4- 二烯合酶(ADS)、(-) _芳樟醇合酶、(+)-柠檬烯合酶、(“)-柠檬烯7-羟化酶和/或Y -蛇麻烯合酶的一种或多种的基因(可以是转基因)。例如，ADS转基因的过表达可导致产生紫穗槐-1，4-二烯、(-)-芳樟醇、(+)_柠檬烯、(-)_紫苏醇和/或Y-蛇麻烯的一种或多种。紫穗槐-1，4-二烯、(-)-芳樟醇、(+)_柠檬烯、(-)_紫苏醇和/或Y-蛇麻烯可占转基因的具有毛状体的植物总精油产量的至少约 5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%, 70%、75%、80%、85% 或 90%。另外，一种或多种基因可编码参与萜烯生物合成的蛋白。萜烯生物合成可以是半萜、单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、或多萜的生物合成。特别地，一种或多种基因(可以是转基因)可编码，例如(+)_冰片基二磷酸合酶；(-)_莰烯合酶；(+)-3-蒈烯合酶；菊基二磷酸合酶；1，8-桉树脑合酶；栊牛儿醇合酶；异戊二烯合酶；(-)-柠檬烯合酶；(+)-柠檬烯合酶；芳樟醇合酶；月桂烯合酶；(E) - β -罗勒烯合酶；(_) - β -水芹烯合酶；α —菔烯合酶；β -菔烯合酶；⑴-桧烯合酶；Y -萜品烯合酶；α -萜品醇合酶； 萜品油烯合酶；紫穗槐_4，11- 二烯合酶；5-表-马兜铃烯合酶；(Ε)_β -红没药烯合酶； (E)-Y-红没药烯合酶；(+) - δ -杜松烯合酶；β -石竹烯合酶；表柏木醇合酶；β -荜澄茄烯合酶；β -桉叶醇合酶；(Ε，Ε) - α -法呢烯合酶；(E) - β -法呢烯合酶；germacradienol/ 土臭味素合酶；germacredienol合酶；大根香叶烯A合酶；大根香叶烯C合酶；大根香叶烯D合酶；(-)-α -古芸烯合酶；Y -蛇麻烯合酶；印i-isozizaene合酶；长叶烯合酶；顺式依兰油二烯合酶；E-橙花叔醇合酶；广藿香醇合酶；并环萜烯合酶；δ -蛇床烯合酶； δ 1-四氢大麻酚酸；单端孢霉烯合酶；(+)-瓦伦烯合酶；岩兰螺旋二烯合酶；α -姜烯合酶；松香二烯合酶；松香二烯/左旋海松二烯合酶；蓖麻烯合酶；对映-咖萨-12，15- 二烯合酶；(-)-柯巴基二磷酸合酶；对映-柯巴基二磷酸合酶；elisabethatriene ； (+)-5(6), 13-halimadiene-15-ol合酶；对映-贝壳杉烯合酶；左旋海松二烯合酶；海松_9(11)， 15-二烯合酶；顺式海松-7，15-二烯合酶；对映-山达海松二烯合酶；stemar-13-ene合酶； stemodene合酶；类萜菌素合酶；栊牛儿基芳樟醇合酶；无环单萜伯醇NADP+氧化还原酶； 栊牛儿醇10-羟化酶；(-)_柠檬烯7-羟化酶；紫穗槐_4，11-二烯氧化酶；青蒿醛δ 11(13) 还原酶；abietadienol/abietadienal氧化酶；5_表-马兜铃烯1，3_ 二羟化酶；(+) - δ -杜松烯8-羟化酶；premnaspirodiene加氧酶；紫杉烷二萜类(taxoid) 2-α -羟化酶；紫杉烷 5- α -羟化酶；紫杉烷13- α -羟化酶；紫杉烷10- β -羟化酶；紫杉烷14- β -羟化酶；紫杉烷二萜类7- β -羟化酶；紫杉-4 (20)，11 (12) - 二烯-5- α -醇0-乙酰基转移酶；紫杉烷二萜类2- α -0-苯甲酰基转移酶；紫杉烷二萜类10- β -0-苯甲酰基转移酶；N-苯甲酰基转移酶；苯丙氨酸氨基变位酶；C13-苯基丙酰基-CoA转移酶；和/或栊牛儿基栊牛儿醇18-羟化酶(参见表1)。表1 参与萜烯生物合成和修饰的酶
权利要求
1.一种遗传改造的具有腺毛的植物，所述植物包含编码在至少一种或多种异源或同源的萜烯或萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白的一种或多种可表达基因，其中所述异源或同源的萜烯或萜类在所述遗传改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并储存在所述遗传改造的具有腺毛的植物的所述腺毛的油中。
2.如权利要求1所述的遗传改造的具有腺毛的植物，其中所述遗传改造的具有腺毛的植物是薄荷植物。
3.如权利要求1所述的遗传改造的具有腺毛的植物，其中所述一种或多种可表达基因选自下组紫穗槐-1，4-二烯合酶、(-)_芳樟醇合酶、(+)_柠檬烯合酶、(-)_柠檬烯7-羟化酶或Y-蛇麻烯合酶。
4.如权利要求1所述的遗传改造的具有腺毛的植物，其中所述一种或多种异源或同源的萜烯选自下组单萜、倍半萜、二萜、三萜和多萜。
5.如权利要求4所述的遗传改造的具有腺毛的植物，其中所述一种或多种异源或同源的萜烯选自下组紫穗槐-1，4- 二烯、(-)-芳樟醇、(+)-柠檬烯、(-)-紫苏醇和/或Y -蛇麻烯。
6.如权利要求1所述的遗传改造的具有腺毛的植物，其中所述萜烯或萜类是同源的萜烯或萜类。
7.如权利要求1所述的遗传改造的具有腺毛的植物，其中所述萜烯或萜类是异源的萜烯或萜类。
8.如权利要求1所述的遗传改造的具有腺毛的植物，其中所述至少一种或多种异源或同源的萜烯或萜类选自下组松香二烯、紫穗槐-1，4- 二烯、5-表-马兜铃烯、青蒿酸、脱氢青蒿酸、青蒿素、反式α-香柠檬烯、β-红没药烯、α-和Y-红没药烯、(+)_冰片基二磷酸、δ -杜松烯、(-)-莰烯、(+) -3-蒈烯、α -和β -石竹烯、蓖麻烯、对映-咖萨-12，15- 二烯、表柏木醇、菊基二磷酸、1，8-桉树脑、(-)-柯巴基二磷酸、对映-柯巴基二磷酸、β -荜澄茄烯、荜澄茄醇、elisabethatriene、β -桉叶醇、法呢醇、α -和β -法呢烯、栊牛儿醇、栊牛 JL基芳樟醇、germacradieno 1/ 土臭味素、大根香叶烯A、C和D、棉酚、α -古芸烯、(+) -5 (6)， 13-halimadiene-15_ol、α -、β -和 y-蛇麻烯、印i-isozizaene、对映-贝壳杉烯、左旋海松二烯、(-)_柠檬烯、(-)_异薄荷烯醇、(+)_柠檬烯、(-)_芳樟醇、长叶烯、对薄荷烷_3， 8- 二醇、(+)_薄荷呋喃、(-)_薄荷酮、(-)_薄荷酮、顺式依兰油二烯、月桂烯、E-橙花叔醇、 努特卡酮、罗勒烯、广藿香醇、并环萜烯、水芹烯、(-)_紫苏醇、海松-9(11),15-二烯、顺式海松-7，15-二烯、α-和β-菔烯、(+)_胡薄荷酮、顺式玫瑰醚、对映-山达海松二烯、δ -蛇床烯、stemar-13-ene、stemodene、类萜菌素、γ -萜品烯、α -萜品醇、萜品油烯、四氢大麻酚酸、单端孢霉烯、(+)_瓦伦烯、马鞭草烯酮、岩兰螺旋二烯、α-岩兰酮、绿花白千层醇和α-姜烯。
9.一种产生一种或多种萜烯和萜类的方法，所述方法包括以下步骤选择具有腺毛的植物；遗传改造所述具有腺毛的植物以包含和表达编码在至少一种或多种萜烯和萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白的一种或多种基因，其中所述萜烯和萜类在所述具有腺毛的植物的腺毛中合成并储存在所述具有腺毛的植物的所述腺毛的油中。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述具有腺毛的植物是薄荷植物。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种基因选自下组紫穗槐-1，4-二烯合酶、(-)_芳樟醇合酶、(+)_柠檬烯合酶、(-)_柠檬烯7-羟化酶或Y-蛇麻烯合酶。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述萜烯选自下组单萜、倍半萜、二萜、三萜和多ISo
13.如权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种萜烯选自下组紫穗槐-1，4-二烯、(-)_芳樟醇、(+)_柠檬烯、(-)_紫苏醇和/或Y-蛇麻烯。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述具有腺毛的植物还包含抑制所述具有腺毛的植物中一种或多种生物合成途径的一种或多种酶的表达的RNA序列。
15.一种产生一种或多种萜烯和萜类的方法，所述方法包括以下步骤培养遗传改造的具有腺毛的植物，所述遗传改造的具有腺毛的植物包含编码在至少一种或多种异源或同源的萜烯或萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白的一种或多种可表达基因，其中所述异源或同源的萜烯或萜类在所述遗传改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并储存在所述遗传改造的具有腺毛的植物的所述腺毛的油中；和从所述具有腺毛的植物的所述腺毛的所述油回收所述一种或多种萜烯和萜类。
16.如权利要求15所述的方法，还包括以下步骤用一种或多种茉莉酮酸酯处理所述遗传改造的具有腺毛的植物。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述至少一种或多种异源或同源的萜烯或萜类选自下组松香二烯、紫穗槐-1，4-二烯、5-表-马兜铃烯、青蒿酸、脱氢青蒿酸、青蒿素、 反式α-香柠檬烯、β-红没药烯、α-和Y-红没药烯、(+)_冰片基二磷酸、δ-杜松烯、(-)_莰烯、(+)-3-蒈烯、α-和β-石竹烯、蓖麻烯、对映-咖萨-12，15-二烯、表柏木醇、菊基二磷酸、1，8_桉树脑、(-)_柯巴基二磷酸、对映-柯巴基二磷酸、β-荜澄茄烯、荜澄茄醇、elisabethatriene、β-桉叶醇、法呢醇、α-和β -法呢烯、栊牛儿醇、栊牛儿基芳樟醇、germacradienol/土臭味素、大根香叶烯A、C和D、棉酚、α-古芸烯、(+)-5(6), 13-halimadiene-15_ol、α -、β -和 y-蛇麻烯、印i-isozizaene、对映-贝壳杉烯、左旋海松二烯、(-)_柠檬烯、(-)_异薄荷烯醇、(+)_柠檬烯、(-)_芳樟醇、长叶烯、对薄荷烷_3， 8- 二醇、(+)_薄荷呋喃、(-)_薄荷酮、(-)_薄荷酮、顺式依兰油二烯、月桂烯、E-橙花叔醇、 努特卡酮、罗勒烯、广藿香醇、并环萜烯、水芹烯、(-)_紫苏醇、海松-9(11),15-二烯、顺式海松-7，15-二烯、α-和β-菔烯、(+)_胡薄荷酮、顺式玫瑰醚、对映-山达海松二烯、δ -蛇床烯、stemar-13-ene、stemodene、类萜菌素、γ -萜品烯、α -萜品醇、萜品油烯、四氢大麻酚酸、单端孢霉烯、(+)_瓦伦烯、马鞭草烯酮、岩兰螺旋二烯、α-岩兰酮、绿花白千层醇和α-姜烯。
18.—种遗传改造的具有腺毛的植物，所述植物包含一种或多种可表达核酸序列，所述可表达核酸序列编码抑制在至少一种或多种萜烯或萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白的表达的RNA，其中所述萜烯或萜类在所述遗传改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并储存在所述遗传改造的具有腺毛的植物的所述腺毛的油中。
全文摘要
提供了在转基因的具有腺毛的植物中产生异源萜烯(terpenes)、萜类(terpenoids)和/或小分子的方法，以及能够产生异源萜烯、萜类和小分子的转基因的具有腺毛的植物。遗传改造的具有腺毛的植物包含并表达编码在产生萜烯、萜类和小分子的生物合成途径中具有活性的蛋白的一种或多种基因。结果是，转基因植物的精油富集异源或同源的萜烯、萜类和/或小分子。植物腺毛中精油的储存减少异源分子的挥发性和细胞毒性，从而增加产量和减少对转基因植物的伤害。
文档编号C12P7/64GK102413681SQ201080018650
公开日2012年4月11日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者葛兰·W·特纳, 贝恩德·马库斯·兰格, 里格伯托·里奥斯-埃斯特帕 申请人:华盛顿州立大学研究基金会