专利名称：糖类结合模块及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物，其特异结合至HIV糖蛋白的抗原表位。本发明也涉及抑制HIV活性的方法。
背景技术：
已知人免疫缺陷病毒(HIV)引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，且因为HIV表现快速遗传漂移，出现了广泛分歧的株。因此，检测和治疗变异株已证明为有挑战的且是困难的。也有紧急的需要开发有效的防病的疫苗和其他治疗策略以在该流行病持续不衰退时限制HIV传播。最成功的疫苗由可活性衰减的或灭活的病毒颗粒组成。然而，HIV相关的猿免疫缺陷病毒的活性衰减，引起没有所得病原性的保护性的反应还未被实现，产生使人类实验棘手的安全问题。同样，HIV有许多复杂的机制来有效地躲避被膜糖蛋白定向的抗体反应，包括通过构象和立体限制的聚糖屏蔽和掩饰脆弱的受体结合位点所得屏蔽井-保守的结构。因此，研究转向基于 被膜蛋白的免疫原作为引出抗体的方法。糖蛋白120 (gpl20)为HIV-1被膜棘突的重要组分。Gpl20的内部结构域与gp41相互作用，并且外部结构域十分可变且被重糖基化(Kwong, RD.等.Structure of an HIVgpl20 envelope glycoproteinin complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody.Nature 393，648-659 (1998)) o基于比较序列分析，gpl20被分成五个保守段(Cl至C5)和五个可变(VI至 V5)区域(Willey, R.L.等.Identification of conserved and divergent domainswithin the envelope gene of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus.Proc Natl Acad Sci USA 83，5038-5042 (1986)和 Modrow，S.等.Computer-assistedanalysis of envelope protein sequences of seven human immunodeficiencyvirus isolates -prediction of antigenic epitopes in conserved and variableregions.J Virol 61,570-578(1987))。Cl 和 C5 区域提供 gpl20 与 gp41 接触的主要区域(Helseth，E.，Olshevsky, U.，Furman，C.&Sodroski，J.Human immunodeficiencyvirus type I gpl20envelope glycoprotein regions important for associationwith the gp41 transmembrane glycoprotein.J Virol 65，2119-2123 (1991))，其他保守区域(C2 至 C4)在 gpl20 分子内形成疏水核(Moore，J.P.，Sattentau，QJ.，Wyatt,R.&Sodroski, J.Probing the structure of the human immunodeficiency virussurface glycoprotein gp 120 with a panel of monoclonal antibodies.J Virol 68，469-484 (1994) and Moore, J.P.，Willey, R.L.，Lewis, GK.，Robinson，J.&Sodroski，J.1mmunological evidence for interactions between the first，second，and fifthconserved domains of the gpl20 surface glycoprotein of human immunodeficiencyvirus type l.J Virol 68,6836-6847(1994))且可变区域，Vl 至 V3，暴露在单肢 gpl20 表面，并具有用于抗体识别和⑶4的结合位点的主要表位(Chen，L.等.Structural basisof immune evasion at the site of CD4attachment on HIV-1 gpl20.Science 326，1123-1127(2009)，Moore, J.P.&Sodroski, J.Antibody cross-competition analysis ofthe human immunodeficiency virus type I gpl20 exterior envelope glycoprotein.JVirol 70，1863-1872 (1996)，Pollard, S.R.，Rosa，M.D.，Rosa，JJ.&Wiley, D.C.Truneatedvariants of gpl20 bind CD4 with high affinity and suggest a minimum CD4 bindingregion.EMBO J 11，585-591 (1992)and Olshevsky,U.等.Identification of individualhuman immunodeficiency virus type I gpl20 amino acids important for CD4receptor binding.J Virol 64，5701-5707 (1990))。目前，在美国47例中和的识别HIV的单克隆抗体OnAbs)已进入I期或II期临床试验。其中，人mAb 2F5、4E10和2G12已经以其识别HIV-1被膜糖蛋白被很好表征(Armbruster， C.等.A phase I trial with two human monoclonal antibodies(hMAb2F5，2G12)against HIV-1.AIDS 16，227-233 (2002)和 Stiegler，G.等.Antiviralactivity of the neutralizing antibodies 2F5 and 2G1 2 in asymptomaticHIV-l-1nfected humans:a phase I evaluation.AIDS 16，2019-2025 (2002)) 大多数这些抗体主要革G向在病毒表面以其成熟三聚体形式封闭的gpl20区域(Zwick，M.B.&Burton，D.R.HIV-1 neutralizatio n !mechanisms and relevance to vaccine design.Curr HIVRes 5,608-624(2007)和 Krauss， IJ.等.Fully synthetic carbohydrate HIV antigensdesigned on the logic of the 2G12 antibody.JAm Chem Soc 129，11042-11044 (2007))。Gp120剩余的暴露面被用N连接的甘露糖聚糖Man9-G1CNAC (M9)重糖基化，且很少抗体被分离至成功结合至此种(免疫沉默的)区域。然而人mAb2G12被报道具有对抗HIV-1的分化体 A 和 B 的中和活性(Trkola，A.等.Human monoclonal antibody 2G1 2 definesa distinctive neutralization epitope on the gpl20 glycoprotein of humanimmunodeficiency virus typel.J Virol 70，1100-1108 (1996))并结合至HIV-1 gpl20 的“沉默的表面”上的表位。使用位点定向突变的丙氨酸扫描研究显示该表位主要覆盖高-甘露糖或gpl20上残基N295，N332，N386，N392，N397和N448的杂合聚糖结构(Sanders,R.W.等.The mannose-dependent epitope for neutralizing antibody 2G1 2 on humanimmunodeficiency virus type I glycoprotein gpl20.J Virol 76，7293-7305 (2002)和 ScanIan， CN.等.The broadly neutralizing ant1-human immunodeficiency virustype lantibody 2G1 2 recognizes a cluster of alphal- > 2mannose residues on theouter face of gpl20.J Virol 76，7306-7321 (2002))，不像多数抗体识别氨基酸侧链的特异构型。因此存在以下可能:2G12可被转变成基于糖类表位识别的宽范围的HIV中和抗体。2G12(PDB ID:1ZLS)的晶体结构及其与寡糖M9的复合物(PDB ID:10P5)显示两个Fab组装成Vh结构域交换二聚体，且该Vh结构域位于直接与N-连接的M9相互作用的2G12 重链上，尤其是在 gpl20 上包含四甘露糖 Mana (I, 2)Mana (1,2)Mana (1,3)Mana (Man4)部分的Dl臂。此外，在gpl20上的2G12识别位点的分子模型已显示在N332，N339和N392上的 N-连接聚糖对于 2G12 结合是关键的(Calarese，D.A.等.Antibody domain exchangeis an immunological solution to carbohydrate cluster recognition.Science 300，2065-2071 (2003))。合成的寡糖Man4和Man9可抑制gpl20和2G12之间的结合，因此这些寡甘露糖dendrion被鉴定为HIVl中和剂。而且，几种HIV mAb的IC5。中和曲线显示2G12的中和能力是中等的(Binley，J.M.等.Comprehensive cross-clade neutralizationanalysis of a panel of ant1-human immunodeficiency virus type I monoclonalantibodies.J Virol78,13232-13252(2004))。根据蛋白结构分类数据(ProteinStructure Classification Database) (CATH)(Orengo, CA.等.CATH-a hierarchic classification of protein domain structures.Structure 5，1093-1108 (1997))，2G12的Vh结构域被分类为具有特特异性特征β -夹心折叠，免疫球蛋白类(Ig-类)结构的超家族2.60.40.10。有趣的是，黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖淀粉酶的粒状淀粉结合结构域(SBD)，AnSBD，(PDB ID:IAC0)也已被鉴定于相同的同源超家方矣中(Christiansen, C.等.The carbohydrate-binding module family20-diversity, structure, and function.FEBS J 276，5006-5029 (2009))。2G12 和此糖类结合模块(CBM)之间的结构相似性可暗示可被阐明的作为有效的检测和预防疾病疫苗的共同功能。发明概述本发明提供 预防性地或治疗性地抑制受试者的HIV感染的方法，其中所述方法包括给予受试者有效量的特异性结合至HIV糖蛋白表位的糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物。本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗或预防有效量的糖类结合模块的抗体模拟物和药学可接受载体。附图简述
图1.淀粉结合CBM和2G12的结构、序列和功能的比较。RoSBD与以下的结构重叠(深灰):(a) AnSBD (浅灰)；(b) 2G12VH结构域(浅灰)和(c) 2G12VL结构域(浅灰)。(b)中的Man4以黏代表显示，(d)基于Dali重叠结果的RoSBD，AnSBD，2G12VH和2G12Vl的多重序列比对。下划线的残基表示β -链区域，且黑体字形式的氨基酸表示在SBD中的配体结合残基和在2G12Vh结构域中的Man4-结合位点，(e)将一百微升的HIV-PC溶液加载至96孔ELISA 板，所述 ELISA 板分别包被有 IOOnM 人 IgG1 第二抗体(2C11),HIV-1 p24 mAb (N29)、HIV-1 gp41mAb (AG10H9) ,HIV-1 gpl20 mAb (ED8.D4)，2G12, RoSBO 和 AnSBD。HRP 结合的重组gpl20抗原用于信号检测。差异为统计学显著的(P < 0.0001)。图2.RoSBD-HIV结合的特异性。一百微升HIV-PC，RoSBD mAb和HCV-PC在一起混合，加载至RoSBD包被的ELISA板，使其在37°C反应Ih0通过加入100 μ L的:(a) HRP-结合的重组gpl20抗原；(b)HRP-结合的HCV重组抗原；(c)HRp-结合的HTLV重组抗原或(d)抗小鼠IgG HRP结合来实现检测。在此甄别值(COV)被定义为ELISA分析中来自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄别指数(COI)值通过OD值除以COV计算。差异为统计学显著的(P < 0.05)。图3.AnSBD-HIV结合的特异性。一百微升HIV-PC，RoSBD mAb和HCV-PC在一起混合，加载至AnSBD包被的ELISA板，使其在37°C反应lh。通过加入100 μ L的:(a) HRP-结合的重组gpl20抗原；(b)HRP-结合的HCV重组抗原；(c)HRP-结合的HLV抗原或(d)HRP-结合的抗小鼠IgG来实现检测。在此甄别值(COV)被定义为在ELISA分析中来自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄别指数(COI)值通过OD值除以COV计算。差异为统计学显著的(P < 0.0001)。图4.HIV至SBD的竞争性结合。HIV-PC分别与相同体积的500nM gpl40、2G12mAb，gpl20 mAb (ED8.D4), gp41 mAb (AG10H9), p24mAb (N29)或人 IgG1 第二抗体(2C11)在 37°C混合lh。该混合物呗转移至包被有(a) RoSBD或(b) AnSBD的板并用HRP结合的重组gp120抗原检测。差异为统计学显著的(P < 0.0001)。图5.聚糖的竞争性结合。HIV-PC与500 μ M的大豆凝集素(SBA)、G7、β CD或甘露糖的每一种在37°C混合lh。该混合物被转移至用IOOnM: (a) RoSBD和(b) AnSBD预包被的ELISA板。该反应用HRP结合重组gpl20抗原检测。差异为统计学显著的(P < 0.01)。图6.使用mAb和SBD100 μ L的HIV-1发生率/患病率性能组(PRB601)成员的HIV结合曲线被分别加载到用 IOOnM:(a)HIV-l-p24mAb(N29) ； (b)HIV-l-gp41mAb (AG10H9)；(c)gpl20mAb (ED8.D4) ； (d) HIV-l_2G12mAb ； (e) RoSBO 或(f) AnSBD 预包被的 ELISA 板且用HRP-结合重组的gp 120抗原检测。在此甄别值(COV)被定义为在ELISA分析中来自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄别指数(COI)值通过OD值除以COV计算。图7.HIV-2G12和HIV-SBD结合曲线。一百微升HIV-1性能组(PRB601)成员被分别加载至用100nM(a)2G12，(b)RoSBD和(c) AnSBD预包被的96孔ELISA板。该反应用HRP结合重组的gpl20抗原检测。含5% BSA的PBS(PH7.4)被用作NC阴性对照(NC)。甄别值(COV)被定义为在ELISA分析中来自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄别指数(COI)值通过OD值除以COV计算。差异为统计学显著的(P < 0.0001)。图8.RoSBD的聚糖结合活性。(a)聚糖微阵列分析通过对功能的Glycomics,核心H设备的联合进行。用于分析的第一抗体为抗RoSBD单克隆抗体，且第二抗体为Alexa Fluor488-结合的山羊抗小鼠 IgG。 (b)六十微升 0.7pM IgGl (2C11)、HIV_lgpl40、Man4_0R 或Manl-Asn/PBS(pH7.4)置于玻璃管中，并将60 μ L磁性试剂加入该玻璃管并在4°C混合15秒然后进行磁性减少测量。该混合物的磁性感受性使用XacPro-SlOl阅读器在25°C测量。图9.合成的Man4的结构(为6_氨基己基糖苷Man4_0R)和M9_Asn (来自SBA)。图10.RoSBD上的Man4结合位点。(a)使用PyMOL计算和显示的表面能力，显示阴性(红色)和阳性(蓝色)能力。左边组:具有标记的残基Thr33，Tyr56和AsplOO的VH-Man4, Man4以褐色显示。右边组:显示位点I的关键结合残基(Trp47，Tyr83和Tyr94)和位点II的关键结合残基(Tyr32和Phe58)的标记RoSBD_G7复合物。G7分子以青色(cyan)显示，(b)预测的RoSBD上Man4结合位点的带状图。Man4分子以褐色显示。左边组:显示Tyr32, Ser33和Lys34残基。右边组:显示Tyr32, Ser33和Lys34残基，(c)野生型和突变的RoSBD的HIV结合。将100 μ L HIV-PC溶液加载至用IOOnM野生型RoSBD或突变的 RoSBD Ν29Α, Υ32Α, S33A, Κ34Α, W47A, F58A, Υ83Α, Υ93Α 和 Υ94Α 预包被的 96 孔 ELISA板中。HRP结合重组的gpl20抗原用于信号检测。显示的结果表示一式三份样品的土SD。★ , P < 0.05 ；★★, P < 0.01 ;★★★, P < 0.0001。图11.RoSBD氨基酸对于HIV-1复制和细胞存活力的影响。HIV-1RTMF (AZT-抗性病毒)，用增加浓度的RoSBD处理。8天后通过使用HIV-lp24抗原ELISA测量病毒复制，且根据剂量响应曲线计算对于抑制的IC5tl值。不同浓度的RoSBD对H9细胞存活力的影响和MTT分析被用于检测H9细胞培养中的细胞毒性。图12.对于抑制HIV-1进入的可能策略，(a) HIV-1进入靶细胞需要gpl20与细胞表面受体⑶4和共受体CCR-5的结合。(b)中和mAb2G12通过识别HIV gpl20的⑶4结合结构域阻碍HIV-1感染。(c) SBD/CBM可识别HIV-1并作为2G12mAb的模拟物来阻碍HIV-1感染。
发明详述本发明提供预防性地或治疗性地抑制受试者的HIV感染的方法，所述方法包括给予受试者有效量的特异性结合至HIV糖蛋白表位的糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物。此处使用的术语“CBM”指在糖类-活性酶中与具有糖类结合活性的谨慎折叠邻近的(contiguous)氨基酸序列。在糖苷水解酶的一级结构分类中，按基于氨基酸序列相似性SBM被分类至59家族且它们表现出不同的配体特异性，依照糖类活性酶(Carbohydrate-Active EnZyme) (CAZy)数据库(Cantarel, B.L.等.TheCarbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert re source forGlycogenomics.Nucleic Acids Res 37，D233-238 (2009))，其包括几种特异性例如纤维素、木聚糖和淀粉结合。本发明中，SBM特异性地结合至存在于HIV糖蛋白表位中的聚糖结构。优选的实施方案中，所述HIV糖蛋白为gpl20，且所述聚糖结构为N连接的高甘露糖聚糖 Man9-GlcNAc(M9)。
此处使用的术语“抗体模拟物”指与抗体在对抗靶结构结合方面具有相似功能的物体，但其结构比抗体简单。为生产大量抗体需要如下步骤:(a)将单抗体形成细胞融合至培养生长的肿瘤细胞。所得的细胞被称为杂交瘤，(b)每种杂交瘤产生相对大量的相同的抗体分子，和(C)使得该杂交瘤在培养中增加，有可能产生细胞群，该细胞群的每个细胞产生相同的抗体分子。制造真正的抗体是消耗劳动和消耗费用的；然而，本发明中，广泛的包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞的宿主可被用于产生CBM的抗体模拟物而不使用动物，这更简单且更经济。此处使用的术语“受试者”指动物，优选哺乳动物，且更优选人。本发明中，优选的CBM为淀粉结合结构域(SBD)。此处使用的术语“SBD”指可结合粒状或可溶淀粉的功能性结构域，以增加酶的活性位点的底物的局部浓度，且这也可以分裂淀粉表面的结构，由此增强淀粉分解率。目前，有九种淀粉结合CBM家族:CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、CBM41、CBM45、CBM48和CBM53。本发明的优选的实施方案中，SBD为SBM家族20和21的成员，它分别得自黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖淀粉酶(AnSBD)和稻根霉(Rhizopusoryzae)葡萄糖淀粉酶(RoSBD)。使用分子模型的稻根霉(Rhizopus oryzae)葡萄糖淀粉酶(RoSBD)的 SBD 的结构-功能关系(Chou,ff.1.,Pai,T.ff.,Liu, S.Η., Hsiung, Β.K.&Chang,Μ.D.The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase from Rhizopusoryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding.BiochemJ 396，469-477 (2006))和核磁共振(NMR)光谱已被验证(Liu, Y.N.，Lai, Υ.Τ.，Chou,W.1.，Chang, Μ.D.&Lyu, RC.Solution structure of family 21 carbohydrate-bindingmodule from Rhizopus oryzae glucoamylase.Biochem J 403，21-30 (2007))。此夕卜，RoSBD上的maltoheptaose(G7)和β-环糊精(β-CD)结合位点已通过X-射线结晶照相法(crystallography)检测(Tung，J.Y.等.Crystal structures of the starch-bindingdomain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polys accharide-binding path.Biochem J 416，27-36 (2008)) 本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗或预防有效量的糖类结合模块的抗体模拟物和药学可接受载体。术语“药学可接受载体”、“药学可接受赋形剂”、“生理学可接受载体”或“生理学可接受赋形剂”指药学可接受材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种组分应为在与药物制剂的其他成分可相容的意义上是“药学可接受的”。它还应该适合用于与人和动物的组织或器官而没有过多的毒性、刺激、过敏反应、免疫发生或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。此处公开的药物组合物可以单位剂型或多剂型公开。此处使用的单位剂型指物理学上离散的适合给予至人和动物受试者的单位且被本领域已知的独立包装。每个单位剂量包含预测定量的足以产生所需的治疗效果的活性成分，结合所需的药物载体或赋形剂。单位剂型的实例包括注射剂(ampoule)、注射管(syringe)和独立包装的片剂和胶囊。单位剂型可以其部分或其多数给予。多剂型为包装在单容器中以被以分开的单位剂型给予的复数的相同单位剂型。多剂量的实例包括小瓶的、瓶的片剂或胶囊或瓶的品脱或加仑(Pintsor gallons)。此处公开的组合物可被单独给予，或与一种或多种其他此处公开的化合物、一种或多种其他活性成分组合。包含此处公开的化合物的药物组合物可被配制成多种用于经口的、肠胃外的和局部给予的剂型。该药物组合物还可被配制为改性释放的剂型，包括延迟_、增强的_、延长的_、持续的_、脉动的_、控制的_、加速的-和快速的_、靶向的_、程序化的-释放、和胃的保留剂型。这些剂型可按照本领域技术人员已知的常规方法和技术制备。此处公开的药物组合物可一次给予，或者在时间间隔多次给予。应理解治疗的精确剂量和持续时间可随着年龄、重量和待治疗的患者的状态变化，且可被经验地使用已知的测试方案测定或通过插补法从体内或体外试验或诊断数据测定。还应理解对于任何特定的个体，特定的剂量方案应随 时间根据个体需要和管理或监督该配方的给予的人的职业判断来调整。此处公开的药物组合物可以用于经口给予的固体、半固体或液体剂型公开。此处使用的，经口给予也包括颊的、舌的和舌下给予。合适的经口剂型包括，但不限于，片剂、胶囊、丸、糖锭(troches)、锭剂(lozenges)、软锭剂(pastilles)、扁囊(cachets)、丸(pellets)、含药口香糖、整装粉剂、泡腾的(effervescent)或非冒泡的粉末或颗粒、溶液、乳液、悬液、溶液、薄脆饼(wafes)、喷洒(sprinkles)、酏和糖楽；。除了活性成分,该药物组合物还包含一种或多种药学可接受的载体或赋形剂，包括但不限于，结合剂、填充剂、稀释剂、崩解齐IJ、湿润齐U、润滑剂、助流齐U、着色齐U、染料迁移抑制剂、增舔剂和调味齐U。本发明还提供检测样品的HIV的方法，所述方法包括将特异性结合至HIV糖蛋白表位的糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物加入至样品；和检测所述抗体和样品之间的结合反应。在检测HIV的方法中，SBM特异性地结合至存在于糖蛋白表位中的聚糖结构。如下实施例为非限制性的且仅代表本发明的各方面和特征。
实施例实施例1SBD和2G12之间的结构关系基于结构的多重序列比对二级结构预测使用 Jpred 服务器(server) (Cuff, J.A., Clamp, M.E., Siddiqui,A.S.，Finlay, M.&Barton，GJ.JPred:a consensus secondary structure predictionserver.Bioinformatics 14,892-893 (1998))和网络蛋白序列分析(Network ProteinSequence Analysis) (NPSA)服务器。Jpred和NPSA服务器提供一致的结果,分别来自六种(NNSSP, DSC, PREDATOR, MULPRED, ZPRED 和 PHD)和十二种(SOPM，SOPMA, HNN, MLRC, DPM,DSC, GORI, GORII, GORIV, PHD, PREDATOR 和 SMPA96)不同的方法。结果RoSBD或AnSBD和其他蛋白结构域之间的结构-功能关系检测通过使用DALI 数据库 in silico 进行(Holm, L., Kaariainen, S., Rosenstrom, P.&Schenkel,A.Searching protein structure databases with DaliLite v.3.Bioinformatics 24,2780-2781 (2008))。总计对于RoSBD和AnSBD分别有555和535种结构上相关的蛋白被检索到，并按照它们功能分类。如预期的，两种情况下最相似的蛋白(即，在前200)主要为淀粉处理酶或CBM，然后是抗体家族。特别是，RoSBD和AnSBD分别与158和57种免疫球蛋白结构关联。其中，RoSBD类似于三种糖结合mAb:2G12、2H1和F22-4，它们分别识别致病的微生物 HIV,新型串酵 母(Cryptococcus neoformans)和弗氏志贺菌(Shigella flexneri)。此外，RoSBD ;类似于13HIV中和mAb包括2F5和FAB 1583。类似地，AnSBD类似于两种糖结合抗体:2H1和SEl 55-4mAb的单链抗体可变结构域(ScFv);和两种HIV结合mAb、2F5和G3-519。2G12,RoSBD和AnSBD之间的结构关联使得容易推导出这些SBD可具有识别HIV的糖蛋白的能力。图1显示对于RoSBD、AnSBD，和2G12人mAb的VH和VL结构域的结构比较结果。虽然RoSBD和AnSBD、VH和VL之间的序列同一性低至分别为8.3%、9.5%和10.9%，但重叠的影响表明在结构配对之间总体三维结构是非常相似，平均根均值方差(root mean squaredeviation) (RMSD)值分别为 1.4Ao (图 la)、2.9Αο (图 lb)和 3.0Ao (图 lc)。虽然图1d中RoSBD、AnSBD、VH和VL的多重序列比对显示出低的同源性，但两种SBD和VH中关键的配体结合位点是很保守的(Tung, J.Y.等.Crystal structures of the starch-bindingdomain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polys accharide-binding path.Biochem J 416，27-36 (2008))。RoSBD, AnSBD 和 2G12 的 VH 和 VL 结构域之间的结构相似性可表明对于SBD和2G12的相似的结合特异性。实施例2SBD和2G12之间的功能关系微生物和质粒大肠杆菌(Escherichiacoli) ToplOF ' (Invitrogen)被用于质粒处理，而大肠杆菌(E.coli)BL21-Gold(DE3) (Invitrogen)用于蛋白表达。载体 pET_23a(+)和pET-15b (Novagen),都包含T7引物(promoter),都分别用于在大肠杆菌细胞中重组的RoSBD 和 AnSBD 表达。用于 pET23a(+)-RoSBD 的正向(forward)引物 5'-CATATGGCAAGTATTCCTAGCAGT-3' (SEQ ID 号 I)和反向引物 5' -CTCGAGTCATGTAGATACTTGGT-3/ (SEQ ID 号 2)分别包含 NdeI 和 XhoI 限制(restriction)位点，以及用于pET15b-AnSBD 的正向引物 5' -CATATGAGCAAGACCAGCACCAGT-3 ' (SEQ ID 号 3)和反向引物 5' -CTCGAGCTACCGCCAGGTGT-3' (SEQ ID 号 4)分别包含 NdeI 和 XhoI 限制位点，这些引物用于克隆和序列分析。
SBD的转化和表达使用热激方法将pET表达载体转化至大肠杆菌(E.coli)表达细胞(Chou，W.1.，Pai, Tff., Liu, S.H., Hsiung, B.K.&Chang, Μ.D.The family 21 carbohydrate-bindingmodule of glucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playingdistinct roles in ligand binding.Biochem J 396,469-477 (2006))。100 微升感受态细胞核IOOng DNA或20 μ L连接混合物被混合，然后冰上孵育30min。将细胞在42°C水浴中加热30至60秒,然后置于冰上超过2min。将转化细胞铺展至含100 μ g/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)琼脂板上并在37°C孵育过夜以测定转化细胞的数量。蛋白表达通过将0.5mM异丙基β _D_硫代半乳糖苷(IPTG) (Promega)加入至培养基诱导，并在20°C以250x g震荡下孵育16h。通过在4°C以3，700X g离心15min收获细胞。SBD的纯化包含重组蛋白的大肠杆菌(E.coli)的细胞沉淀物(pellet)重悬于IOOmL结合缓冲液(50mM NaOAc,pH 5.5)中，通过勻衆裂解(EmulsiFlex_C5 homogenizer,AVESTIN)，且细胞碎片通过在4°C 16，OOOx g离心30min除去。将所得细胞裂解液加载至5mL直链淀粉树脂柱(New England Biolabs)上。然后将该柱用50mL结合缓冲液(50mMNa0Ac,pH 5.5)洗涤，且所吸附的蛋白用洗脱缓冲液(IOmM甘氨酸-Na0H，pH 11洗脱。纯化的SBD通过在超滤单兀(Centricon-10,Millipore)中离心浓缩并且缓冲液换成50mM NaOAc, pH 5.5 (Lin,S.C.等.CBM21 starch-binding domain:a new purification tag for recombinantprotein engineering.Protein Expr Purif 65，261-266 (2009))。质谱分析 重组蛋白的分子量检测通过液相色谱/质谱仪(LC/MS) (Waters)进行。完整的SBD(IOOpmol)用在50% (v/v)乙腈中的0.1 %甲酸酸化，且数据在正常扫描分辨率(scanresolution)下800_1800m/z范围获得。对最初的具有多重的荷电的离子系列的电喷射质谱去卷积(deconvoluted)以得到质谱。夹心ELISA首先将纯化的SBD (100 μ L的IOOnM溶液)稀释至SBD包被缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液，pH 8)，然后用移液管加入(pipeted)至96孔ELISA板(Greiner-Bio One),然后在 4°C 孵育 16h。相似地，首先将 100μ L 的 IOOnM 2G12 mAb (Polymum Scientific)稀释至2G12包被缓冲液(50mM甘氨酸-HCl缓冲液，pH 3)，然后用移液管加入至第二 ELISA板，40C 16h。分别将以下四种试剂的每一种(IOOyL)加入至SBD-包被的或2G12-包被的ELISA板，并使其在37°C反应Ih:(i)HIV-PC(HIV抗原和抗体阳性血清，ID#9144532 ；SeraCareLife Sciences), (ii) 1.0 μ g/mL Ant1-RoSBD mAb (由作者生产，可通过索取获得)，(iii)HCV-PC(抗-HCV Mixed Titer Performance Panel ;成员(member) 10, ID#PHV205 ；SeraCareLife Sciences)和(iv)HTLV-PC(Ant1-HTLV I/II Mixed Titer Performance Panel ;成员 10，ID#PRP206 ； SeraCare Life Sciences)。分别使用 HIV p24ELISA 试剂盒(PerkinElmer)和抗HIV抗体1+2ELISA试剂盒(Abbott Diagnostics),根据说明书，将HIV-PC确认为HIV抗原阳性和抗-HIV抗体阳性。之后，将该板用PBST (0.0lM磷酸盐缓冲液加0.05%tween-20, pH 7.1)洗涤三次。
以下四种结合试剂的每一种被分别稀释成0.05 μ g/mL并以100 μ L/孔加入，37 °C 30min:⑴HRP-结合重组 gpl20 抗原(General Biologicals), (ii)HRP-结合的抗小鼠 IgG(Jackson ImmunoResearch)， (iii)HRP-结合的 HCV 重组抗原(GeneralBiologicals)和(iv) HRP-结合的 HTLV 重组抗原(General Biologicals),然后用 PBST 洗三次。3,3' ,5,51 -四甲基联苯胺(General Biologicals)底物以100 μ L/孔加入,并使其在37°C进行30min颜色显现。通过加入100 μ L/孔的2Ν硫酸终止颜色反应，使用Emax精确微量培养板阅读器(Molecular Devices)在450nm测量吸光度。甄别值(COV)被定义为阴性对照的0D，(正常人血清)+0.1。显示出甄别指数(COI)大于I的样品被认为阳性，其中COI =(测试样品的0D)/C0V。统计分析数据的统计分析通过双向(two-way)ANOVA进行,然后进行不成对的(unpaired)双尾 t 检验 GraphPad Prism Version 4 ；GraphPad Software)。P < 0.05 被认为显著的。结果 直接夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)使用HIV-特异的mAb或SBD-包被的微量滴定板和辣根过氧化物酶(HRP)连接的重组gpl20进行；显示甄别指数(COI) > I的样品被视为阳性。图1e显示在HIV抗原和抗体阳性对照(HIV-PC)中存在的HIV抗原通过抗-p24mAb (N29)，抗-gp41 mAb (AG10H9)，抗-gpl20 mAb (ED8.D4)和 2G12 如预期的被清楚滴检测至IJ。在包被有任一 SBD的板中观察到信号，这明显显示RoSBD和AnSBD具有相似的HIV检测能力。图2a显示RoSBD结合仅在HIV-PC被测试时发生。观察到与抗-丙型肝炎病毒(HCV)混合的滴定度性能阳性对照(HCV-PC)或抗-人T-淋巴细胞病毒(HTLV)混合的滴定度性能阳性对照(HTLV-PC)的可忽略的交叉反应。此外，HRP-结合的HCV重组抗原、HRP-结合的HTLV重组抗原和HRP-结合的抗-小鼠IgG没有得到明显的表示RoSBD具有对HIV-PC特异识别的信号(图2)，这可能由于结合至HIVgpl20抗原。图3a显示AnSBD结合至HIV-PC的最大COI与RoSBD的那种相似，且对于AnSBD结合至HIV-PC或HTLV-PC没有观察到交叉反应。图3b和3c显示在HRP-结合的重组gp120存在时AnSBD表现对HIV-PC的结合特异性。此外，在小鼠抗-RoSBD mAb和AnSBD之间没有结合(图3d)。实施例3RoSBD和AnSBD和HIV-1糖蛋白之间的特异性HIV mAb和聚糖的竞争性ELISA以下肽和mAb用于竞争性ELISA实验:(i)人IgG1第二抗体([2C11];对于人IgGi的亚类特异的且没有同型限制；Fe-区特异的)第二抗体，(ii)HIV-l p24肽([N29]，根据HIV-1 p24的N-末端残基1-104的合成肽)，(iii)HIV-1 gpl20肽([ED8.D4];按照人HIV-1 BH8 隔离 gpl60 的残基 427-448 的合成肽)，(iv)HIV-1 gp41 肽([AG10H9]，按照HIV-1 gpl60 的残基 721-744 的合成肽)，(v) 2G12 mAb (对抗 HIV-1 gpl20 的重组人 mAb)，卜1)8 140 011￥分化体4，株92/呢/037)。所有得自Abeam，除了 2G12和gpl40，它们购自Polymun Scientific。对于ELISA实验，50 μ L HIV-PC与等体积的500ηΜ的以上⑴至(vi)的每种混合。将该混合物转移至RoSBD或AnSBD包被的板并在37°C孵育lh，然后用PBST洗涤三次。通过加入100 μ L的0.05 μ g/mLHIVl重组gpl20 HRP-结合抗原检测反应。对于检测聚糖效果的实验，50 μ L的500 μ M的四种样品，大豆凝集素(SBA)、maltoheptaose (G7)、β-环糊精(PCD)和甘露糖(Sigma-Aldrich)的每一种与等体积的HIV-PC混合。将该混合物转移至RoSBD或AnSBD包被的板并在37°C孵育lh，然后用PBST洗涤三次。该反应通过加入100 μ L的0.05 μ g/mL重组gpl20抗原检测。通过加入100 μ L的0.05 μ g/mL HRP-结合的HIV I重组gpl20抗原检测反应。结果两种SBD和HIV-1之间的分子相互作用的特异性在包括mAb、糖蛋白和聚糖的竞争者存在时被评估。图4a和4b中，人IgG1QCll)第二抗体的存在未显示出抑制效果，表明没有非特异性竞争发生。然而，对于HIV-PC结合至RoSBO和AnSBD的COI值分别显著减少至72%和60%，在重组HIV-1 gpl40存在时，中国仓鼠卵巢(CHO)-表达的包装糖蛋白包含与gpl20相同的高甘露糖型聚糖。这表明SBD和HIV糖蛋白之间的分子相互作用。此外，mAb 2G12，抗-gpl20 mAb，抗-gp41 mAb 和抗-p24 mAb 竞争剂对于 RoSBD-HIV PC 结合的抑制率分别为55%,42%,22%^P 13%，其中AnSBD的该值分别为33%,18%,6%^Ρ 10%。在与mAb (对于gpl20)的竞争时SBD和HIV-PC结合的明显减少导致对SBD识别HIV的结论的进一步支持。该数据明显显示每种SBD和HIV gpl20之间的特异性相互作用，假定在gpl20上包含聚糖部分。此外，发现500μΜ四 聚糖蛋白大豆凝集素(SBA)具有Μ9部分、maltoheptaose (G7)和β-环糊精(β⑶)部分，对于RoSBD-HIV和AnSBD-HIV分别抑制结合达38%，20%和23%，以及16%，13%和11%，但甘露糖单糖未显示出抑制效果(图5)。这些数据暗示SBA和SBD的多糖配体对HIV结合弱竞争。实施例4SBD和2G12的竞争性HIV-1检测为评估用于HIV ELISA的SBD的实际应用，一组HIV-1发生率/患病率性能组样品(PRB601 ;SeraCare Life Sciences),包含7个一致的发生和8个一致的患病样品,表征为HIV-1阳性的，被用于比较抗_p24，抗_gp41，抗-gpl20和2G12 mAb，以及RoSBD和AnSBD之间的HIV检测性能。结果图6显示所有包被材料为活性的且此两种SBD显示明显的检测信号。虽然对于15个样品的类似的检测曲线在SBD或HIV-特异性的mAb包被的分析被观察到，2G12和RoSBD显示相对较高的检测灵敏度；显然，样品号5，6，8，10，11和13比其他包含更多的HIV-1抗原。这些数据明显支持我们的SBD的HIV-1抗原识别能力。此外，不仅信号的检测模式而且信号的相对范围在2G12(图7a) ,RoSBD (图7b)和AnSBD (图7c)之间非常相似。2G12-，RoSBD-和AnSBD-包被的ELISA的检测率分别高至93%，93%和87%。应注意的是样品号I和号2分别未被RoSBD和2G12检测，但据发现它们的HIV-1RNA含量分别为3 X IO4和2 X IO3副本/mL。HIV抗原ELISA和HIV-1-RNA试验之间的偏差可来自于不同的检测目标或表面糖蛋白的不同表达水平。实施例5
的特异甘露聚糖结合活性RoSBD的聚糖阵列筛选聚糖微阵列分析通过对功能的Glycomics的联合(CFG),核心H设备进行(Raman,R.等.Advancing glycomics:implementation strategies at the consortium forfunctional glycomics.Glycobiology 16,82R_90R(2006))。哺乳动物印刷阵列包含总计377不同的天然和合成的聚糖。简要地说，将七十微升的RoSBD (200 μ g/mL)施用至阵列的印刷的表面，覆有盖玻片，并在黑暗潮湿的小室中37°C孵育lh。孵育之后，移走盖玻片并用TSM 缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.5，10mMMgC12 和 0.5M sucrose)冲洗四次。将七十微升的抗-RoSBD mAb施用至微阵列的印刷表面，并在潮湿的小室中于37°C孵育lh。为检测结合，将该微阵列与5 μ g/mL浓度，在PBS缓冲液中的第二抗体，Alexa Fluor 488-结合的山羊抗-小鼠IgG(Invitrogen)在37°C在潮湿的小室中孵育Ih,然后进行洗漆步骤。结合程度使用Perkin-Elmer MicroarrayXL4000扫描仪测定,并使用Imagene (V.6)图像分析软件分析。完全的聚糖阵列数据组可在依据cfg_rRequest_l 340的CFG数据档案中发现。磁性减少结合分析对于磁性还原(MR)测量(MagQu)，含均匀分散的涂有亲水表面活性剂(例如葡聚糖)的63.2nm磁性纳米颗粒(MagQu)溶液被使用。在外部多重ac磁性领域,该磁性纳米颗粒通过磁性相互作用震荡并显示出混合频率磁性感受性(X ac)，对存在与颗粒表面相互作用的分子敏感的磁性特性。在测试样品中X ac值因此响应磁性纳米颗粒和结合分子之间的联合而减少以产生MR信号。
在包含理论空燃比(stoichiometric ratio)为1: 2的七水合硫酸亚铁(FeS04.7H20)和六水合氯化亚铁(FeCl3.H2O)的亚铁盐溶液与等体积的水性葡聚糖(Sigma-Aldrich)混合并在室温分散于水中。将该混合物加热至70-90 °C并用IONNaOH(Showa chemical)滴定以形成Fe3O4颗粒。通过在25°C以3，700X g离心15min和凝胶过滤层析(Sigma-Aldrich)去除凝聚物和过度的非结合葡聚糖。含Fe3O4磁性纳米颗粒的磁性液体被用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)稀释至
0.3emu/g (或 8.3mg Fe/mL),然后与纯化的 RoSBD (200 μ L, 1.0mg/mL)结合至葡聚糖上氧化的醛基以产生CH = N-连接。六十微升的0.7pM IgGl (2C11), HIV-1-gp 140，Man4 (为 6-氨基己基糖苷(Man4_0R)), M9_Asn(0da, Y.等.Crocus sativus lectinrecognizesMan3GlcNAc in the N-glycan core structure.J Biol Chem 275，26772-26779(2000))，或SBA与PBS(pH 7.4)溶液分离地加入至玻璃管并置于25°C。然后将另一 60 μ L包含RoSBD-包被的纳米颗粒的磁性试剂加入至该玻璃管并在25°C混合15秒。最终，在25°C使用XacPro-SlOl阅读器(MagQu)用于测量MR信号，检测该混合物。随着该结合使得磁性纳米颗粒能变得较大或簇生的，试剂的减少的X ac被记录。结果图8a清楚滴证实两个主要信号通过RoSBD检测:聚糖54Fuca (1,2)GalMl,3)GalNAc0 (lj3)Gala 和聚糖 187Mana (1,2)Mana (1,2)Mana (U)Mantl (Man4)。前者与人血型 0 抗原糖基化联合(Korchagina, E.Y.等.Design of the blood group AB glycotope.GlycoconjJ 22,127-133(2005))，而后者为HIV gpl20以及SBA中M9的合成的聚糖组分(Wang，J.，Li，H.，Zou, G.&Wang, L.X.Novel template-assembled oligosaccharide clustersas epitope mimics for HIV-neutralizing antibody 2G12.Design, synthesis, andantibody binding study.0rg Biomol Chem 5,1529-1540(2007))。此种数据对于 RoSBD和HIV gpl20之间的相互作用提供了额外的和独立的证据路线，因为识别宿主上的⑶4受体的Man4作为HIV-1进入的关键组分。有趣的是，2G12也已知结合至HIV-1 gpl20的该Man4结构,使用聚糖阵列分析和其他方法(Ji, X., Gewurz, H.&Spear, GT Mannose bindinglectin (MBL) and HIV MoI Tmmunol 42,145-152 (2005)和Liu,WT等.Identification andcharacterization of a novel fibril forming peptide in fungal starch bindingdomain.Biochem Biophys Res Commun 311,966-970(2008))。RoSBD的实时聚糖结合信号被使用磁性减少(MR)分析检测(Hong C.Y，WCC，ChiuY.C, Yang S.Y, Horng H.E 和 Yang H.CMagnetic susceptibility reduction method formagnetically labeled immunoassay.Applied Physics Letters 88,21252(2006))。含RoSBD-包被的磁珠和磷酸盐缓冲液(PBS)或人IgG1的典型的实时磁性响应，xac，显示于图8b中(实心点和实心三角)，表明RoSBD和人IgG1，第二抗体之间的非特异性相互作用不存在，也证实于图4。然而，在存在痕量的HIV-gpl40(0.7pM)时，明显的减少的MR信号(开口正方形)被检测(Λ Xa。为3.5%)。有趣的是，相同摩尔浓度的Man4(为6-氨基己基糖苷，Man4-0R)，M9_Asn (来自SBA)和SBA (图9)的存在导致相似的MR信号(十字和开口三角形;A Xac分 别为3.6%，3.6%和4.0)。在MR实验中对于HIV-gpl40，Man4-0R，M9-Asn和整个SBA清楚地观察到特征信号减少，对RoSBD和高甘露糖型聚糖之间的直接分子相互作用提供了强力证据。如根据其四价的特征预期的，SBA比其他反应快得多。总之，这些结果证明RoSBD和AnSBD通过新的蛋白-聚糖相互作用结合至HIV-PC中的天然HIV抗原，特异靶向HIV-1 gpl20上的Man4部分。实施例6SBD和Man4_结合蛋白之间的结构相似性和在RoSBD上定位(Mapping)Man4结合位点推定的Man4结合位点的分子模型RoSBD的推定的Man4结合位点的模型建立通过使用Dali服务器将RoSBD复合物(PDB ID:2V8M)和2G12_Man4复合物(PDB ID:1ZLS)的三维结构叠加进行。单糖Man4为
了发现推定的RoSBD上5A半径内的结合残基。此外，使用来自2G12-Man4复合物的Man4
相配之物，Man4适合于RoSBD-G7结构的G7结合位点，以此最保守的己糖环与结合位点I和
II相互作用。在预计的RoSBD-Man4复合物中Man4的5 A半径内的残基被标记。RoSBD的定点突变RoSBD及其突变体使用基于PCR的QuikChange 定点突变方法(Stratagene)以pET23a-RoSBD作为模板产生。用于扩增SBD衍生物的引物对被设计并列于表I中。PCR混合物包含IOng模板、0.625μ L的每种引物(10 μ Μ)，2.5 μ L反应缓冲液(IOx), 3.125 μ LdNTP (2.5mM)，0.25 μ L Pfu Turbo DNA 聚合酶(20U/ μ L) (Stratagene)，用 ddH20 加至终体积为25 μ L。用于本研究的热循环条件为I周期的95°C 5min和20周期的:95°C Imin (变性)，45°C至65°C 30秒(退火)和68°C 8min (延伸)，和最终的I周期的68°C IOmin0 PCR反应在热循环仪(9700, Applied Biosystems)中进行。每个突变质粒的序列通过DNA序列
分析验证。表1.用于定点突变的寡核苷酸引物。产生丙氨酸密码子的突变被加下划线。指
示-F'和-R'的引物分别包含正义和反义链。
权利要求
1.一种预防性地或治疗性地抑制受试者HIV感染的方法，所述方法包括给予受试者有效量的特异性结合至HIV糖蛋白表位的糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述SBM特异性结合至存在于HIV糖蛋白表位中的聚糖结构。
3.权利要求1所述的方法，其中所述HIV糖蛋白为HIVl-gpl20。
4.权利要求2所述的方法，其中所述聚糖结构为N-连接的高甘露糖聚糖Man9GlcNAc2。
5.权利要求1所述的方法，其中所述CBM为淀粉结合结构域(SBD)。
6.权利要求5所述的方法，其中所述SBD为选自CBM家族20、21、25、26、34、41、45、48和53的成员。
7.权利要求6所述的方法，其中所述SBD为CBM家族20。
8.权利要求6所述的方法，其中所述SBD为CBM家族21。
9.权利要求5所述的方法，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
10.权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗或预防有效量的糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物(免疫球蛋白类)和药学可接受载体。
12.权利要求11所述的组合物，其中所述CBM特异性结合至存在于HIV糖蛋白表位中的富甘露糖聚糖结构。
13.权利要求11所述的组合物，其中所述CBM为淀粉结合结构域(SBD)。
14.权利要求12所述的组合物，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
15.权利要求11所述的组合物，所述组合物为片剂、胶囊或悬液的形式。
16.一种检测样品的HIV的方法，所述方法包括将特异性结合至HIV糖蛋白表位的糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物加入至样品；和检测所述抗体和所述样品之间的结合反应。
17.权利要求16所述的方法，其中所述CBM特异性结合至存在于糖蛋白表位中的富甘露糖聚糖结构。
18.权利要求16所述的方法，其中所述糖蛋白为HIVl-gpl20。
19.权利要求17所述的方法，其中所述聚糖结构为N-连接的高甘露糖聚糖Man9GlcNAc2。
20.权利要求16所述的方法，其中所述CBM为淀粉结合结构域(SBD)。
21.权利要求20所述的方法，其中所述SBD为选自CBM家族20、21、25、26、34、41、45、48和53的成员。
22.权利要求21所述的方法，其中所述SBD为CBM家族20。
23.权利要求21所述的方法，其中所述SBD为CBM家族21。
24.权利要求20所述的方法，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
25.权利要求16所述的方法，其中所述样品分离自人。
全文摘要
本发明提供一种抑制受试者HIV感染的方法，所述方法包括给予受试者有效量的特异性结合至HIV糖蛋白表位的糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物。本发明还提供一种药物组合物，所属药物组合物包含治疗或预防有效量的糖类结合模块的抗体模拟物和药学可接受载体。本发明提供预防性地或治疗性地抑制受试者的HIV感染的方法，所述方法包括给予受试者有效量的特异性结合至HIV糖蛋白表位的糖类结合模块(CBM)的抗体模拟物。
文档编号C12Q1/70GK103097411SQ201080021113
公开日2013年5月8日 申请日期2010年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者张大慈, 李远川, 黄荣渊, 林淑娟, 周维宜, 刘锡辉 申请人:张大慈