专利名称：与rna对应的双链dna的合成方法以及扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种与特定RNA对应的双链DNA的合成方法以及对该DNA进行扩增的方法。
背景技术：
目前，进行RNA基因分析时，为获得全长的cDNA，经研究得到的方法包括SMART法、 Oligo-Capping法、Cap Trapper法等。但是，无论何种方法，如果不是具有polyA和Cap结构的RNA，存在着无法获得全长的cDNA，无法分析不包含Cap结构的RNA片段等的问题。另一方面，作为能够分析RNA片段的方法，人们熟知的有微阵列法，由于该方法需要高价的仪器，因此并不是容易用于实验阶段的方法。因此，人们期待开发一种对即使不具有Cap结构的RNA片段也能进行基因分析的、 操作简便且价格低廉的能够用于基因分析的新方法。
发明内容
发明要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种价格低廉且操作简便，由特定RNA来合成与其对应的双链DNA的方法以及扩增该双链DNA的方法。解决向题的技术手段鉴于上述情况，本发明的发明人注意到现在许多cDNA已建立数据库，即使不对全长的cDNA，而只要能够对部分片段进行分析的话，就能够从数据库中将cDNA确定出来， 由此对获得RNA的cDNA片段的方法以及利用了该cDNA片段的RNA基因分析进行了切实研究。其结果发现，以mRNA、源自mRNA片段等具有polyA的RNA为模板，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)引物，合成第1链后，在不具有3’一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用添加有衔接子的随机引物，从第1链合成第2链，由此，能够价格低廉且操作简便地获得与具有PolyA的RNA相对应的cDNA片段，进而完成本发明。本发明涉及“含有与具有polyA的RNA相对应的碱基序列的双链DNA的合成方法， 其特征在于包括，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)引物，对具有polyA的模板RNA进行逆转录反应，得到单链DNA的工序1 ；以及，在不具有3’一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的随机引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链DNA的工序2。”和“含有与具有polyA的模板RNA相对应的碱基序列的双链DNA的扩增方法，其特征在于包括，使用5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子-1)的寡聚(dT)引物，对具有polyA的RNA进行逆转录反应， 得到单链的工序1 ；在不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子-2)的寡聚(dT)引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链DNA的公序2 ；以及，利用3’末端含有衔接子-1碱基序列的引物1和3’末端含有衔接子-2碱基序列的引物2，以工序2中得到的双链DNA为模板，进行PCR反应的工序3”。发明效果根据本发明的方法，尽管具有polyA的模板RNA是序列未知的RNA，但是，能够获得含有对应(互补的)碱基序列的双链DNA。即，本发明的方法能够获得用现有的方法难以获得的、不具有Cap结构的RNA片段所对应的双链DNA。此外，该法无需使用微阵列法那样昂贵的仪器就能够获得与具有PolyA的RNA相对应的双链DNA。因此，根据本发明的方法，能够操作简便且价格低廉地进行RNA的基因分析。具体地说，通过对由本发明的方法获得的双链DNA的序列进行分析，并与公知的基因数据库进行比较，就能够操作简便且价格低廉地鉴定模板RNA。进一步，根据本发明的扩增方法，尽管具有POlyA的RNA是微量的，但也能够得到克隆可能的量的DNA。此外，由于得到的双链DNA的链长不依赖于具有polyA的RNA的链长，所以相对于样品中的总RNA在维持具有polyA的RNA的存有比率的情况下，就能够进行扩增，并能够应用于RNA的定量分析。附图简要说明
图1为本发明示例所示的双链DNA扩增方法的模式图。图2为对由实施例1的6.的菌落PCR得到的同一克隆的3种菌落的插入片段，进行电泳后的凝胶成像照片。图3为实施例4中以小鼠精巢作为样品，使用小鼠抗PIWILl作为固定化载体，由免疫沉淀法得到RNA，并以该RNA为模板，使用本发明的方法合成DNA，利用安捷伦2100生物分析仪(Agilent 2100 Bioanalyzer)对该合成的DNA进行毛细管电泳的结果图。图4为实施例4中以小鼠精巢作为样品，使用小鼠抗IgG抗体固定化载体，由免疫沉淀法得到RNA，并以该RNA为模板，使用本发明的方法合成DNA，利用安捷伦2100生物分析仪对该合成的DNA进行毛细管电泳的结果图。发明的实施形式本发明所述的具有polyA的模板RNA(以下，有时也简称为本发明所述的模板 RNA)，只要为具有polyA的RNA，就无特别限制，具体地，例如可以列举为信使-RNA (mRNA)、 非编码RNA(non-coding RNA) ,Alu RNA等。此外，本发明所用模板RNA不仅可以为这些RNA 的片段，也可以是不具有Cap结构的RNA。而且，含有与这样的缺乏Cap结构的RNA相对应的碱基序列的双链DNA的合成方法，用微阵列法以外的现有方法都很难合成双链DNA，但利用本发明的方法，即使是上述的RNA，也能够简单地合成与之相对应的双链DNA。本发明所述的模板RNA可以为已知序列也可以为未知序列，即使是未知序列也能够合成或扩增与之相对应的双链DNA，这是本发明的效果之一。本发明所述的模板RNA的链长，一般为30个碱基以上 1500个碱基，优选为30 1000个碱基，更优选为30 100个碱基，进一步优选为30 50个碱基。通过本发明的双链DNA的合成方法制得的双链DNA，由含有与本发明所述的模板 RNA对应的碱基序列一部分的单链DNA和与该单链DNA相对应的单链DNA组成。含有与具有polyA的RNA相对应的碱基序列的双链DNA的合成方法含有与具有polyA的RNA相对应的碱基序列的双链DNA的合成方法(以下，有时也简称为“本发明的双链DNA的合成方法”)，其特征在于，由以下工序组成
1)使用5’末端添加已知序列的DNA片段(以下，有时也简称为“衔接子_1”)的寡聚(dT)引物，对本发明所述的模板RNA进行逆转录反应，得到单链DNA的工序1 ；2)在不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的随机引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链DNA的工序2。可以使用本领域经常使用的公知方法，进行上述工序1，使用添加有衔接子-1的寡聚(dT)引物，对本发明所述的具有polyA的模板RNA，进行逆转录反应，由此得到含有与本发明所述的模板RNA互补的碱基序列的单链DNA。可以使用市售的试剂盒进行上述操作， 也可以使用例如核酸研究(Nucleic Acids Research), 1988. Vol. 16, No. 5 1999-2014、核酸研究，1988. Vol. 16,No. 1 265-277记载的方法。具体地例如可以为，在模板RNA中，加入添加有衔接子-1的寡聚(dT)引物、逆转录酶、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNIPs)的混合物，在Tris缓冲液(pH 8. 3)等的缓冲液中，于温度一般为35 50°C，优选为40 50°C的条件下进行反应，时间一般为5 40分钟，优选为5 20分钟。然后，进行加热处理或加入反应停止液终止反应。由此，即可得到与本发明所述的模板RNA互补的单链DNA。此时所用的本发明所述的模板RNA的量，可以根据所用样品进行调整，无特别限制，本发明所述的模板RNA的核酸量一般为Ing 1 μ g。例如当使用总RNA时，其样品量一般为IOOng 50 μ g，优选为1 20 μ g。而且，这些RNA通常使上述核酸量包含在溶液中而用于上述工序，其溶液量一般为1 30 μ L，优选为1 20 μ L。作为含有这样的RNA 的样品溶液的溶剂通常使用经过灭菌的蒸馏水。上述寡聚(dT)引物只要是与polyA结合的引物，就无特别限制，一般可以使用本领域经常使用的各种引物。具体地，可以为10 lOOmer，优选为10 50mer，更优选为15 30mero而且，寡聚(dT)引物添加的已知序列的DNA片段，可以是能够作为衔接子使用的物质，一般为10 50mer，优选为12 40mer，更优选为15 30mer。添加有衔接子_1的寡聚(dT)弓丨物的用量，相对于Iyg模板RNA核酸量，可以含有1 250pmol，优选为10 50pmolο上述逆转录反应中使用的逆转录酶，只要是本领域经常使用的逆转录酶，就无特别限制，例如可以列举为莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus、M-MLV) 逆转录酶、禽成髓细胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus、AMV)逆转录酶、M-MLV 逆转录酶(RNase H minus)等，其中优选为M-MLV逆转录酶(RNase H minus)。另外，各种酶的用量根据所使用的酶的种类不同而各异，相对于Iyg模板RNA核酸量，可以含有1 400个单位，优选为10 200个单位。上述dNTPs，是本领域经常使用的4种三磷酸脱氧核糖核苷酸的混合物，其使用量，相对于ι μ g模板RNA核酸量，一般为0. 1 20nmol，优选为1 IOnmol。上述反应终止液例如可以列举为含有EGTA、EDTA等螯合剂的物质，其使用量根据螯合剂种类的不同而各异，按照最终浓度一般为10 lOOmmol/L，优选为40 60mmol/L进行添加。此外，使反应终止的加热处理，在温度一般为65 100°C，优选为65 70°C条件下进行，时间一般为 15 60分钟，优选为15 30分钟。通常，在上述逆转录反应中，也可加入进行这样的逆转录反应时常用的DTT(二硫苏糖醇)等还原剂、氯化钾、氯化镁、核糖核酸酶抑制剂等试剂， 这些试剂的浓度以及用量可以在本领域经常使用的范围中进行适宜选择。
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上述工序1中，该工序结束后，优选除去本发明所述的模板RNA，对得到的单链DNA 进行纯化。具体地，例如可以对工序1逆转录反应后的溶液进行碱处理，或者进行RNaseH 处理。上述碱处理例如可以为，将碱或其水溶液添加到逆转录反应后的溶液中，使反应溶液变为碱性。所用的碱例如可以列举为氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物，氢氧化钡、氢氧化镁、氢氧化钙等碱土金属的氢氧化物，碳酸钠等碱金属的碳酸盐，铵盐，酰胺类等。其中优选使用氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物，特别优选使用氢氧化钠。进行碱处理时， 具体地，该溶液的pH为10 14，优选为12 14，处理时间通常为20 120分钟，优选为 20 60分钟，加热温度通常为50 80°C，优选为60 70°C。进行上述RNaseH处理时，向逆转录反应后的溶液中加入RNaseH，将本发明的模板RNA与进行逆转录反应得到的对应的 DNA进行分离，然后使用本领域通常的分离柱进行纯化。这里使用的RNaseH可以为本领域经常使用的任意一种RNaseH，既可以使用根据公知的方法进行配制的RNaseH，也可以使用市售的RNaseH产品。此外，所使用RNaseH的用量只要为本领域经常使用的范围，就无特别限制。工序2为在不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，将工序1中得到的单链DNA，使用5’末端添加已知序列的DNA片段(以下，有时也简称“衔接子-2”)的随机引物，进行双链化反应，由此，得到含有与本发明所述的模板RNA对应的碱基序列的双链DNA。该工序2，具体地，例如可以为，将5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子-2)的随机引物，不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶，含有4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNIPs)的混合物添加到工序1得到的含有单链DNA的溶液中，并通常在90 98°C反应1 15分钟，在20 40°C反应10秒 5分钟，在65 75°C反应10 秒 10分钟。工序2中使用的随机引物的链长，一般为5 15mer，但当其为6mer以下而进行 PCR时，随机引物与PCR引物有退火的可能性，而当其为13mer以上时，随机引物相互之间退火的可能性变高，因此，优选为7 12mer，更优选为9 12mer。具体地，B代表C (胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)，N代表A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)时，例如可以列举为 12N、11N、10N、9N、8N、7N、14N1B、13N1B、11N1B、10N1B、9N1B、 8N1B，优选为 12N、11N、10N、9N、11N1B、10N1B、9N1B、8N1B 等，其中特别优选为 11N1B、10N1B、 9N1B、12N、11N。添加到随机引物的已知序列的DNA片段(衔接子_2)，只要是能够作为衔接子的物质即可，其链长可以为10 50mer，优选为12 40mer，更优选为15 30mer。添加了衔接子-2的随机引物的用量，相对于1 μ g模板RNA核酸量，可以为1 250pmol，优选为 10 50pmol ο工序2中使用的不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶，只要为不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性这两种活性的聚合酶即可，具体地，例如可以列举为TaqDNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等，其中优选为TaqDNA聚合酶。工序2中，作为聚合酶，若使用既有3’ 一5’核酸外切酶活性又有链置换活性的聚合酶，则由于该链置换活性， 随机引物退火到DNA上并延伸而得到的核苷酸链发生游离。其结果，由于随机引物退火到游离后的核苷酸链上，因此会合成多种DNA。但是，若使用不具有3’ 一5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶，由于退火到DNA上并延伸的随机引物不会发生游离，因此能够高效率地合成本发明的双链DNA。不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的用量，根据所使用的酶的种类不同而各异，相对于IOOpg IOOng的本发明的模板DNA的核酸量，可以为1 10个单位，优选为1 5个单位。工序2中使用的4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNIPs)的混合物，与上述工序1中使用的核苷酸混合物相同，只要是本领域经常使用的核苷酸混合物即可。其用量，相对于 IOOpg IOOng的模板DNA的核酸量，通常为0. 1 20nmol，优选为1 lOnmol。工序2的双链化反应，通常按如下顺序进行反应，在90 98°C反应1 15分钟， 在20 40°C反应10秒 5分钟，在65 75°C反应10秒 10分钟。优选为在94 96°C 反应1 10分钟，在25 35°C反应1 3分钟，在68 72°C反应30秒 2分钟。只要含有上述条件，即使阶段性地改变温度也无妨。即，也可以按照如下顺序进行，在90 98°C 反应1 15分钟，在25 35°C反应10秒 5分钟，在35 45°C反应10秒 5分钟，在 45 55°C反应10秒 5分钟，在55 65°C反应10秒 5分钟，在65 75°C反应10秒 10分钟。下面对上述本发明的双链DNA的合成方法的优选例子进行说明。S卩，首先向例如10 μ L核酸用量为1 20ng的具有polyA的模板RNA的溶液中， 加入1 5 μ L含有10 50 μ mol/L的5’末端添加有已知序列的寡聚(dT)引物的溶液， 以及1 5μ L含有10 200个单位/μ L的逆转录酶的溶液，在40 50°C反应10 60 分钟，而得到与模板RNA互补的单链DNA。然后，向含有与模板RNA互补的单链DNA的溶液中，加入例如氢氧化钠等碱金属氢氧化物，将反应液的PH值调节至12 14，在60 70V 反应30 60分钟，使残留的RNA分解。接下来，通过采用例如柱分离等提取方法的纯化方法等将得到的单链DNA进行纯化，由此，能够得到本发明的、含有与模板RNA互补的碱基序列的单链DNA。进一步，向例如10 μ L含有所得到的本发明的单链DNA的溶液中，加入1 5 μ L5 ~ 20 μ mol/L的在5’末端添加了已知序列的DNA片段的随机引物，1 5 μ L各浓度为1 5mmol/L的4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)的混合溶液，1 5个单位不具有 3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶，通过如下反应，例如(1)93 98°C、1 10分钟一(2)25 35°C、30秒 5分钟，(3)68 72°C、1 5分钟，即能够得到本发明的双链DNA。然后，也可采用例如柱分离将制得的本发明所述的双链DNA进行提取、纯化。对含有与具有polyA的RNA相对应碱基序列的双链DNA的扩增方法本发明所述的、对含有与具有polyA的RNA相对应碱基序列的双链DNA的扩增方法(以下，有时也简称为“本发明的双链DNA的扩增方法”)，其特征在于包括以下工序1)使用5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子_1)的寡聚(dT)引物，对具有 polyA的模板RNA进行逆转录反应，得到单链DNA的工序1 ；2)在不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子-2)的随机引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链DNA的工序2 ；以及3)使用3’末端含有衔接子-1碱基序列的引物-1和3’末端含有衔接子_2碱基序列的引物_2，以工序2得到的双链DNA为模板，进行PCR反应的工序3。上述工序1和工序2，与上述本发明的双链DNA的合成方法中的工序1和工序2相同，其优选操作方法也相同。即，将经过上述工序1和工序2制得的本发明的双链DNA用于工序3，就能够对含有与本发明模板DNA相对应的碱基序列的双链DNA进行扩增。上述工序3如下所述。S卩，首先制备以3’末端含有衔接子-1(本发明所述的添加到寡聚(dT)引物的已知序列的DNA片段)的方式设计出的引物1以及以3’末端含有衔接子-2(本发明所述的添加到随机引物的已知序列的DNA片段)的方式设计出的引物2，利用引物-1、引物-2以及不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶，将工序2中制得的双链DNA进行PCR反应。上述的引物1，含有衔接子-1的全部或部分序列，其链长可以为12 30mer，优选为15 25mer，更优选为18 22mer。上述的引物2，含有衔接子-2的全部或部分序列，其链长可以为12 30mer，优选为15 25mer，更优选为18 22mer。这些引物_1和引物 2的用量，相对于工序2得到的双链DNAlOpg lOOng，可以为1 250pmol，优选为10 50pmolο工序3所用的不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶，可以列举与工序2所用的聚合酶相同的聚合酶，其优选用量也相同。此外，本发明的扩增方法中，工序2和工序3中，通过使用不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶，很难合成链长不同的双链DNA，因此，在维持本发明所述的模板RNA在总RNA中的存有比率的情况下，就使扩增双链DNA成为可能。上述PCR反应，可以使用本领域公知的方法，如核酸研究，1991. Vol. 19，3749、生物技术(BioTechniques)，1994. Vol. 16，1134-1137记载的方法进行，具体内容如下所述。 即，例如，向利用Ing IOOng模板RNA并经工序1和工序2制得的20 40 μ L含有本发明所述的双链DNA的水溶液中，加入上述引物1，一般为0. 1 lOOpmol，优选为0. 1 50pmol ；上述引物2，一般为0. 1 lOOpmol，优选为0. 1 50pmol ；4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)，一般分别为0.01 50nmol，优选为0. 1 20nmol ；1 5个单位不具有 3’ 一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶。在Tris盐酸缓冲液等的缓冲液中，例如在 (1)93 98°C、1 10 分钟—(2)93 98°C、10 30 秒—50 60°C、10 30 秒—68 720C、10 30分钟(10 30个循环)，(3) 68 72°C、1 5分钟，进行循环反应，即能够扩增本发明所述的双链DNA。上述PCR反应结束后，采用本领域经常使用的纯化方法，例如， 优选使用苯酚/氯仿/异戊醇混合溶液进行提取，通过乙醇沉淀、分离柱纯化、过滤器过滤等方法进行纯化。再者，下述图1为，本发明一个示例所示的双链DNA的扩增方法的模式图。如上所述，对本发明的双链DNA的合成方法以及扩增方法得到的本发明的双链 DNA，可以使用国家科学院论文集(Proceedings of the National Academy of Science), 1995,Vol 92,4347-4351等记载的本领域经常使用的方法进行碱基序列分析。具体来说例如，将使用克隆用试剂盒得到的双链DNA转化入感受态细胞等之后进行培养，通过菌落PCR 进行扩增。然后，对质粒进行分离，以得到的质粒为模板，使用试剂盒等对碱基序列进行分析，使用分析的碱基序列进行同源性检索，以进行RNA的鉴定。下面通过实施例和参考例对本发明进行更为详细的说明，但本发明不局限于这些实施例。实施例实施例1对3种mRNA(人白蛋白、β肌动蛋白、GAPDH)的克降1.逆转录反应将分别含有IXlO9拷贝的人白蛋白(2122个碱基)、β肌动蛋白(1874个碱基)、 以及GAPDH(1380个碱基)的mRNA(日本基因公司(NIPPON GENE CO.，LTD.)生产)水溶液11 μ L，作为模板RNA水溶液。向该水溶液中加入1 μ L20 μ mol/L的逆转录用引物溶液 (5，-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，)。接着，70°C 加热 3 分钟，使其热变性后，在冰浴中静置2分钟。然后，加入2yL逆转录反应用缓冲液(含有750mmol/L 氯化钾，30mmol/L氯化镁，50mmol/L二硫苏糖醇的500mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH 8. 3))， 4 μ L dNTPs (分别为2. 5mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP溶液的混合液，日本基因公司生产)，1 μ L核糖核酸酶抑制剂(20个单位/ μ L，和光纯药工业(株)生产的Ribonuclease Inhibitor(Super))溶液、IyL逆转录酶QOO个单位/ μ L，和光纯药工业(株)生产的 Rever Script IV )溶液，在冰冷状态下缓慢混合。42°C反应10分钟后，加入2 μ L 0. 5mol/ L EDTA进行混合，停止反应。2.碱处理向反应停止后的溶液中，加入8μ L 0. anol/L的NaOH混合，65°C加热30分钟后， 在冰浴中静置2分钟。接下来，加入20 μ L lmol/L的TriS-HCl (pH 7.5)进行混合后，利用 Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生产)除去未反应的逆转录反应引物。然后，分别加入:1 μ L乙醇沉淀核酸载体(Ethachinmate)(日本基因公司生产)，12 μ L 10mol/L醋酸铵，125 μ L乙醇，进行混合。接着，离心分离10分钟(18800 Xg)，75%乙醇洗涤2次，沉淀，干燥后，溶解在35. 5 μ L灭菌水中。3.第2链合成反应向35. 5 μ L含有逆转录反应产物的水溶液中，分别加入5 μ L Ho tGoldstar DNA 聚合酶用 10X 反应缓冲液(Reaction Buffer,EUR0GENTEC 公司生产)，4μ L 各 2. 5mmol/L 的dNTP混合物(日本基因公司生产)，lyL 20 μ mol/L第2链合成用随机引物溶液(5’-CA TGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB-3，，B 为 C、G、或 T，N 为 A、C、G 或 T)，4 μ L 25mmol/ L氯化镁，0. 5 μ L HotGoldstar DNA聚合酶(5U/ μ L, EUR0GENTEC公司生产)，在冰浴中缓慢混合，按照如下条件进行第2链合成反应95 0C 10 分钟一30 0C 1 分钟一40 °C 30 秒一50 °C 30 秒一60 °C 30 秒一72 °C 2 分钟 —95°C 1分钟一冰浴2分钟。然后，利用Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生产)，从得到的溶液中除去未反应的第2链合成用引物。之后，分别加入1 μ L乙醇沉淀核酸载体(日本基因公司生产)，12yL 1011101/1醋酸铵，125111^乙醇，进行混合。接着，离心分离10分钟(18800 X g)， 75%乙醇洗涤2次，沉淀，干燥后，溶解在34. 5 μ L灭菌水中。4. PCR向34. 5μ L由3.得到的水溶液中，分别加入5μ LHotGoldstar DNA聚合酶用 10Χ反应缓冲液(EUR0GENTEC公司生产)，4yL 2. 5mmol/L dNTP混合物(日本基因公司生产)，1 μ L PCR 引物溶液(含有 20 μ mol/L、5，-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3，或者 5，-GACCATATGACGAGATCCGAG-3，)，4 μ L25mmol/L 氯化镁，0. 5 μ L HotGoldstar DNA 聚合酶
9(5U/ μ L EUR0GENTEC公司生产)，在冰浴中缓慢混合，按照如下条件进行PCR反应950C 10 分钟一950C 20 秒· 60°C 10 秒· 72°C 30 秒 Q4 个循环)—72°C 2 分钟。然后，利用hvisorb Spin PCRapid Kit Qnvitek公司生产)，从得到的溶液中除去未反应的逆转录反应引物。之后，分别加入IyL乙醇沉淀核酸载体(日本基因公司生产)，12 μ L 10!1101/1醋酸铵、125 4 1^乙醇，进行混合。接下来，离心分离10分钟 (18800 Xg),75%乙醇洗涤2次，将沉淀物干燥后，溶解在4 μ L灭菌水中。5.转化向2yL由4.制得的含有克隆用cDNA的溶液中，加入IyL 20ng/yL的pGEM Teasy Vector (Promega 公司生产)禾口 3 μ L DNA Ligation Kit Mighty Mix(TAKARA BIO(株)生产)溶液，16°C反应30分钟，将克隆用cDNA插入载体中。然后，使用EC0S Competent Ε. coli DH5 α (日本基因公司生产)，通过42°C下45秒的热休克法将上面所得物全部转化入感受态细胞。接下来，在含有100 μ g/mL氨苄西林钠的Luria-Bertani ’ s broth (LB)琼脂培养基中，37°C培养16小时。6.菌落 PCR将培养基上单一的48个菌落的每个的一部分，加入到白蛋白cRNA扩增用反应液 [全量 10yL:lyL IOXUniversal Buffer (日本基因公司生产)，1 μ L2. 5mM dNTPs (分别为2. 5mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP溶液的混合液(日本基因公司生产)，各1 μ L 5 μ mol/L 的两种引物溶液(5，-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3，、5，-GAAGCACAGAGAAAAGAGGCAA AATG_3，)，5. 9“1^灭菌水，0. IyL Gene Taq NT (5个单位/ μ L、日本基因公司生产)]中，在冰浴中缓慢混合，按照如下条件进行PCR反应95 0C 2 分钟一95 0C 20 秒· 58 °C 10 秒· 72 °C 20 秒(30 个循环)一72°C 1 分钟。此外，对于同一 48个菌落，对β肌动蛋白以及GAPDH同样进行PCR反应。但是，β肌动蛋白的反应溶液(全量10 μ L)、除所用引物为β肌动蛋白扩增用引物 (5，-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3\5‘ -GTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC-3，)之外，其他条件与扩增白蛋白时相同。另外，GAPDH的反应溶液(全量10yL)、除所用引物为GAPDH扩增用引物(5，-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3 \ 5 ‘ -GAGCACAGGGTACTTTATTGATGG-3，)之外，其他条件与扩增白蛋白时相同。然后，向制得的各PCR反应液中加入2μ L 6 X Loading Buffer Triple Dye (日本基因公司生产)，进行混合。7.电泳将5μ L由6.制得的溶液，进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，在0. 5 μ g/mL溴乙啶染色液中浸泡10分钟后，使用FAS- III (紫外照射机东洋纺织)确认各菌落插入片段的种类。 3种克隆PCR扩增产物在第1 3泳道的电泳结果如图2所示。结果表明，菌落1为源自 GAPDH的插入片段，菌落2为源自β肌动蛋白的插入片段，菌落3为源自白蛋白的插入片段。而且，对于48菌落，判断它们到底属于3种mRNA的哪一种的判断结果如表1所示。[表 1]mRNA菌落数白蛋白15β肌动蛋白19GAPDH14总计48结果表明，β肌动蛋白白蛋白GAPDH= 19 15 14。由此，3种mRNA的比值在1 1 1左右，由此判定，在反映mRNA的存有比率的情况下进行扩增。S卩，通过本发明的方法得到的双链DNA，在维持其存在比率的情况下便可进行扩增。此外，实施例1所用的mRNA的碱基序列如下所示。白蛋白mRNA，Human (日本基因公司生产)GGGUUUAGCUUUUCUCUUCU⑶CAACCCCACACGCCUUUGGCACAAUGAAGUGGGUAACCUUUAUUUCCCUUCUUUUUCUCUUUAGCUCGGCUUAUUCCAGGG ⑶⑶⑶ UUCGUCGAGAUGCACACAAGA ⑶ GAG⑶UGCUCAUCGGUUUAAAGAUUUGGGAGAAGAAAAUUUCAAAGCCUUGGUGUUGAUUGCCUUUGCUCAGUAUCUUCAGCAGUGUCCAUUUGAAG⑶CAUGUAAAAUUA⑶GAAUGAAGUAACUGAAUUUGCAAAAACAU ⑶⑶ UGCUGAUGA ⑶ CAGCUGAAAAUU ⑶ GACAAAUCACUUCAUACCCUUUUUGGAGACAAAUUAUGCACA⑶UGCAACUCUUC⑶GAAACCUAUG⑶GAAAUGGCUGACUGCUGUGCAAAACAAGAACCUGAGAGAAAUGAAUGCUUCUUGCAACACAAAGAUGACAACCCAAACCUCCCCCGAUUG⑶GAGACCAGAGGUUGAU⑶GAUGUGCACUGCUUUUCAUGACAAUGAAGAGACAUUUUUGAAAAAAUACUUAUAUGAAAUUGCCAGAAGACAUCCUUACUUUUAUGCCCCGGAACUCCUUUUCUUUGCUAAAAGGUAUAAAGCUGCUUUUACAGAAUGUUGCCAAGCUGCUGAUAAAGCUGCCUGCCUGUUGCCAAAGCUCGAUGAACUUCGGGAUGAAGGGAAGGCUUC ⑶ CUGCCAAACAGAGACUCAA ⑶⑶ GCCAGUCUCCAAAAAUUUGGAGAAAGAGCUUUCAAAGCAUGGGCAGUAGCUCGCCUGAGCCAGAGAUUUCCCAAAGCUGAGUUUGCAGAAGUUUCCAA⑶UA⑶GACAGAUCUUACCAAAGUCCACACGGAAUGCUGCCAUGGAGAUCUGCUUGAAUGUGCUGAUGACAGGGCGGACCUUGCCAAGUAUAUCU⑶GAAAAUCAAGAUUCGAUCUCCAGUAAACUGAAGGAAUGCU⑶GAAAAACCUCU⑶UGGAAAAAUCCCACUGCAUUGCCGAAGUGGAAAAUGAUGAGAUGCCUGCUGACUUGCCUUCAUUAGCUGCUGAUUUUGUUGAAAGUAAGGAUGUUUGCAAAAACUAUGCUGAGGCAAAGGAUGUCUUCCUGGGCAUGUUUUUGUAUGAAUAUGCAAGAAGGCAUCCUGAUUACUCU⑶CGUGCUGCUGCUGAGACUUGCCAAGACAUAUGAAACCACUCUAGAGAA⑶GCUGUGCCGCUGCAGAUCCUCAUGAAUGCUAUGCCAAA ⑶⑶ UCGAUGAAUUUAAACCUCUUGUGGAAGAGCCUCAGAAUUUAAUCAAACAAAAUU⑶GAGCUUUUUGAGCAGCUUGGAGAGUACAAAUUCCAGAAUGCGCUAUUA ⑶ UC ⑶ UACACCAAGAAAGUACCCCAA ⑶⑶ CAACUCCAACUCUUGUAGAG ⑶ CUCAAGAAACCUAGGAAAAGUGGGCAGCAAAU⑶UGUAAACAUCCUGAAGCAAAAAGAAUGCCCUGUGCAGAAGACUAUCUAUCC ⑶ GGUCCUGAACCA ⑶ UAU ⑶⑶⑶ UGCAUGAGAAAACGCCAGUAA ⑶ GACAGA ⑶ CACCAAAUGCUGCACAGAAUCCUUG⑶GAACGGGCGACCAUGCUUUUCAGCUCUGGAAGUCGAUGAAACAUACGUUCCCAAAGAGUUUAAUGCUGAAACAUUCACCUUCCAUGCAGAUAUAUGCACACUUUCUGAGAAGGAGAGACAAAUCAAGAAACAAACUGCACUUGUUGAGCUU⑶GAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGA
GCAACUGAAAGCU⑶UAUGGAUGAUUUCGCAGCUUUUGUAGAGAA⑶GCUGCAAGGCUGACGAUAAGGAGACCUGCUUUGCCGAGGAGGGUAAAAAACUUGUUGCUGCAA⑶CAAGCUGCCUUAGGCUUAUAACAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAAAGCUUAUUCAUCU⑶UUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCU⑶GCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAAUCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGGβ肌动蛋白mRNA，Human (日本基因公司生产)GGGUUUACCGCCGAGACCGCGUCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCUCGCCUUUGCCGAUCCGCCGCCCGUCCACACCCGCCGCCAGCUCACCAUGGAUGAUGAUAUCGCCGCGCUC⑶CGUCGACAACGGCUCCGGCAUGUGCAAGGCCGGCUUCGCGGGCGACGAUGCCCCCCGGGCCGUCUUCCCCUCCAUCGUGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGC⑶GAUGGUGGGCAUGG⑶CAGAAGGAUUCCUAU⑶GGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCAUCCUCACCCUGAAGUACCCCAUCGAGCACGGCAUC⑶CACCAACUGGGACGACAUGGAGAAAAUCUGGCACCACACCUUCUACAAUGAGCUGCGUGUGGCUCCCGAGGAGCACCCC⑶GCUGCUGACCGAGGCCCCCCUGAACCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAUGACCCAGAUCAU⑶UUGAGACCUUCAACACCCCAGCCAUGUACGUUGCUAUCCAGGCU⑶GCUAUCCCUGUACGCCUCUGGCCGUACCACUGGCAUC⑶GAUGGACUCCG⑶GACGGG⑶CACCCACACUGUGCCCAUCUACGAGGGGUAUGCCCUCCCCCAUGCCAUCCUGCGUCUGGACCUGGCUGGCCGGGACCUGACUGACUACCUCAUGAAGAUCCUCACCGAGCGCGGCUACAGCUUCACCACCACGGCCGAGCGGGAAAUC⑶GC⑶GACAUUAAGGAGAAGCUGUGCUACGUCGCCCUGGACUUCGAGCAAGAGAUGGCCACGGCUGCUUCCAGCUCCUCCCUGGAGAAGAGCUACGAGCUGCCUGACGGCCAG⑶CAUCACCAUUGGCAAUGAGCGGUUCCGCUGCCCUGAGGCACUCUUCCAGCCUUCCUUCCUGGGCAUGGAGUCCU⑶GGCAUCCACGAAACUACCUUCAACUCCAUCAUGAA ⑶⑶ GACGUGGACAUCCGCAAAGACCUGUACGCCAACACA ⑶ GCUGUCUGGCGGCACCACCAUGUACCCUGGCAUUGCCGACAGGAUGCAGAAGGAGAUCACUGCCCUGGCACCCAGCACAAUGAAGAUCAAGAUCAUUGCUCCUCCUGAGCGCAAGUACUCCGUGUGGAUCGGCGGCUCCAUCCUGGCCUCGCUGUCCACCUUCCAGCAGAUGUGGAUCAGCAAGCAGGAGUAUGACGA⑶CCGGCCCCUCCAUCGUCCACCGCAAAUGCUUCUAGGCGGACUAUGACUUAGUUGC⑶UACACCCUUUCUUGACAAAACCUAACUUGCGCAGAAAACAAGAUGAGAUUGGCAUGGCUUUAUUUGUUUUUUUU⑶UUUGUUUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGCUUGACUCAGGAUUUAAAAACUGGAACG⑶GAAG⑶GACAGCA⑶CG⑶UGGAGCGAGCAUCCCCCAAAGUUCACAAU⑶GGCCGAGGACUUUGAUUGCACAUU⑶UGUUUUUUUAAUA⑶CAUUCCAAAUAUGAGAUGCGUU⑶UACAGGAAGUCCCUUGCCAUCCUAAAAGCCACCCCACUUCUCUCUAAGGAGAAUGGCCCAGUCCUCUCCCAAGUCCACACAGGGGAG⑶GAUAGCAUUGCUUUCGUGUAAAUUAUGUAAUGCAAAAUUUUUUUAAUCUUCGCCUUAAUACUUUUUUAUUUU⑶UUUAUUUUGAAUGAUGAGCCUUCGUGCCCCCCCUUCCCCCUUUUUU⑶CCCCCAACUUGAGAUGUAUGAAGGCUUUUG⑶CUCCCUGGGAGUGGGUGGAGGCAGCCAGGGCUUACCUGUACACUGACUUGAGACCAGUUGAAUAAAAGUGCACACCUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGGGGCGAPDH mRNA, Human(日本基因公司生产)GGGUUUAAAUUGAGCCCGCAGCCUCCCGCUUCGCUCUCUGCUCCUCCU⑶UCGACA⑶CAGCCGCAUCUUCUUUUGCGUCGCCAGCCGAGCCACAUCGCUCAGACACCAUGGGGAAG⑶GAAG⑶CGGA⑶CAACGGAUUUG⑶CGUAUUGGGCGCCUG⑶CACCAGGGCUGCUUUUAACUCUGGUAAAGUGGAUAUUGUU
12
GCCAUCAAUGACCCCUUCAUUGACCUCAACUACAUGGUUUACAU⑶UCCAAUAUGAUUCCACCCAUGGCAAAUUCCAUGGCACC⑶CAAGGCUGAGAACGGGAAGCUU⑶CAUCAAUGGAAAUCCCAUCACCAUCUUCCAGGAGCGAGAUCCCUCCAAAAUCAAGUGGGGCGAUGCUGGCGCUGAGUAC⑶CGUGGAGUCCACUGGCGUCUUCACCACCAUGGAGAAGGCUGGGGCUCAUUUGCAGGGGGGAGCCAAAAGG⑶CAUCAUCUCUGCCCCCUCUGCUGAUGCCCCCAU ⑶ UC ⑶ CAUGG ⑶⑶ GAACCAUGAGAAGUAUGACAACAGCCUCAAGAUCAUCAGCAAUGCCUCCUGCACCACCAACUGCUUAGCACCCCUGGCCAAG⑶CAUCCAUGACAACUUUGGUAUCGUGGAAGGACUCAUGACCACAGUCCAUGCCAUCACUGCCACCCAGAAGACUGUGGAUGGCCCCUCCGGGAAACUGUGGC⑶GAUGGCCGCGGGGCUCUCCAGAACAUCAUCCCUGCCUCUACUGGCGCUGCCAAGGCUGUGGGCAAG⑶CAUCCCUGAGCUGAACGGGAAGCUCACUGGCAUGGCCUUCCGUGUCCCCACUGCCAAC ⑶⑶ CA ⑶ GGUGGACCUGACCUGCCGUCUAGAAAAACCUGCCAAAUAUGAUGACAUCAAGAAGGUG⑶GAAGCAGGC⑶CGGAGGGCCCCCUCAAGGGCAUCCUGGGCUACACUGAGCACCAG⑶GGUCUCCUCUGACUUCAACAGCGACACCCACUCCUCCACCUUUGACGCUGGGGCUGGCAUUGCCCUCAACGACCACUUU⑶CAAGCUCAUUUCCUGGUAUGACAACGAAUUUGGCUACAGCAACAGG⑶GGUGGACCUCAUGGCCCACAUGGCCUCCAAGGAGUAAGACCCCUGGACCACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAGAGAGACCCUCACUGCUGGGGA⑶CCCUGCCACACUCA⑶CCCCCACCACACUGAAUCUCCCCUCCUCACAGUUGCCAUGUAGACCCCUUGAAGAGGGGAGGGGCCUAGGGAGCCGCACCUU⑶CAUGUACCAUCAAUAAAGUACCCUGUGCUCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGGGGC^MM 2 Il 2 车合成时不同带来的不同扩 曾效果。1.源自HeLa细胞的Ago2结合的RNA的取得(1)人抗Ago2抗体固定化载体的制备向 20μ L 磁性载体 Dynabeads ProteinG(InvitroGen 公司生产)中力口入 ImlPBS (ρΗ 7. 4)，混合后，使用磁性支架将载体提取出来。然后，向载体中加入5μ L lmg/ mL人抗Ago2抗体(和光纯药工业(株)生产)和95 μ L磷酸缓冲生理盐水(PBS ρΗ 7. 4) 的混合液，室温反转摇勻1小时。接下来，使用磁性支架将载体提取出来，使用Iml PBS (ρΗ 7.4)清洗3次，最后用Iml PBS (ρΗ 7.4)混悬，所得溶液即为人抗Ago2抗体固定化载体溶液。(2) HeLa细胞提取液的制备向IX IO7个HeLa细胞中，加入Iml细胞裂解液(含有20mM Tris盐酸、200mM氯化纳、2. 5mM氯化镁的0. 05w/v% NP-40 (和光纯药工业(株)生产))，使用移液器将细胞混悬。将混悬液在冰浴中静置10分钟，离心分离Q0000Xg，20分钟、4°C)后，取上清液即为 HeLa细胞提取液。(3)源自HeLa细胞的RNA的纯化使用磁性支架从人抗Ago2抗体固定化载体溶液中将载体提取后，添加ImlHeLa细胞提取液，冷藏条件下反转摇勻3小时。使用磁性支架对载体进行二次提取后，使用Iml细胞裂解液，将其清洗3次。然后，在载体中加入50 μ L0. 5W/v%十二烷基硫酸钠(SDQ溶液， 将与载体结合的蛋白质溶出。向溶出液中加入350 μ L灭菌水，400 μ L苯酚氯仿异戊醇05 24 1)的混合物，使用涡旋混合器混合后，进行离心分离O0000Xg，10分钟)。 然后，取上层液，加入400 μ L氯仿，使用涡旋混合器混合后，进行离心分离Ο0000 X g，10分钟)。进一步，取上层液，加入3μ L乙醇沉淀核酸载体(日本基因公司生产)，40μ L 3Μ醋酸钠，Iml乙醇，使用涡旋混合器混悬后，进行离心分离Ο0000 X g，15分钟)。使用Iml 70v/ 乙醇将得到的沉淀物洗净后，室温下风干20分钟，溶解在IlyL灭菌水中，即得纯化的 RNA溶液。2.逆转录反应将11 μ L通过上述人抗Ago2抗体固定化载体制得的RNA溶液，以及1 μ L20 μ M的寡聚(dT)引物溶液(5，-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，)，进行混合。然后，将混合液在70°C孵育3分钟后，在冰浴中降温。然后，加入4yL 2. 5mM dNTP 混合液(日本基因公司生产)，1 μ L 20U/ μ L RNase超级抑制剂(和光纯药工业(株)生产)，2 μ L ReverseScript IV用10 X反应缓冲液(和光纯药工业(株)生产)，1 μ L 200U/ μ L Reverse Script IV (逆转录酶、和光纯药工业(株)生产)，混合后得到总量为20 μ L 的反应液，42°C反应10分钟。然后，加入2μ L 0. 5mol/LEDTA，充分混合，停止反应。3.碱处理反应停止后，加入8μ L 0. 2mol/L的NaOH，进行混合，65°C加热30分钟后，在冰浴中静置2分钟。接下来，加入20 μ L lmol/L的Tris-HCl(pH 7. 5)，进行混合后，利用 Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生产)除去未反应的逆转录反应引物。然后，分别加入1 μ L乙醇沉淀核酸载体(日本基因公司生产)，12 μ L 10mol/L醋酸铵，125 μ L乙醇，进行混合。接着，离心分离10分钟(18800Xg)，75%乙醇洗涤2次，沉淀，干燥后，溶解在；35. 5yL灭菌水中。4.第2链合成反应向35. 5μ L上述3.得到的含有逆转录反应产物的水溶液中，分别加入 5 μ LHotGoldstar DNA聚合酶用IOX反应缓冲液(EUR0GENTEC公司生产)，4yL各 2. 5mmol/L的dNTP混合物(日本基因公司生产)，1 μ L 20 μ mol/L第2链合成用随机引物溶液(5，-CATGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB-3，，B 为 C、G 或 T，N 为 A、C、G 或 T)， 4μ L 25mmol/L 氯化镁，0. 5μ L HotGoldstarDNA 聚合酶(5U/μ L，EUR0GENTEC 公司生产)， 在冰浴中缓慢混合，按照如下条件进行第2链合成反应95 0C 10 分钟一30 0C 1 分钟一40 °C 30 秒一50 °C 30 秒一60 °C 30 秒一72 °C 2 分钟 —95°C 1分钟一冰浴2分钟。另外，取35. 5μ L同样进行了上述1. 3.的反应而得到的含有逆转录反应产物的水溶液，除以下反应温度以外，与上述反应相同地，进行了第2链合成反应95"C 10分钟一30"C 1分钟一72°C 2分钟一95°C 1分钟一冰浴2分钟。接着，利用hvisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生产)，从得到的各个溶液中除去未反应的第2链合成用引物。之后，分别加入IyL乙醇沉淀核酸载体(日本基因公司生产)，12 μ L 10!1101/1醋酸铵，125“1^乙醇，进行混合。进而，分别离心分离10分钟 (18800 X g)，使用75%乙醇洗涤2次，将沉淀物干燥，溶解在34. 5 μ L灭菌水中。5. PCR分别向34. 5 μ L由4.得到的2种水溶液中，分别加入5 μ L HotGoldstar DNA 聚合酶用10Χ反应缓冲液(EUR0GENTEC公司生产)，4yL 2. 5mmol/L dNTP混合物(日本基因公司生产)，各 1 μ L PCR 引物溶液(20 μ mol/L、5，-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3，和5，-GACCATATGACGAGATCCGAG-3，)，4 μ L 25mmol/L 氯化镁，0. 5 μ L HotGoldstar DNA 聚合酶(5U/ μ L、EUR0GENTEC公司生产)，在冰浴中缓慢混合，按照如下条件进行PCR反应95 0C 10 分钟一95 0C 20 秒· 60 °C 10 秒· 72 °C 30 秒 Q4 个循环)—72°C 2 分钟。接着，利用Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生产)，从得到的各个溶液中除去未反应的逆转录反应引物。之后，分别加入IyL乙醇沉淀核酸载体(日本基因公司生产)，12 μ L 10!1101/1醋酸铵，125 4 1^乙醇，进行混合。进而，离心分离10分钟 (18800 Xg),75%乙醇洗涤2次，将沉淀物干燥后，溶解在5 μ L灭菌水中。得到的溶液中，对每1 μ L，使用安捷伦2100生物分析仪进行链长分析。其结果如表2所示。[表 2]
权利要求
1.一种含有与具有POlyA模板RNA相对应的碱基序列的双链DNA的合成方法，其特征在于包括，1)使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)弓丨物，对具有polyA的模板RNA 进行逆转录反应，得到单链DNA的工序1，和2)在不具有3’一 5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的随机引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链 DNA的工序2。
2.如权利要求1记载的合成方法，其特征在于，在工序1之后，进一步包括将工序1制得的单链DNA进行纯化的工序。
3.如权利要求1记载的合成方法，其特征在于，具有polyA的RNA链长为30 1500个碱基。
4.如权利要求1记载的合成方法，其特征在于，随机引物的链长为5 15mer。
5.如权利要求1记载的合成方法，其特征在于，工序2的双链化反应，按如下顺序进行反应，90 98°C、1 15分钟，20 40°C、10秒 5分钟，65 75°C、10秒 10分钟。
6.一种含有与具有polyA模板RNA相对应的碱基序列的双链DNA的扩增方法，其特征在于包括，1)使用5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子-1)的寡聚(dT)引物，对具有polyA 的模板RNA进行逆转录反应，得到单链DNA的工序1，2)在不具有3’一5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子-2)的随机引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链DNA的工序2，以及3)使用3’末端含有衔接子-1碱基序列的引物-1和3’末端含有衔接子-2碱基序列的引物_2，以工序2得到的双链DNA为模板，进行PCR反应的工序3。
7.如权利要求6记载的扩增方法，其特征在于，在工序1之后，进一步包括对工序1制得的单链DNA进行纯化的工序。
8.如权利要求6记载的扩增方法，其特征在于，具有polyA的RNA链长为30 1500个碱基。
9.如权利要求6记载的扩增方法，其特征在于，随机引物的链长为5 15mer。
10.如权利要求6记载的扩增方法，其特征在于，工序2的双链化反应，按如下顺序进行反应，90 98°C、1 15分钟，20 40°C、10秒 5分钟，65 75°C、10秒 10分钟。
全文摘要
本发明提供一种价格低廉、操作简便，由特定RNA合成对应的双链DNA的方法以及扩增该双链DNA的方法。含有与具有polyA的模板RNA相对应的碱基序列的双链DNA的合成方法，其特征在于，工序1为使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)引物，对具有polyA的模板RNA进行逆转录反应，得到单链DNA；工序2为在不具有3’→5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的随机引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链DNA。本发明还提供含有与具有polyA的模板RNA相对应的碱基序列的双链DNA的扩增方法，其特征在于，工序3为将得到的双链DNA进一步进行PCR反应。
文档编号C12N15/09GK102428180SQ20108002092
公开日2012年4月25日 申请日期2010年5月11日 优先权日2009年5月14日
发明者林田幸信 申请人:和光纯药工业株式会社