快速无菌微测试的制作方法

专利名称：快速无菌微测试的制作方法
快速无菌微测试相关申请本申请要求2009年5月4日提交的美国临时申请第61/175，271号的权益。上述专利的全部内容通过引用纳入本文。
背景技术：
美国的联邦法规和其它国家的类似法规需要无菌试验以确保药物产品基本没有微生物如细菌和真菌。三种常用方法-直接转移无菌试验、膜过滤无菌试验、产品冲洗无菌试验用于完成这些无菌测试。传统无菌试验用两种液体培养基O0-25°C培养的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)和30-35°C培养的液体巯基醋酸盐培养基(FTM))和冲洗液体进行， 需要14天的培养时间(参见例如USP<71> “无菌试验”(Sterility Tests)，《药典论坛》 (Pharmacopeial Forum). USP 30-NF 25，第 1 次修订，美国药典委员会(The United States Pharmacopeial Convention, Inc.)) ,EP 2. 1. 6 “无菌” (Sterility)(欧洲药典 2· 1. 6 “无菌”EP第6版Q007))和其它相关药典。液体巯基醋酸盐培养基(FTM)包含两相-液体培养基的下层相是厌氧相，上层相包含用于供氧培养的氧气。通常，为使用膜过滤方法测试药物产品的无菌性，液体、乳化或溶解的药物或医药产品(例如活性成分、胃肠外制剂、滴眼剂、鼻喷雾等)经0.45微米孔径膜过滤，膜转移到适当测试培养基(FTM和TSB)并培养14天。如果微生物在培养基中生长，则药物产品并非无菌且取样进行微生物鉴定。培养需要大量时间，对培养基中生长的生物进行微生物鉴定也需要大量时间，这是劣势且限制药物产品对需要病人的可用性。例如，在医疗危机时期， 目前需要14天培养期的无菌试验会延误能减少或结束危机的药物或疫苗的可用性。因此， 需要快速无菌试验方法。发明概述本发明涉及检测药物组合物中活微生物的方法，包括步骤a)提供可过滤的药物组合物；b)过滤药物组合物以提供至少三个其上沉积药物组合物滤渣的过滤膜；c)将至少三个过滤膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；d)i)在20-25°C有氧条件下培养至少一个滤渣培养物；ii)在30-35°C有氧条件下培养至少一个滤渣培养物和iii)在 30-35°C厌氧条件下培养至少一个滤渣培养物；条件是滤渣培养物的培养期均不大于约13 天和e)检测膜上的活微生物细胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活微生物细胞、微菌落或菌落指示药物组合物中存在活微生物。所述方法还可包括在过滤药物组合物后过滤洗液的步骤。在一些实施方式中，膜是聚偏二氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚碳酸酯膜、聚对苯二甲酸乙二酯膜、混合纤维素酯(醋酸纤维素和硝酸纤维素)、磷酸纤维素膜、DEAE膜、尼龙网膜或聚四氟乙烯膜。所述膜优选具有约0.45 μ m的孔径。固体培养基可选自FTM-A(含1. 075%琼脂(终浓度)的液体巯基醋酸盐培养基)、 BHI (脑心浸液琼脂)、蒂福科(Difco)酿酒厌氧琼脂、R2A琼脂、施乐(khaedler)血琼脂、 开索(Caso)-琼脂ICR(胰蛋白酶大豆琼脂)、有5%血的哥伦比亚琼脂和⑶C厌氧血琼脂。在一些实施方式中，所述方法可包括培养滤渣培养物约2-7天的步骤。
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在一些实施方式中，活微生物细胞、微菌落或菌落用发光测定检测，如检测膜上活微生物细胞、微菌落或菌落生成的三磷酸腺苷(ATP)的生物发光测定。发光测定可包括萤光素酶测定。在一些实施方式中，发光测定检测探针与微生物内源核酸之间形成的核酸杂交产物。发光测定可包括过氧化物酶反应。在一些实施方式中，可用电荷耦合器件相机和图像分析软件检测发光。在一些实施方式中，可定量测定或计数测定活微生物细胞、活微生物微菌落或活微生物菌落的数量。在一些实施方式中，药物组合物是液体组合物。所述液体组合物可以是胃肠外组合物、口服组合物、鼻用组合物、眼用组合物或疫苗。本发明也涉及检测药物组合物中活微生物的方法，包括步骤a)提供可过滤的药物组合物；b)过滤药物组合物以提供至少三个其上沉积药物组合物滤渣的过滤膜；c)将至少三个过滤膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；d)i)在20-25°C有氧条件下培养至少一个滤渣培养物；ii)在30-35°C有氧条件下培养至少一个滤渣培养物和iii)在 30-35°C厌氧条件下培养至少一个滤渣培养物；条件是滤渣培养物的培养期均不大于约13 天和e)检测膜上的三磷酸腺苷(ATP)，其中膜上存在ATP指示药物组合物中存在活微生物。附图简要说明

图1显示10分钟时间框内UV处理奥斯陆莫拉菌(M. osloensis)的结果。显示培养4天后存在的菌落形成单位(CFU)数量。该图显示4分钟后(3轮)CFU减少量大于或等于 50%。图2显示10分钟时间框内热处理大肠杆菌(E.coli)的结果。显示培养3天后的菌落形成单位(CFU)数量。该图显示3分钟后(3轮)CFU减少量大于或等于50%。图3显示10分钟时间框内胃肠外药物产品处理的结果。显示培养5天后的菌落形成单位(CFU)数量。该图显示2分钟后(3轮)CFU减少量大于或等于50%。图4A是70°C热处理3分钟的藤黄微球菌(M. Iuteus)细胞的显微照片。图4B是接种于胰蛋白酶大豆琼脂的未处理藤黄微球菌细胞在30-35°C培养3天后的显微照片。图5显示未处理大肠杆菌培养物、热处理大肠杆菌、UV处理大肠杆菌和扶他林处理大肠杆菌的光密度数据。图6显示未处理大肠杆菌培养物、热处理大肠杆菌、UV处理大肠杆菌和扶他林处理大肠杆菌的光密度数据。图7显示未处理大肠杆菌生长曲线与热处理大肠杆菌的比较。大肠杆菌培养物在 3小时过程中的斜率为0. 2313，随后它回升到未处理培养物的正常斜率。图8显示未处理金黄色葡萄球菌(S. aureus)生长曲线与热处理金黄色葡萄球菌的比较。应激金黄色葡萄球菌培养物在4小时过程中的斜率为0. 1070，随后它回升到未处理培养物的正常斜率G小时后，0. 4034)。图9显示未处理白色念珠菌(C. albicans)生长曲线与热处理白色念珠菌的比较。 应激白色念珠菌培养物在超过8小时过程中的斜率为0. 0419。图10显示未处理短小芽孢杆菌(B. pumilus)生长曲线与饥饿短小芽孢杆菌的比较。所述细胞在2-8°C经历营养耗尽7天。应激短小芽孢杆菌培养物在5小时过程中的斜率为-0. 0056，随后它回升到未处理培养物的正常斜率。
图11是显示施乐血琼脂背景试验结果的显微照片。密理弗(MILLIFLEX)快速膜 MXHVffP 124在密理弗(MILLIFLEX)盒中的施乐血琼脂上30_35°C孵育5天。图IlA显示密理弗(MILLIFLEX)快速图像，所述膜在此情况中用IOOml液体A冲洗。图IlB显示用IOOml 液体D冲洗的膜。发明详述本发明涉及比需要14天培养期的常规试验更快速的无菌试验方法。所述方法特别适合可过滤液体组合物，如液体药物组合物(例如溶液、悬浮液、乳液、胃肠外组合物、口服组合物、鼻用组合物、眼用组合物、疫苗)的快速无菌测试。通常，该方法包括经过滤膜过滤药物组合物，随后将过滤膜转移到固体培养基并在适当生长条件下培养足够长的时间以使膜上的活微生物增殖或生成足量的生物分子如三磷酸腺苷，从而检测微生物(例如6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天)。一方面，本发明是检测药物组合物中活微生物的方法。所述方法包括经过滤膜过滤药物组合物(例如液体药物组合物)，以提供超过一个(例如至少三个)其上沉积药物组合物滤渣和药物组合物中可能存在的任何活微生物的过滤膜。如需要，可随后过滤洗液，例如用于将生长抑制剂、代谢抑制剂或检测抑制剂从膜上洗去，从而促进滤渣中微生物的检测。含滤渣的过滤膜安置到固体培养基上以生成至少三个滤渣培养物。然后，滤渣在三种不同条件下培养20-25°C的有氧条件；30-35°C的有氧条件和30_35°C的厌氧条件，培养期足以使过滤膜上的活微生物增殖或生成足量的生物分子如三磷酸腺苷，以便检测微生物。通常，滤渣培养物的培养期不超过约13天，优选培养期大大少于13天。然后，使用任何合适方法评估滤渣培养物的膜上活微生物细胞、微菌落或菌落的存在。过滤膜上存在活微生物细胞、微菌落或菌落指示药物组合物中存在活微生物。在本发明的一个方面，提供了检测药物组合物中活微生物的方法，包括以下步骤 提供可过滤的药物组合物；过滤药物组合物以提供至少三个其上沉积滤渣的过滤膜；将至少三个过滤膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；在20-25°C有氧条件下培养第一个滤渣培养物，在30-35°C有氧条件下培养第二个滤渣培养物和在30-35°C厌氧条件下培养第三个滤渣培养物，培养期均不大于约13天；检测膜上的三磷酸腺苷(ATP)。过滤膜上存在ATP指示药物组合物中存在活微生物。可用本发明检测广泛范围的微生物(例如酵母和霉菌、革兰氏阳性孢子菌、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性球菌和革兰氏阳性杆菌(好氧和厌氧微生物))。所述方法可用于检测ATCC(美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection))菌株， 也用于检测可能污染生产设施的环境微生物。例如，本文所述的方法可用于检测巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)ATCC16404(以前称为黑曲霉(Aspergillus niger))、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) ATCC 6633、白色念珠菌(Candida albicns)ATCC 10231、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC 11437、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538、大肠杆菌(Escherichia col i) ATCC 8739、洛菲不动杆菌(Acinetobacter Iwoffi)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、病研所芽孢杆菌(Bacillus idriensis)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、非发酵棒杆菌(Corynebacterium afermentans)；库克菌属(Kocuriaspez.)、嗜根库克菌(Kocuria rhizophilia)(以前称为藤黄微球菌(Micrococcus luteus))(Moraxella osloensis)(Penicillium spez.) ^
酸杆菌(Propionibacterium acnes)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)禾口沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。通常，药物组合物(例如液体药物组合物)使用高压无菌或灭菌技术经无菌过滤膜过滤，如使用真空或正压力。可使用任何合适的过滤膜和过滤装置。合适过滤膜的例子包括例如聚偏二氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚碳酸酯膜、聚对苯二甲酸乙二酯膜、混合纤维素酯(醋酸纤维素和硝酸纤维素)、磷酸纤维素膜、DEAE膜、尼龙网膜或聚四氟乙烯膜。膜优选由PVDF(聚偏二氟乙烯)制成。适用于要求保护的本发明的过滤膜的孔径小到足以保留药物组合物中可能存在的微生物，如孔径为约0. 1微米(μ m)-约20微米，约0. 1微米-约 15微米，0. 1微米-约12微米，0. 1微米-约10微米，0. 1微米-约8微米，0. 1微米-约6 微米，0. 1微米-约5微米，0. 4微米-12微米，0. 4微米-10微米，0. 4微米-8微米，0. 4微米-6微米，约0. 22微米或约0. 45微米。所述过滤膜优选具有约0. 45 μ m的孔径。通常制备至少三个含滤渣的过滤膜。这通过经三个单独过滤膜过滤三个单独药物组合物样品来完成。这也可通过制备一个含药物组合物滤渣的过滤膜并使用无菌或灭菌技术将过滤物切成或分成三部分(例如尺寸大致相等的三个部分)。然后，将含药物组合物的过滤膜置于适当固体培养基上以产生滤渣培养物。可选择适当固体培养基和培养条件来支持待检测的所需微生物的生长和/或代谢。这可通过例如筛选培养基完成，如本文所述和示例。本方法使用的固体培养基优选支持广泛范围的微生物在有氧和厌氧培养条件下生长。如果需要，可使用超过一种的固体培养基。例如，可使用的第一种培养基在酵母、霉菌和好氧菌生长上等同于或优于液体胰蛋白酶大豆肉汤；可选择的第二种培养基在厌氧微生物生长上等同于或优于液体巯基醋酸盐培养基的厌氧相，可选择的第三种培养基在好氧微生物生长上等同于或优于液体巯基醋酸盐培养基的有氧相。在有氧和厌氧条件下优选使用单一固体培养基。本发明可使用的合适固体培养基包括例如FTM-A(含1. 075%琼脂(终浓度)的液体巯基醋酸盐培养基)、BHI (脑心浸液琼脂)>Difco酿酒厌氧琼脂、R2A琼脂、施乐血琼脂、开索-琼脂ICR(胰蛋白酶大豆琼脂)、有5%血的哥伦比亚琼脂和CDC厌氧血琼脂。施乐血琼脂是本发明使用的特别优选的固体培养基。优选的固体培养基适于支持“应激”和“非应激”微生物的生长和/或代谢，如本文所述。这很需要，因为微生物在化学方法如药物组合物生产过程中可能遭受应激，例如低渗透或高渗透压应激、辐射(如UV光、伽马射线、微波)、超声波、热、低温或化学应激(由例如氯或药物产品引发)。滤渣培养物在适当生长条件下孵育(即培养)足够长的时间以使膜上的活微生物增殖产生微菌落或菌落，或产生足量的生物分子如三磷酸腺苷以检测微生物。通常，一个滤渣培养物在30-35°C有氧条件下培养，第二个滤渣培养物在30-35°C厌氧条件下培养，第三个滤渣培养物在20-25 °C有氧条件下培养。在一些实施方式中，滤渣培养物的培养时间足以使活微生物生成可检测量的ATP， 如至少约200阿托摩尔ATP，至少约200飞摩尔ATP，至少约200皮摩尔ATP，或至少约200 纳摩尔ATP。培养期可以是约2-7天、约2-8天、约2-9天、约2_10天、约2_11天、约2_12天、约2-13天、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天或约6天。各单独滤渣培养物的培养期可视情况而变，并非所有滤渣培养物都需要培养相同时间量。优选的培养时间根据待检测的微生物而变化。滤渣培养物孵育后可使用任何适当方法如目测或优选使用合适测定检测过滤膜上的活微生物细胞、微菌落或菌落。例如，发光测定(例如萤光素酶测定)可用于检测活微生物细胞、微菌落或菌落。可采用任何合适方法或系统检测发光，如电荷耦合器件相机、图像处理器和/或图像分析软件。有利地，图像分析软件可用于定量测定或计数测定活微生物细胞、活微生物微菌落或活微生物菌落的数量。在一些实施方式中，发光测定例如萤光素酶测定用于检测过滤膜上活微生物细胞、微菌落或菌落产生的三磷酸腺苷(ATP)。例如，将ATP释放剂或生物发光剂(如含萤光素酶和荧光素的试剂)用于过滤膜，如果活细胞生成ATP则会发光。通过发光检测ATP的合适试剂在本领域熟知且有市售 (例如密理弗(MILLIFLEX)快速试剂盒；马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore Corporation))。在滤渣培养物孵育后也可检测过滤膜上存在的活微生物细胞、微菌落或菌落，例如使用发光测定以检测探针与微生物内源核酸的杂交。发光测定可包括过氧化物酶反应或其它适当反应。适于经过氧化物酶和其它酶活性产生发光的试剂已熟知且有市售。可使用的测定和检测系统能检测约10-100个酵母细胞或约1000个细菌细胞。所用测定和检测系统优选能检测单一细胞或少至约100个细胞。这可通过例如检测微生物产生的ATP来完成。例如，当市售ATP生物发光测定与市售电荷耦合器件相机、图像处理器和图像分析软件(密理弗(MILLIFLEX)快速微生物检测和计数系统；马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司)联用时，其可用于检测约200阿托摩尔ATP，相当于约1个酵母或霉菌细胞或约100个细菌细胞。本文所述检测方法适于评估可过滤组合物，如液体药物组合物的无菌性。液体组合物包括含水组合物、悬浮液和乳液。液体药物组合物可以是适合药物用途的任何液体，包括例如胃肠外组合物、口服组合物、鼻用组合物或眼用组合物。液体组合物可以是疫苗。合适的疫苗包括例如炭疽疫苗(ANT)、卡介苗疫苗(BCG)、疏螺旋体病疫苗外表面蛋白A疫苗(BORospA)、白喉类毒素和破伤风类毒素疫苗(DT)、白喉类毒素和破伤风类毒素和百日咳疫苗(DTP)、用于儿童的白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗(DIPa)、用于成人的白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗(DrTPar)、白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳和乙型流感嗜血杆菌偶联物疫苗(DIPa-HIB)、白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳和乙型流感嗜血杆菌偶联物及脊髓灰质炎病毒灭活疫苗(DIPa-HIB-IPV)、甲肝病毒疫苗(HAV)、甲肝病毒和乙肝病毒疫苗(HAV-HBV)、 乙肝病毒疫苗(HBV)、幽门螺杆菌疫苗(HEL)、乙型流感嗜血杆菌疫苗(HIB)、乙型流感嗜血杆菌偶联物疫苗(HIBcn)、乙型流感嗜血杆菌多糖疫苗(HIBps)、乙型流感嗜血杆菌疫苗(白喉CRRM197蛋白偶联物，与白喉CRRM197毒素蛋白偶联的寡糖；HIB-HbOC))、包括禽流感(例如H5N1、H1N3)和猪流感(例如H1N1)的流感病毒疫苗(INF)、流感病毒减毒活疫苗(IFNa)、鼻内流感病毒减毒活疫苗(INFan)、流感病毒灭活疫苗(INFi)、灭活流感病毒裂解疫苗(INFs)、灭活甲型和乙型流感三价病毒裂解疫苗(INFS-AB3)、流感全病毒疫苗(INFw)、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗(IPV)、脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)疫苗(MEN)、脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)偶联物疫苗(MENcn)、A，C血清群脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)偶联物疫苗(MENcn-AC)、A，C，Y，W-135血清群脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)多糖疫苗 (MENps-ASYff)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒疫苗(MMR)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒和水痘病毒疫苗(MMR-VAR)、三价口服脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗(OPV)、肺炎球菌(肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae))疫苗(PNU)、七价肺炎球菌(肺炎链球菌)偶联物疫苗(PNUcn-7)、23价肺炎球菌(肺炎链球菌)多糖疫苗(PNUps_23)、脊髓灰质炎病毒疫苗(POL)、狂犬病疫苗(RAB)、人二倍体细胞狂犬病疫苗(RAB-HDCV)、纯化鸡胚细胞狂犬病疫苗(RAB-PCEC)、呼吸道合胞病毒疫苗(RSV)、天花疫苗(SMA)、天花(疫苗病毒)疫苗 (SMAvac)、白喉类毒素和破伤风类毒素(对于成人抗原量减少)疫苗(Td)、弓形虫病(刚地弓形虫(toxoplasm gondii))疫苗(TOX)、伤寒(伤寒沙门菌(Salmonella typhi))疫苗(TPD)、口服伤寒(伤寒沙门菌)减毒活疫苗Ty21a菌株(TPDa)、伤寒(伤寒沙门菌)热和酚灭活干疫苗、伤寒(伤寒沙门菌)Vi荚膜多糖疫苗(TPD-Vi)、结核病(结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis))疫苗，非BCG(TUB)、水痘(鸡痘、水痘带状疱疹病毒)疫苗(VAR)。合适的胃肠外组合物包括例如腺苷酸、前列地尔、硫酸阿米卡星、阿奇霉素、博来霉素、头孢曲松、环丙沙星、顺钼、氮烯唑胺、盐酸正丁霉素、甲磺酸去铁胺、醋酸去氨加压素、地尔硫卓、双嘧达莫、阿霉素、依那普利拉、表柔比星、依前列醇钠、氟康唑、磷酸氟达拉滨、磷酸氟达拉滨、氟马西尼、盐酸格拉司琼、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、盐酸伊立替康、亚叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、左卡尼汀、甲孕酮、美司钠、甲基强的龙醋酸盐、甲氧氯普胺、米托蒽醌、盐酸纳布啡、重酒石酸去甲肾上腺素、醋酸奥曲肽、昂丹司琼、奥沙利钼、催产素、紫杉醇、帕米膦酸二钠、泮库溴铵、溴苯肾上腺素(phenyl印hrine bromide)、盐酸苯肾上腺素、 盐酸异丙嗪、异丙酚、罗库溴铵、磺胺甲嚼唑、舒马坦琥珀酸盐、硫酸特布他林、环戊丙酸睾酮、妥布霉素、维库溴铵、硫酸长春新碱、酒石酸长春瑞滨和无菌链佐星粉末。合适的口服组合物包括例如醋氨酚和磷酸可待因片剂、醋氨酚乙酰唑胺片剂、阿昔洛韦胶囊、盐酸氨洛林、盐酸胺碘酮、苯磺酸氨氯地平和贝那普利胶囊、苯磺酸氨氯地平片剂、阿莫西林和克拉维酸钾、阿莫西林、阿那格雷、去氧孕烯和炔雌醇片剂、阿斯匹林、阿替洛尔、左炔诺孕酮和炔雌醇片剂、阿奇霉素、巴氯芬、盐酸贝那普利、苯佐那酯、甲磺酰苯扎托品、戊酸倍他米松、倍他米松双丙酸酯、氯贝胆碱、比卡鲁胺、富马酸比索洛尔、盐酸安非他酮、布地奈德吸入悬浮液、布美他尼、盐酸苯丙胺、卡麦角林、碳酸钙600、骨化三醇、柠檬酸钙片剂、炔诺酮片剂、卡托普利和氢氯噻嗪片剂、卡托普利、卡马西平、卡维地洛、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢地尼、头孢丙烯、头孢氨苄、色他金(certagen)、盐酸西替利嗪、盐酸利眠宁、马来酸氯苯那敏、氯唑沙宗、克利诺(cholinoid)、西洛他唑、盐酸西咪替丁、西咪替丁、环丙沙星、西酞普兰、异维甲酸、克拉霉素、富马酸氯马斯汀、克林霉素、克罗米酚柠檬酸盐、盐酸克罗米酚、氯硝西泮、克霉唑、氯氮平、色甘酸钠、盐酸环苯扎林、环孢霉素、盐酸赛庚啶、达那唑、盐酸去甲金霉素、醋酸去氨加压素、盐酸右哌甲酯、硫酸右旋苯丙胺、地西泮、双氯芬酸钾、双氯青霉素、去羟肌苷、盐酸地尔硫卓、盐酸苯海拉明、双嘧达莫、磷酸丙吡胺、双丙戊酸钠、盐酸多佐胺、甲磺酸多沙唑嗪、马来酸依那普利、卡马西平、艾司唑仑、雌二醇、雌酮硫酸酯哌嗪、盐酸乙胺丁醇、乙琥胺、依托度酸、泛昔洛韦、法莫替丁、硫化亚铁、 硫酸亚铁、盐酸非索非那定、非那雄胺、醋酸氟卡胺、氟康唑、醋酸氟氢可的松、醋酸氟轻松、氟西汀、氟比洛芬、氟他胺、氟伏沙明、福辛普利钠、呋喃苯胺酸、加巴喷丁、氢溴酸加兰他敏、吉非贝齐、格列美脲、格列吡嗪、硫酸盐葡糖胺、格列本脲、氟哌啶醇、盐酸胼屈嗪、氢氯噻嗪、二酒石酸氢可酮(hydrocondone bitartrate)、硫酸羟氯喹、羟基脲、盐酸羟嗪、双羟萘羟嗪、吲哚美辛、异烟胼、酮康唑、酮洛芬、酮咯酸氨基丁三醇、盐酸拉贝洛尔、拉莫三嗪、 兰索拉唑、来氟米特、亚叶酸钙、左乙拉西坦、盐酸利多卡因、赖诺普利、盐酸洛哌丁胺、劳拉西泮、氯沙坦钾洛伐他汀、甲苯达唑、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美洛昔康、盐酸呱替啶、 巯嘌呤、氨水杨酸、盐酸二甲双胍、甲氨蝶呤、甲基多巴、甲泼尼龙、甲氧氯普胺、酒石酸美托洛尔、甲硝唑、甲硝唑、美西律、盐酸米洛环素、米氮平、米索前列醇、盐酸莫普利(moeipril HCl)、莫匹罗星、麦考酚酸酯、萘丁美酮、纳多洛尔、盐酸钠曲酮、萘普生、盐酸尼法唑酮、硫酸新霉素、尼克酸、硝苯地平、尼莫地平、尼扎替丁、醋酸炔诺酮、盐酸去甲替林、制霉菌素、 氧氟沙星、奥美拉唑、盐酸昂丹司琼、奥沙普秦、奥沙西泮、盐酸奥昔布宁、羟考酮、盐酸羟考酮、泮托拉唑钠、帕罗西汀、青霉素V钾、己酮可可碱、费尼基丝(phenylgesic)、吡罗昔康、 盐酸普拉克索、普伐他汀钠、盐酸哌唑嗪、泼尼松龙、马来酸丙氯拉嗪、盐酸普罗帕酮、盐酸丙氧芬、盐酸普萘洛尔、盐酸普罗替林、喹那普利、硫酸奎尼丁、雷米普利、盐酸雷尼替丁、利巴韦林、利培酮、盐酸罗匹尼罗、番泻叶多库脂钠、森那金(sermagen)、硝酸银、辛伐他汀、盐酸索他洛尔、硫糖铝、枸橼酸他莫昔芬、盐酸坦罗辛、盐酸特拉唑嗪、盐酸特比萘芬、盐酸四环素、茶碱、盐酸氯苄噻哌啶、托美丁钠、托吡酯、托拉塞米、盐酸曲马多、群多普利、盐酸曲唑酮、维甲酸、熊去氧胆酸、丙戊酸、盐酸万拉法新、盐酸维拉帕米、华法林钠、扎来普隆和酒石酸唑吡坦。合适的鼻用组合物包括例如鼻喷雾、抗偏头痛药物、肽药物(激素治疗)、麻醉药、止吐剂、镇静药、盐酸氮卓斯汀、盐酸羟甲唑啉、盐酸苯肾上腺素(pheynyl印hrine hydrochloride)、盐水溶液、糠酸莫米松、布地奈德、异丙托溴铵和色甘酸钠鼻喷雾。合适的眼用组合物包括例如利多卡因、丙美卡因、丁卡因、酮咯酸氨丁三醇滴眼液、酮咯酸氨丁三醇、萘甲唑林眼药、溴莫尼定、阿奇霉素、苯磺酸贝他斯汀、贝西沙星、盐酸左旋倍他洛尔、可速普特、二氟泼尼酯、露达舒、雷珠单抗、贝美前列素、他尼钠、氧氟沙星、 地塞米松、左氧氟沙星、乌诺前列酮滴眼液、环孢霉素眼用乳液、香碱、曲伏前列素滴眼液、 盐酸缬更昔洛韦、曲氟尿苷、西多福韦、维替泊芬、更昔洛韦玻璃体内植入剂、福米韦生和富马酸酮替芬滴眼液。本文所述方法可用任何适当装置或设备进行，可以手动或自动化。在一个优选方面，本方法用市售的密理弗快速微生物检测系统进行，该系统包括样品准备台、自动喷雾台、检测塔、图像分析仪、CCD相机和带有软件的计算机(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司)。另一方面，本发明是用本文所述方法筛选过活微生物的无菌药物组合物(例如疫苗、眼用组合物、鼻用组合物、口服组合物、胃肠外组合物)。
实施例产牛ATCCIf株禾Π来iΦ.^, .^mmMm(^iMaK^.^Aa^Mfe,^i勿负荷量禾n^ifi式验 似亏染)mwmm来自冷冻培养物(ATCC菌株)或直接来自平板(环境分离物)的微生物在胰蛋白酶大豆肉汤或固体培养基(例如沙氏葡萄糖琼脂(Sabouraud Dextrose agar))中培养适当时间。用MicroSeq系统(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行各菌株的基因型鉴定。然后，培养物以800x G离心20-30分钟并将沉淀重悬于保护培养基(含15% 甘油的0xoid-CM67)。稀释培养物，监测固体培养基上的CFU(菌落形成单位)并将其加入 2ml能克冻存管(Nunc Cryotube) 小瓶，_80°C保存。表1显示所用微生物的完整列表。表 1
酵母/霉菌革兰氏阳性孢子菌革兰氏阴性菌革兰氏阳性球菌革兰氏阳性杆菌黑曲霉 ATCC 16404枯草芽孢杆菌 ATCC 6633大肠杆菌 ATCC 8739金黄色葡萄球菌 ATCC 6538疮疱丙酸杆菌 HK-WST白色念珠菌 ATCC 10231地衣芽孢杆菌 HK-WST (2006)铜绿假单胞菌 ATCC 9027库克菌属 HK-WST非发酵棒杆菌 HK-WST青霉菌属 HK-WST生孢梭菌ATCC 11437洛菲不动杆菌 HK-WST (2005)表皮葡萄球菌 HK-WST克劳氏芽孢杆菌 HK-WST奥斯陆莫拉菌 HK-WST沃氏葡萄球菌 HK-WST短小芽孢杆菌 HK-WST头状葡萄球菌 HK-WST球形芽孢杆菌 HK-WST藤黄微球菌 HK-WST病研所芽孢杆菌 HK-WSTA.应激因子研究通过施加UV光Q40-250 μ ff/cm2)、热(50-70°C水浴)或在胃肠外药物系列稀释中各培养微生物1-10分钟，以便造成应激，每分钟取等分样品。应激肓接施加给100CFU以下范围的测试微生物液体悬浮液。通过CFU减少量监测应激效果，用平板计数方法和OD测
量法确定。平板计数将应激微生物接种于胰蛋白酶大豆肉汤，通过每分钟析出等分样品来监测应激的不同效果(应激施加1-10分钟，每分钟取等分样品)。2-7天后计数测定结果 (取决于菌株，例如在2天后计数测定最新的大肠杆菌和黑曲霉，疮疱丙酸杆菌计数测定不能早于培养后6天)。测量了引起CFU初始接种量减少量超过50%所需的确切时间。OD测量(λ = 600nm)测试微生物的过夜培养物首先受到应激(使用在彡50%减少量研究中确定的应激参数)，接种胰蛋白酶大豆肉汤或液体巯基醋酸盐培养基(约3- 106CFU/ml)并在长达8小时的时间框内分析(每小时取等分样品以测量光密度)。培养在摇床上进行(仅好氧菌株)。比较应激培养物与非应激培养物。50%减少量的应激因子研究结果对于22种菌株中的每一种微生物，测试了 3种应激参数。测量了引起CFU初始接种量减少超过50%所需的各应激因子确切参数(1和10分钟之间)。所测3种应激参数是 UV光、热和在用于胃肠外的胃肠外药品中的微生物培养。例如，热引起细胞质膜损伤，RNA变性且这导致一些细胞死亡。UV光引起突变和DNA复制停止(M. Mrus，Rocz PanstwZakl Hig. ,48(3) :263-268(1997))。给予胃肠外药品在微生物细胞中引起化学应激-长期以来已知胃肠外药品的抗微生物特性。图1-3给出了奥斯陆莫拉菌、大肠杆菌和洛菲不动杆菌所得数据的例子。对于22种微生物菌株中的每一种，发现了使初始接种量减少> 50%所需的应激参数。在一些情况中观察到菌落形态发生改变(菌落生长更慢，但稍后恢复正常菌落大小)。例如，藤黄微球菌显示菌落尺寸减小[图如和4b]。对于快速无菌试验的培养基评估，重要的是不仅使用广泛范围的微生物，而且使用处于应激状态的这些微生物。一些应激因子如由胃肠外药品引起的化学应激和施加UV 光引起的辐射应激，大幅减少接种微生物的量。相反，热处理导致一些测试微生物的初始生长率降低。据报道，热损伤细胞恢复时间为3-4小时-这在本研究中得到确认(EWarseck， Appl. Microbiol. ,26 :919-922 (1973))。热应激不可用于孢子菌，其它应激参数也不可行， 因为孢子菌显示针对应激的广泛抗性(P. Setlo, T. Appl. Microbiol. , 101 (3) :514-525综述Q006))。例如，短小芽孢杆菌用作辐射指示细菌(T. Wong, PDA T Pharm Sci Technol., 58(1) :6-14(2004))。在孢子菌的情况中，使用一种不同的“应激”因子-通过营养耗尽对其施加应激并因而诱导更高孢子含量。随后的营养培养基评估和统计学分析显示施乐血琼脂是用于无菌试验的最佳固体培养基。用于分析20-25°C与30-35°C有氧培养之间差异的t检验显示在温度间有显著差异。由于40种情况中有11种差异显著，所以需要在快速无菌试验中验证2种培养温度。OD 测量在>50%减少量研究中确定的应激参数用于各测试菌株。一直比较应激接种物与非应激接种物。微生物(约3- 106CFU/ml作为初始接种物)接种于胰蛋白酶大豆肉汤或液体巯基醋酸盐培养基并在摇床上30-35°C培养(仅好氧菌株)。每小时取等分样品并测量光密度U = 600nm)。不同处理的接种物(未处理、热处理、UV光处理、胃肠外药品处理，来自50%减少量实验的时间/参数)所得数据显示在OD测量数据的正态图中生长曲线稍有差异[图5]。数据的对数图[图6]显示热处理对大肠杆菌生长曲线的影响且使数据独立于接种量。由于这不易精确控制，对数图的优势就在于此。当细菌受到UV光或胃肠外药品处理 (使用50%减少量实验中确定的参数)应激时，没有观察到生长的显著差异。斜率比较显示仅热处理(参数如50%减少量实验所确定)对微生物生长率有影响且微生物显示实际应激。在培养基评估期间不使用UV光和胃肠外药品稀释(“杀伤因子” 而非“应激因子”)。通过使用直线和比较斜率最详细显示了生长率应激。所有微生物菌株在选择范围内显示生长斜率降低。本文所示例子是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和短小芽孢杆菌。在大肠杆菌的情况中，生长斜率减少约3小时，说明此微生物需要约3小时恢复[图7]。金黄色葡萄球菌显示生长斜率在4小时的时间框内减少[图8]。酵母白色念珠菌显示甚至更长的持续应激。生长斜率保持减少超过8小时，应激培养物过夜后恢复正常生长斜率[图9]。对于革兰氏阳性孢子菌，热应激不可行。由于其它应激因子UV光和胃肠外药品稀
12释不显示对微生物的应激效果，需要发现用于孢子菌的另外应激。对于芽孢杆菌和梭菌，激发细菌悬液中更高的孢子含量并进行OD测量[图10]。通过营养耗尽和在2-8°C保存过度生长的微生物培养物6天以上来形成孢子。以所述方式测试所有微生物。仅在3种情况中观察到困难。霉菌青霉菌和曲霉菌在液体培养基中以菌丝体生长，因此可能无法测定确切的0D。由于数据可用于白色念珠菌和所有测试微生物，只能假定青霉菌和曲霉菌表现方式相同。因此，取测试参数用于培养基评估。在另一种情况中，对于疮疱丙酸杆菌(此菌株在FTM中生长较好)，通过平板计数确定的减少> 50%的参数不能在OD测量实验中重现。相较来自> 50%减少量实验的参数， 仅在延长时间中省略应激时观察到生长的时间延迟。由于氧应激较高，疮疱丙酸杆菌可能在OD测量中显示不同结果。对于OD测量，每小时取等分样品，产生针对疫疱丙酸杆菌的一定氧应激。所得应激因子研究数据概括于表2。
权利要求
1.一种检测药物组合物中活微生物的方法，所述方法包括a)提供可过滤的药物组合物；b)过滤所述药物组合物以提供至少三个其上沉积所述药物组合物过滤渣的过滤膜；c)将所述至少三个过滤膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；d)i)在20-25°C有氧条件下培养至少一个滤渣培养物；ii)在30-35°C有氧条件下培养至少一个滤渣培养物和iii)在30-35°C厌氧条件下培养至少一个滤渣培养物；条件是所述滤渣培养物的培养期均不大于约13天；和e)检测膜上的活微生物细胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活微生物细胞、微菌落或菌落指示所述药物组合物中存在活微生物。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述b)还包括在过滤所述药物组合物后过滤洗液。
3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述膜是聚偏二氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚碳酸酯膜、聚对苯二甲酸乙二酯膜、混合纤维素酯(醋酸纤维素和硝酸纤维素)、磷酸纤维素膜、DEAE膜、尼龙网膜或聚四氟乙烯膜。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述膜具有约0.45 μ m的孔径。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体培养基选自FTM-A(含 1. 075%琼脂(终浓度)的液体巯基醋酸盐培养基)、BHI (脑心浸液琼脂)、蒂福科酿酒厌氧琼脂、R2A琼脂、施乐血琼脂、开索-琼脂ICR(胰蛋白酶大豆琼脂)、有5%血的哥伦比亚琼脂和⑶C厌氧血琼脂。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述d)中滤渣培养物的培养时间足以生成可检测量的ATP。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述滤渣培养物培养约2-7天。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述e)中活微生物细胞、微菌落或菌落用发光测定检测。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述发光测定检测所述膜上活微生物细胞、微菌落或菌落生成的三磷酸腺苷(ATP)。
10.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述发光测定包括萤光素酶测定。
11.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述发光测定检测探针与微生物内源核酸之间形成的核酸杂交产物。
12.如权利要求11所述方法，其特征在于，所述发光测定包括过氧化物酶反应。
13.如权利要求8到12中任一项所述方法，其特征在于，所述发光用电荷耦合器件相机和图像分析软件检测。
14.如权利要求8到13中任一项所述方法，其特征在于，对所述活微生物细胞、活微生物微菌落或活微生物菌落进行计数。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述药物组合物是液体组合物。
16.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述液体组合物是胃肠外组合物、口服组合物、鼻用组合物或眼用组合物。
17.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述液体组合物是疫苗。
18.如权利要求17所述方法，其特征在于，所述疫苗选自炭疽疫苗；结核病疫苗；疏螺旋体病疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素和百日咳疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳和乙型流感嗜血杆菌偶联物疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳和乙型流感嗜血杆菌偶联物及脊髓灰质炎病毒灭活疫苗；甲肝病毒疫苗；甲肝病毒和乙肝病毒疫苗；乙肝病毒疫苗；幽门螺杆菌疫苗；乙型流感嗜血杆菌疫苗；流感病毒疫苗；脊髓灰质炎病毒疫苗；脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)疫苗；麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒疫苗； 麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒和水痘病毒疫苗；肺炎球菌(肺炎链球菌)疫苗；狂犬病疫苗；呼吸道合胞病毒疫苗；天花疫苗；弓形虫病(刚地弓形虫)疫苗；伤寒(伤寒沙门菌) 疫苗；结核病(结核分枝杆菌)疫苗；水痘(鸡痘、水痘带状疱疹病毒)疫苗。
19.如权利要求17所述方法，其特征在于，所述疫苗是禽流感疫苗或猪流感疫苗。
20.一种检测药物组合物中活微生物的方法，所述方法包括a)提供可过滤的药物组合物；b)过滤所述药物组合物以提供至少三个其上沉积所述药物组合物滤渣的膜；c)将所述至少三个滤器/膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；d)i)在20-25°C有氧条件下培养至少一个滤渣培养物；ii)在30-35°C有氧条件下培养至少一个滤渣培养物和iii)在30-35°C厌氧条件下培养至少一个滤渣培养物；条件是所述滤渣培养物的培养期均不大于约13天；和e)检测所述膜上的三磷酸腺苷(ATP)，其中膜上存在ATP指示所述药物组合物中存在活微生物。
21.一种无菌药物组合物，其中所述药物组合物经过活微生物筛选，并用前述权利要求中任一项所述的方法确认无菌性。
全文摘要
本发明涉及一种检测药物组合物中活微生物的方法，包括步骤提供可过滤的药物组合物；过滤药物组合物以提供至少三个其上沉积药物组合物的膜，将三个膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物，在有氧和无氧条件下培养并检测活微生物细胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活细胞、微菌落或菌落指示药物组合物中存在活微生物。
文档编号C12Q1/22GK102414324SQ201080020162
公开日2012年4月11日 申请日期2010年5月4日 优先权日2009年5月4日
发明者A·斯泰克, J·C·格雷, M·贝希托尔德 申请人:诺华有限公司