专利名称：液体回流型高速基因扩增装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适合于在基础生命科学、医学基础研究以及医疗现场中迅速地进行微量的基因分析的研究或临床的使用了反应容器的基因分析装置，并涉及使用基于例如以人类为首的动物或植物的染色体组DNA、信使RNA等的核酸碱基序列，快速检测特定的碱基序列的反应装置的基因分析。
背景技术：
聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,以下简记为PCR。)是基于各种核酸的混合物扩增特定的核酸序列的方法。在混合物中放入从染色体组DNA或信使RNA逆转录而生成的互补DNA等的DNA模板(template)、两种以上的引物(primer)和热稳定性酶、 镁等的盐以及四种脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) (dATP、dCTP、 dGTP、dTTP)，通过至少重复一次使核酸分离的工序、使所述引物结合的工序、以及通过热稳定性酶将结合有引物的核酸作为模板进行杂交的工序，能够扩增特定的核酸序列。通过使在DNA扩增反应中使用的反应容器进行升温、降温来进行热循环。用于使温度变化的机构能够举出各种机构，但是存在通过使用了加热器、珀尔帖元件或暖风的热交换使含有试样 (sample)的反应容器的温度变化的机构、通过使反应容器与不同温度的加热部件(heater block)或液体池交替接触来使温度变化的机构、使试样在具有不同的温度的区域的流道中流动来改变温度的方法。在当前市场销售的装置中，就作为最快的装置的例如罗氏(Roche) 公司的PCR仪(Light Cycler)而言，在多个玻璃毛细管的每一个中导入试料、DNA聚合酶、 成为引物的DNA片段以及测量用的荧光标记染料，并吹送例如55°C和95°C两种温度等与想要变化的液滴的温度相同温度的暖风来使该毛细管内的微量液滴的温度变化，同时，向该玻璃毛细管照射荧光染料的激发光，并测量所得到的荧光强度。通过这些方法能够使试样的温度反复变化。此外，提出了通过向含有试料区域的外壁喷射流体进行冲击，来控制试料温度的流体冲击热循环控制装置(日本特表2001-519224(专利文献1))。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特表2001519224
发明内容
发明要解决的问题加热器或珀尔帖(Peltier)元件上的温度速度慢至每秒数。C左右，此外，难以不对温度过调节(overshoot)就使温度变化。基本上，若利用固体中的热传导，则会在热源和表面之间形成热梯度，从而不能够进行严密的控制。此外，试样在与加热器或珀尔帖元件接触的瞬间被夺走热量，从而发生表面温度恢复到规定温度为止的延迟。此外，在使反应槽与不同的加热器或液体池接触的情况下，移动用的机构复杂，或难以进行加热器或液体池的温度控制。进而，在使试样在具有不同的温度区域的流道中流动的方法中，伴随着试样的移动，流道自身的表面温度发生变化，存在难以进行温度控制这样的问题。此外，在吹送暖风来使温度变化的情况下，由于空气的热容量少，必须吹送大量的空气，此外，同样由于空气的热容量少，将通过电热丝等吹送的空气的最终吹出温度以rc为单位进行严密的控制是很困难的。因此，本发明的目的在于提供一种能够进行正确的温度控制、温度测定以及迅速的升温、降温的反应控制装置。更具体地说，本发明的目的在于，提供一种能够进行正确的温度控制、温度测定以及迅速的升温、降温，由此能够进行高速、高精度、高扩增率的PCR反应的DNA扩增装置。用于解决问题的手段为了实现上述目的，本发明的反应控制装置具有以下特征使用于针对试样液的温度变化，针对想要变化的多个温度，对维持各个温度的热容量大的液体进行热交换的介质中，以及使用了使该热容量大的多个不同的温度的液体高速变化的单元，和在该热容量大的液体和试样液之间迅速进行热交换微小反应槽。具体地说，由以下构成微小反应槽， 其以适合热交换结构以及材质构成；热交换槽，使适合各反应的温度的液体在微小反应槽外部循环；多个液体储存箱，含有高精度维持液体的温度的热源；切换阀系，为了使微小反应槽的温度迅速变化，用于从任意的液体储存箱向反应槽外部引导液体；混合防止机构，其在所述阀系切换时防止不同的温度的液体混合。S卩，本发明提供以下的液体回流型反应控制装置。(1) 一种液体回流型反应控制装置，具有反应槽，其具有用于放入试样的一个或多个凹部，热交换槽，其与所述反应槽相接触设置，以便向所述反应槽传递热量，并且，该热交换槽具有分别用于导入以及排出规定的温度的液体的入口以及出口，多个液体储存箱，具有能够控制温度的热源，所述热源用于将所述多个液体储存箱的液体分别保持在规定的温度，管状的流道，其将所述热交换槽的所述入口以及所述出口与所述液体储存箱相连接，泵，其设置在所述管状的流道上，用于使所述液体在所述热交换槽与所述液体储存箱之间循环，切换阀，其设置在所述管状的流道上，用于控制所循环的所述液体的流动，通过以规定的时间间隔切换来自所述多个液体储存箱的规定的温度的所述液体向所述热交换槽流入，由此将所述反应槽的温度控制在所希望的温度；所述试样的量在每个凹部为数μ L以下，所循环的所述液体的总容积在每个液体储存箱为数十HiL以上。(2)如上述(1)记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体回流型反应控制装置作为PCR装置来使用。(3)如上述(1)或(2)记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有荧光检测单元，在所述试样中含有荧光染料的情况下，所述荧光检测单元与对所述反应槽的温度切换动作连动地检测所述凹部内的所述荧光染料发出的荧光，以此测定荧光强度随时间的变化。(4)如上述(3)记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述荧光检测单元设置为与所述反应槽的各所述凹部相对应。(5)如上述(3)或(4)记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有估算单元，其基于在所述反应槽的一个或多个凹部中配置的所述试样液的荧光强度变化，来估算试样液的温度变化；变化单元，其基于所述估算的结果，使所述反应槽的温度迅速变化。(6)如上述(1) (5)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体储存箱的数量与所述反应槽的要设定的温度的数量相同。(7)如上述(6)所记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体储存箱的数量为2个或3个。(8)如上述⑴ (7)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽的底面以及壁面的厚度为1微米至100微米且由金属或硅形成，所述金属包括铝、镍、镁、 钛、钼、金、银、铜。(9)如上述(1) (8)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述凹部的底面的形状为平底状、半球状、三棱锥状或球状。(10)如上述⑴ (9)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，在所述凹部的每一个中预先内置反应中所需的干燥状态的试剂，该试剂与试样溶液接触时溶出并进行反应。(11)如上述⑴ (10)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽还具有用于使对于来自该反应槽内的所述试样的光学信号的测定变得容易的孔或光学窗。(12)如上述⑴ (11)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽设置为相对于所述热交换槽能够装卸。(13)如上述(12)记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽相对于所述热交换槽的装卸方式为以下方式中任一方式(a)方式，在所述反应槽的外周设置筒状的框，在所述热交换槽上设置筒状的反应槽支座，并且，在所述反应槽的所述框的外表面和所述热交换槽的反应槽支座的内表面上设置有螺纹牙，通过沿着该螺纹牙的旋转运动，将所述反应槽能够装卸地安装在所述热交换槽上；(b)方式，将所述反应槽的外周的所述筒状的框以及所述热交换槽的所述筒状的反应槽支座分别设置成锥状，将所述反应槽能够装卸地压接在所述反应槽支座上；(c)方式，将所述反应槽固定在载玻片状的反应槽框内，在所述热交换槽的反应槽支座上设置有导轨，将所述载玻片状的反应槽框沿着该导轨能够装卸地进行安装；以及(d)方式，将所述载玻片状的反应槽框插入具有铰链的滑动支座，通过基于该铰链机构的旋转动作，将所述载玻片状的所述反应槽框能够装卸地安装在所述热交换槽的所述反应槽支座上。(14)如上述(12)或(13)记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有在特定状态下将所述反应槽从所述热交换槽卸下的机构，该特定状态是指，既能够维持使所述液体回流的状态，又能够不使所述液体向所述液体回流型反应控制装置的外部漏出的状态。(15)如上述(1) (14)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体储存箱具有热源控制系统，所述热源控制系统具有热源、温度计、液体搅拌系统，该液体搅拌系统对该液体储存箱内的液体连续地或以占空(duty cycle)比在10%以上进行搅拌，能够将该液体储存箱内的该液体的温度分布抑制在5°C以内。(16)如上述(1) (15)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有对所述切换阀的动作进行控制的切换阀控制机构。(17)如上述(1) (16)中任一项记载的液体回流型反应控制系统，其中，所述切换阀能够将所述多个液体储存箱中的任意的液体储存箱的液体导入所述热交换槽，并能够使所述热交换槽中的所述液体返回到原来的液体储存箱。(18)如上述(16)或(17)记载的液体回流型反应控制装置，其中，控制所述切换阀，使得在通过控制所述切换阀来置换所述热交换槽内的所述液体时，将所述热交换槽内部的所述液体导入至保持与所述液体的温度最接近的温度的液体储存箱。(19)如上述(1) (18)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有辅助温度控制机构，该辅助温度控制机构包括绝热材料、加热器以及冷却机构，用于抑制将所述切换阀与所述液体储存箱相连接的所述流道内部的所述液体的温度的变动。(20)如上述(1) (19)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，在所述切换阀内还具有抑制温度变化的机构，不管用于将所述切换阀与所述液体储存箱相连接的所述流道内部的所述液体是否导入至所述热交换槽，通过与来自所述液体储存箱的所述液体连续置换，来抑制温度的变化。(21)如上述⑴ (20)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述切换阀由在剖面为圆形或多边形的中空结构内滑动的活塞构成，通过该活塞的位置来控制与所述反应槽相接触的液体的温度。(22)如上述(21)记载的液体回流型反应控制装置，其中，在所述切换阀中，(a)对与该活塞相连接的活塞杆施加机械外力；(b)使用自身为磁性体的活塞或在内部安装有磁性体的活塞，借助该活塞与在所述切换阀外部配置的含有电磁线圈的磁场发生机构之间的相互作用；或者(c)在活塞两端产生因循环的所述液体的流动而引起的压力差，来使所述活塞滑动。(23)如上述(1) (20)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，在所述切换阀中，旋转体插入至所述热交换槽并能够旋转，该旋转体为圆柱状、圆盘状或圆锥状，在外表面上形成有多个槽，所述槽成为从所述液体储存箱送出的液体的流道，并且，所述旋转体还形成有能够分别与各所述槽以流体连通的方式相连接的隧道状的流道，所述隧道状的流道的端部分别发挥所述切换阀的入口或出口的功能，通过使所述旋转体旋转，来使导入至所述入口的不同的温度的液体在流过所述槽部分时与反应槽外部相接触。
(24)如上述⑴ (23)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，作为循环的所述液体，使用沸点比水的沸点高的液体。(25)如上述(1) (24)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，作为循环的所述液体，使用沸点比水的沸点高的液体。(26)如上述(1) (25)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，作为循环的所述液体，使用凝固点比水的凝固点低的液体。(27)如上述(1)记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有试样蒸发防止机构，该试样蒸发防止机构包括构件，其密封并覆盖所述反应槽的所述凹部侧的表面，并且至少一部分光学上透明，以便能够以光学的方式对该凹部中的试样溶液进行观察；加热机构，其对所述构件的所述光学上透明的部分进行加热。(28)如上述(27)记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述构件与所述反应槽的所述凹部侧的表面之间的距离在3mm以下。(29)如上述(27)记载的液体回流型反应控制装置，其中，通过所述加热机构加热的所述构件的所述光学上透明的部分的温度在8o°c至iio°c的范围内。发明效果以回流的液体控制反应槽的温度的本发明的优点能够举出如下优点。首先，能够解决温度的过调节问题。即，总是回流的液体的温度大致恒定，因此能够瞬时使反应槽表面的温度和液体的温度之间的温度大致平衡化。在本发明中，反应槽以及试样的热容量与回流的液体相比是微不足道的，此外，即使局部地从液体带走热量，由于液体连续流动，所以基本上也不会发生热梯度。当然，反应槽的温度不会超过液体的温度。根据本发明的代表的实施方式，通过使不同的温度的液体顺次流入热交换槽，能够在0. 5秒以内使温度变化 30°C以上。从而，根据本发明，能够极大缩短温度变更所需的时间，因此，与现有的装置相比能够极大缩短用于进行例如PCR反应的总时间。在本发明的反应控制装置中，通过使温度保持恒定的液体与热传导率良好的反应槽的外部接触，进一步以不同温度的液体迅速置换，能够高精度控制试样温度，以及能够迅速地进行升温、降温。根据本发明，能够进行高速、高精度、高扩增率的PCR反应。此外，本发明能够防止由于加热试样溶液而导致的试样液的蒸发，因此有利于使用微量试样的PCR反应。
图1是示出了本发明的反应控制装置的整体结构的示意图。图2是在本发明的反应控制装置中使用的热交换槽的示意图。图3是示出了在本发明的反应控制装置中使用的反应槽的形态和冻结干燥试剂的溶解方法的示意图。图4是示出了在本发明的反应控制装置中使用的圆柱形的反应框和向热交换槽安装的安装方法的示意图。图5是示出了在本发明的反应控制装置中使用的阀的切换顺序的示意图。图6的㈧是示出了使用本发明的反应控制装置进行的与温度变化相关的数据的图，图6的(B)是示出了使用本发明的反应控制装置进行的PCR反应的结果的图。图7是示出了在本发明的反应控制装置中使用的载玻片型反应框和向热交换槽安装的安装方法的示意图。图8是示出了在本发明的反应控制装置中使用的滑动型活塞阀的驱动机构的示意图。图9是示出了在本发明的反应控制装置中使用的滑动型活塞阀的驱动机构的示意图。图10是示出了在本发明的反应控制装置中使用的回转阀式阀的驱动机构的示意图。图11是示出了在本发明的反应控制装置中使用的利用隔膜(membranev)的温度变化机构的示意图。图12是示出了在本发明的反应控制装置中使用的温度设定型阀的驱动机构的示意图。图13是示出了在本发明的反应控制装置中使用的热交换槽的结构的一个例子的示意图。
具体实施例方式接下来，参照附图对本发明的实施方式进行说明，但这些实施方式是例示，本发明的范围不限于此。图1是表示本发明的反应控制装置的一个实施方式的整体结构的示意图。本发明的反应控制装置主要具有反应槽(reaction vessel) 1、反应槽框2、热交换槽(heat exchange vessel) 3、液体储存箱(liquid reservoir tank) 4、热源 5、搅拌机构 6、泵 7、切换阀8、旁通流道9以及辅助温度控制机构10。优选还具有荧光检测器201、用于传送控制信号203的控制分析部202以及光学窗(或孔)204。虽然反应槽1主要能够由具有多个凹部(well)的金属薄板或硅等的薄板等构成， 金属包括铝、镍、镁、钛、钼、金、银以及铜等，但只要是热传导性高且不妨碍PCR的材料即可，并不限于此。此外，也可以用塑料等具有亲水性且防止金属的腐蚀的材料覆盖金属薄膜的表面。优选薄板在凹部区域的厚度为比周围薄，以提高热传导性，一般为10至30微米左右的厚度，但不限于此。为了确保整体强度，相邻的凹部之间的区域优选形成得更厚，厚度一般在100微米至500微米的范围内，但不限于此。反应槽1 一般固定在方形、圆形等形状的反应槽框2的底面并形成为一体。反应槽1以及反应槽框2 —般构成为相对于热交换槽 3能够装卸(参照图4)。在热交换槽3中导入热交换用的液体来使用。被导入的液体的温度通过在液体储存箱4的内部配置的热源5来控制。为从热源5的表面迅速带走热量，并使液体储存箱4 内部的温度均勻，优选具有搅拌机构6。液体储存箱4中的液体通过泵7被导入流道内部。 借助切换阀8，液体被导入热交换槽3，或者通过导入旁通流道9而直接返回液体储存箱4。 根据需要，通过辅助温度控制机构10精细地控制液体的温度，从而抑制液体储存箱4内部的温度变动。作为向热交换槽3中导入的液体，可以使用水，但不限于此，只要是热容量大且粘性低的液体(例如液体氨)即可，能够使用任意的液体。此外，通过使用例如与水相比沸点高的液体，能够确实地使试样液达到100°C，或者，通过使用与水相比凝固点低的液体，能够一边确实地防止在装置内循环的液体的凝固，一边进行到水的凝固点为止的温度的变化。如图1所示，优选在反应槽框2上配置使荧光染料的激发光及荧光透过的光学窗 204，以便能够针对一个或多个反应槽的每一个测量因反应槽1内的试样液的反应而变化的试样液中的荧光染料的荧光强度的变化。此外，通过配置荧光检测器201，能够测量所测量出的各反应槽1的荧光强度随时间的变化。在图1的实施例中，多个荧光检测器201中的每一个内具有激发光照射机构和荧光检测机构，例如，在进行PCR反应时，能够独立测量滴落有不同的引物或不同的试样的多个反应槽1各自的不同的PCR扩增信息。此外，由荧光检测器201取得的荧光强度数据被控制分析部202记录，控制分析部202具有用于估算通过PCR反应所得到的试样液内的DNA量或mRNA量的功能。控制分析部202还具有如下功能以及基于该结果来控制阀切换的机构，该功能为，取得切换阀8的切换信息，并根据荧光强度随时间的变化来估算阀切换后的试样液的温度变化是否达到目标温度的功能。这是， 利用荧光染料普遍具有的基于水分子的运动的荧光猝灭依存于液体温度的这一现象，基于荧光强度在单位时间的变化量变小或变成零的情况来估算的，尤其对确认是否处于使DNA 变性的高温状态很有效。此外，在图1所示的实施例中，虽然示出了在各反应槽1上分别配置一个检测器的结构，但是也可以组合荧光激发用光源和冷却型CCD照相机等能够进行荧光定量检测的照相机，来测量多个反应槽1的荧光强度变化。或者，在使用比反应槽1的数量少的检测器时， 可以将在X-Y面上能够高速移动的机械式驱动机构与检测器组合来测量全部反应槽1的荧光强度。此外，虽然试样液的容量通常在每个凹部为数μ L以下，但是能够使用在每个凹部为0. 1 μ L 100 μ L的范围，优选在每个凹部为0. 5 μ L 10 μ L，更优选在每个凹部为 IyL 10 μ L，在每个凹部为IyL 5μ L更佳，在每个凹部为IyL 2μ L最佳。在凹部中除了试样液，也可以含有用于防止试样液蒸发的矿物油(mineral oil)等。作为矿物油的容量，优选为数PL(例如3 4yL)左右，但不限于此，根据凹部的大小和试样量适当变更对本领域的技术人员是显而易见的。图2是在本发明的反应控制装置中使用的热交换槽3的示意图。作为基本结构，热交换槽3具有导入不同温度的液体的入口(inlet)A(ll)、入口 Β(12)。此外，热交换槽3具有用于使热交换槽3的液体返回液体储存箱4的多个出口即出口 Α(13)以及出口 B (14)。图 2的A示意地示出从入口 A(Il)导入来自液体储存箱4的某种温度的液体，并从出口 Α(13) 将液体排出的状况，图2的B示意地示出从入口 B (12)导入来自液体储存箱4的另一种温度的液体，并从出口 B(14)将液体排出的状况。入口的数量不限定于两个，能够准备与试样液的温度的变化目标温度的数量一致的多个入口，即可以准备两个以上的多个入口。例如， 在要实现具有三种温度的系统时，入口的数量变为三个。出口的数量也与入口的情况相同， 不限定于两个。另外，图2中的箭头大致示出了导入热交换槽3或从热交换槽3排出的液体的流动方向。考虑液体的热容量或温度的稳定性等，在热交换槽3和液体储存箱4之间循环的液体的总容积通常在数十HiL以上，优选为IOOmL以上，为200mL以上更佳，为300mL以上最佳。考虑装置的可搬运性等，能够适当设定容积的上限。优选热交换槽3的容量为每个凹部的试样量的约10倍以上，为约100倍以上更佳，若为约1000倍以上则最佳。一般地，相对于1个凹部，优选热交换槽的容量为约 0. OlmL IOmL,为约0. 05mL 5mL更佳，为约0. ImL 2mL最佳。图3是示出了在本发明的反应控制装置中使用的反应槽的形态和冻结干燥试剂的溶解方法的示意图。能够使用各种形状的反应槽或凹部，图3的A作为一个例子分别示出了与热交换槽的液体接触的面为平底状的反应槽A (21)、与热交换槽的液体接触的面为半球状的反应槽B(22)、与热交换槽的液体接触的面为三棱锥状的反应槽C(23)、与热交换槽的液体接触的面为球状的反应槽D (24)。若考虑热传导的效率，则本领域的技术人员能够容易理解，与热交换槽的液体接触的面的面积越大效率越高。若事先冻结干燥反应中需要的试剂则很便利。如图3的B所示，能够在反应槽26 的底部事先调制冻结干燥试剂25。此外，若在分配试样时使用的分配器27内部事先形成柱塞状的冻结干燥试剂25，则能够通过使试样液28上下移动来使试剂溶解在试样中。或者， 也能够通过事先在捆绑有尼龙纤维等的纤维球29表面上形成冻结干燥试剂25，然后向反应槽26内部的试样28中插入并搅拌来溶解冻结干燥试剂。图4是示出了在本发明的反应控制装置中使用的圆柱形反应框32以及向热交换槽37安装的安装方法的示意图。由于不方便直接用手操作由薄膜构成的反应槽，所以如图 4的A所示，若将反应槽31固定在反应槽框32上则很便利。优选反应槽框32用作为绝热材质的聚苯乙烯、聚碳酸酯、PEEK、丙烯等形成。此外，优选抑制与反应槽31的结合面积使其尽可能小(例5mm2以下)，以便使反应槽31迅速且高精度地升温、降温。图4的B示出了作为在热交换槽37上安装反应槽31的一个形态，事先在反应槽框32的表面上形成螺纹牙34，将反应槽框32拧入热交换槽37的反应槽支座33的方法。 如图4的B所示，为了保持水密性，优选在开口部安装密封件35。图4的C还示出了其它安装方法。如图4的C所示，也能够采用锥状反应槽框36，仅靠压力安装在热交换槽38上。图5示出了在本发明的反应控制装置中使用的阀的切换机构的具体例子。示出了用于向反应槽导入液体的入口阀A(41)、入口阀B(43)、用于将液体向外部导出的出口阀 A(42)和出口阀B(44)。从入口阀A(41)导入的液体从出口阀A(42)返回液体储存箱4，从入口阀A(43)导入的液体从出口阀B(44)返回其它液体储存箱4。通过交替更换这两个状态， 能够使反应槽中的试样反应。作为最优选的阀切换方法，除上述的两个状态以外，通过瞬间同时开放入口阀B(43)和出口阀A(42)，或瞬间同时开放入口阀A(41)和出口阀B(44)，能够抑制不同温度的液体混合，使各系统的液体储存箱的温度控制变得容易。液体的循环速度没有特别的限定，但是通常约ImL/秒 IOOmL/秒，5mL/秒 50mL/秒更佳，7mL/秒 15mL/秒最佳。图6的A示出了基于与通过使用所述机构实现的温度控制相关的数据所得到的曲线图。如图6的A所示，在1.5秒这样短的时间内，能够使温度从60°C上升至92°C，然后返回60°C。图6的B示出了实时PCR的结果的曲线图。进行PCR时的溶液条件如下。以反应缓冲液 1. 0μ L、2mM dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP) 1 μ L、25mM 硫酸镁 1. 2 μ L、10%胎牛血清 0· 125 μ L,SYBR Green I (核酸染料)0. 5 μ L、引物 2 种各 0. 6 μ L、杀菌水 3. 725 μ L、K0D plus polymerase (高保真聚合酶)0. 25 μ L、染色体组DNA1. 0 μ L的比例混合。作为温度条件，首先以95°C进行10秒，接着以95°C进行1秒、以60°C进行3sec的这样的温度变化进行 40个周期。液体的循环速度约在IOmL/秒。图7示出了在本发明的反应控制装置中使用的反应槽59以及反应槽框51相对于热交换槽装卸的装卸方法的变形例。反应槽59安装在载玻片型反应槽框51上(图7的 A)。在将该载玻片型反应槽框51安装在热交换槽上时，能够使反应槽框51沿着导轨53横向滑动，并按压固定在密封件54上(图7的B)。或者，也能够将载玻片型反应框51插入滑动支座55，通过活用铰链56按压在密封件57上(图7的C)。图8是示出了在本发明的反应控制装置中使用的阀的切换机构的变形例的示意图，示出了与图5表示的不同的滑动型活塞阀的驱动机构。作为改变反应槽66的温度的阀机构，使用能够左右滑动的活塞65。在活塞65的左侧，从入口 A(61)将液体导入热交换槽 67，从出口 A(62)将液体向外部导出。在活塞65的右侧，从入口 B(63)将液体导入热交换槽67，从出口 B(64)将液体向外部导出。若活塞65相对于反应槽66向右滑动，则反应槽 66达到与从入口 A(61)导入的液体的温度平衡的状态，相反若向左侧滑动，则达到与从入口 B(63)导入的液体的温度平衡的状态。此外，当活塞65位于反应槽66的正下方时，能够不漏出液体地卸下反应槽66。优选活塞65用绝热良好的材料制作，或者，活塞65的内部成为空洞，用气体充满或处于真空状态。另外，图8中的箭头大致示出了液体的流动方向。图9示出了在本发明的反应控制装置中使用的活塞阀的活塞的驱动机构的几个变形例。作为一个方法，使活塞71与活塞杆72成为一体，从外部直接使活塞移动(图9的 A)。作为另一个方法，用铁、镍等的强磁性材料制作活塞73，或在用其它材料所制作的活塞的内部装入磁铁74，并且，在外部设置电磁线圈75，通过控制电流，使活塞73左右滑动(图 9的B)。作为又一个方法，通过控制入口侧的压力或出口的流体阻力，利用活塞76的两侧的压力差使活塞76左右滑动(图9的C)。另外，图9中的空心箭头示出了活塞的运动方向，黑色箭头示出流体的流动，利用箭头的方向大致示出流体的流动方向，利用箭头的粗细大致示出流量大小。图10示出了在本发明的反应控制装置中使用的阀的切换机构的其他方式。结合了作为旋转轴的棒82的由倾斜的椭圆形板构成的回转阀81插入剖面为圆形的热交换槽83 的内部。回转阀81将热交换槽83分为左侧部分和右侧，通过转动旋转轴82，能够将从热交换槽的右侧部分或左侧部分导入的液体导向反应槽84。作为图10中的回转阀81的形状，为倾斜的平板，但也能够是其它螺旋螺纹等的形状，只要是通过使旋转轴旋转产生出同样效果的形状即可。另外，图10中的黑色箭头大致示出旋转轴82的旋转方向，空心箭头大致示出液体的流动状况。图11示出了通过阀以外的结构置换液体的结构。热交换槽98通过隔膜A (95)和隔膜B(96)被隔开。从入口 A(91)所导入的液体通过出口 A(92)导出至外部。由于存在隔膜，不会从入口 B(93)或出口 B(94)导出(图11的A)。从入口 A(91)导入的液体的压力大于从入口 B(93)导入的液体的压力时，通过向左侧推压隔膜A(95)和隔膜B(96)，从入口 A (91)导入液体的热量传递至反应槽97 (图11的B)。当从入口 A (91)和入口 B (93)导入的液体的压力的关系相反时，反应槽97的温度达到与从入口 B (93)导入的液体的温度平衡的状态(图11的C)。优选隔膜由耐热橡胶等耐热性良好的薄的膜制作。另外，图11中的箭头大致示出液体的流动方向。
图12示出了在本发明的反应控制装置中使用的温度设定型阀的又一个驱动机构的示意图。在本发明中，能够设定的温度不限定于两种。在图12中，示出了能够设定三种以上的反应槽的温度的结构。在热交换槽103中，插入有在侧面形成有槽102的回转阀 101。在回转阀101的两侧设置有入口和出口，例如从入口 A(104)所导入的液体经过流道 108流入槽102，将热量传递至反应槽109之后，从出口 A(105)向外导出。与此相对，从入口 B (106)所导入的液体不与反应槽109接触，从出口 B (107)向外导出。然而，通过使回转阀101旋转，能够使从任意的入口所导入的液体与反应槽接触(图12的C)。伴随经过的时间111，通过使回转阀101旋转，能够如图12的C的曲线所示那样使温度110变化。优选回转阀101由绝热材料制作。图13示出了在本发明的反应控制装置中使用的热交换槽的结构的一个例子的示意图。上方图A是其侧视图，下方图B是俯视图。参照图13，反应槽1具有用于放入试样的配置成阵列状的凹状的多个凹部306。在反应槽1的下部，经由0形环305接触配置热交换槽3，利用从入口 All以及入口 A12导入至热交换槽3的热交换液来调节反应槽1的温度。在反应槽1的上部，紧贴配置有蒸发防止机构301。通过该蒸发防止机构301，能够防止试样液因被来自热交换槽1的热量加热而蒸发散失。蒸发防止机构301主要具有紧贴构件302、光学上透明的构件(例如玻璃加热器)303以及根据需要的高分子片材304。高分子片材304能够提高紧贴构件302与反应槽 1的紧贴性。对于放入凹部306的试样溶液，由荧光检测器202经光学上透明的构件303， 检测试样的荧光强度的变化，该荧光检测器202由控制分析部201控制动作。在图13所示的实施例中，能够反复使在各凹部306中装载的液量为1微升至10微升的微量反应液的液滴快速地进行温度变化，来进行PCR反应。首先，将载有PCR溶液的液滴的反应槽1配置为经由0形环305紧贴在热交换槽3上。在热交换槽3上连接有热交换液用的多个入口，从入口注入两种以上的不同的温度的热交换液。在本实施例中，作为进行两种温度的热交换的一个例子，示出了入口 All和入口 B12，但入口数不限于此，根据需要， 同样为了在反应槽1实现三种以上的不同的温度，能够构成三个以上的入口。为了能够从外部通过荧光检测器101等的光学装置观察反应槽1的凹部306中的反应液的液滴的荧光强度的变化等的光学指标，蒸发防止机构301的上面的光学透明构件 303由玻璃或塑料等的光学上透光的透明材料构成。进而，该光学上透明的构件303也可以做成玻璃加热器，即，在上述的光学上透明的材料的表面上附加发热部，使光学上透明的玻璃和发热部一体化，该发热部能够由ITO(Indium Tin Oxide 氧化铟锡)等流经电流能够使温度上升的光学上透明的材料制成。使用这样的玻璃加热对蒸发防止机构的上表面进行加热，能够防止使反应槽1的PCR溶液的液滴蒸发。因此，蒸发防止机构301的一个例示的实施方式包括使光学上透明的玻璃与发热机构一体化而成的玻璃加热器303、密封构件302、使反应槽1与密闭构件302紧贴的高分子片材304。通过以蒸发防止机构301与热交换槽3来夹持反应槽1，即使存在微量的反应液的蒸发，反应槽1和蒸发防止机构301之间的空间内也立即变为饱和蒸气压。在变为该饱和蒸气压时，为了不使水蒸气在密封构件302以及玻璃加热器303等的内壁上结露，例如， 能够通过使与外部空气接触的玻璃加热器303温度在80°C至110°C的范围内进行加热，来防止水蒸气的结露。此外，这样在被玻璃加热器303加热的玻璃表面具有防雾的效果，并具有不妨碍使用荧光检测器101检测反应液的荧光量的优点。能够通过使用高分子片材304等来提高密封构件301的密封性能。作为可使用的高分子片材，有橡胶、硅等，但不限于此。此外，由于使蒸发防止机构与反应槽1之间的空间的容积变得越小，就越能够将达到水蒸气压的水蒸气的全部容量抑制在更少量，因此使玻璃加热器303和反应槽1的表面之间的距离尽可能小是有利的。优选玻璃加热器303与反应槽1的表面之间的距离在约 IOmm以下，优选在约7mm以下，在约5mm以下更佳，约3mm以下最佳。此外，在本实施例中， 针对蒸发防止机构301的上表面的加热机构，作为一个例子使用了玻璃加热器303，但同样也可以使用在具有加热机构或热传导系统的金属板等上配置能够由荧光检测器101检测液滴的荧光的光学上透明的窗而形成的构件，来代替玻璃加热器303。此外，在使用蒸发防止机构时，即使是微量的液滴也能够防止蒸发，所以可以不在液滴上配置矿物油等液层。这样一来，在如图13所示的实施例中，能够防止由热交换槽3的热量使反应槽的水滴的蒸发而导致的试样液的散失。产业上的利用可能性本发明有利于作为用于进行希望严密控制试样的温度的反应的反应装置。本发明还有利于作为用于进行希望使试样的温度迅速改变的反应的反应装置。本发明尤其有利于作为能够进行高速、高精度、高扩增率的PCR反应的PCR装置。 本发明的装置能够小型化，因此有利于作为便携式PCR装置。此外，本发明能够防止由加热试样溶液导致的试样液蒸发，因此有利于作为使用微量的试样的PCR反应。附图标记说明如下1反应槽2反应槽框3热交换槽4液体储存箱5 热源6搅拌机构7 泵8切换阀9旁通流道10辅助温度控制机构11 入口 A12 入口 B13 出口 A14 出口 B21、22、23、24、26 反应槽25冻结干燥试剂27分配器28 试样
四纤维球31反应槽32反应槽框33反应槽支座34螺纹牙35密封件36锥状反应槽框37、38热交换槽41 入口阀 A42 出口阀 A43 入口阀 B44 出口阀 B51载玻片型反应槽框52、58热交换槽的反应槽支座53 导轨54、57 密封件55滑动支座56 铰链59反应槽61 入口 A62 出口 A63 入口 B64 出口 B65 活塞66反应槽67热交换槽71 活塞72活塞杆73 活塞74 磁铁75电磁线圈76 活塞81回转阀82旋转轴83热交换槽84反应槽91 入口 A92 出口 A93 入口 B
94 出□ B
95隔膜A
96隔膜B
97反应槽
98热交换槽
101回转阀
102槽
103热交换槽
104 人□ A
105 出口 A
106 入口 B
107 出口 B
108流道
109反应槽
110温度
111经过时间
201荧光检测器
202控制分析部
203控制信号
204光学窗
301蒸发防止机构
302密封构件
303玻璃加热器
304高分子片材
305 0形环
306 凹部(well)
权利要求
1.一种液体回流型反应控制装置，具有反应槽，其具有用于放入试样的一个或多个凹部，热交换槽，其与所述反应槽相接触设置，以便向所述反应槽传递热量，并且，该热交换槽具有分别用于导入以及排出规定的温度的液体的入口以及出口，多个液体储存箱，具有能够控制温度的热源，所述热源用于将所述多个液体储存箱中的液体分别保持在规定的温度，管状的流道，其将所述热交换槽的所述入口及所述出口与所述液体储存箱相连接， 泵，其设置在所述管状的流道上，用于使所述液体在所述热交换槽与所述液体储存箱之间循环，切换阀，其设置在所述管状的流道上，用于控制所循环的所述液体的流动，通过以规定的时间间隔切换来自所述多个液体储存箱的规定的温度的所述液体向所述热交换槽流入， 由此将所述反应槽的温度控制在所希望的温度；所述试样的量在每个凹部为数PL以下，所循环的所述液体的总容积在每个液体储存箱为数十mL以上。
2.如权利要求1记载的液体回流型反应控制装置，其中， 所述液体回流型反应控制装置作为PCR装置来使用。
3.如权利要求1或2记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有荧光检测单元，在所述试样中含有荧光染料的情况下，所述荧光检测单元与对所述反应槽的温度切换动作连动地检测所述凹部内的所述荧光染料发出的荧光，以此测定荧光强度随时间的变化。
4.如权利要求3记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述荧光检测单元设置为分别与所述反应槽的各所述凹部相对应。
5.如权利要求3或4记载的液体回流型反应控制装置，其中， 还具有估算单元，其基于在所述反应槽的一个或多个凹部中配置的所述试样液的荧光强度变化，来估算试样液的温度变化；变化单元，其基于所述估算的结果，使所述反应槽的温度迅速变化。
6.如权利要求1 5中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中， 所述液体储存箱的数量与所述反应槽的要设定的温度的数量相同。
7.如权利要求6记载的液体回流型反应控制装置，其中， 所述液体储存箱的数量为2个或3个。
8.如权利要求1 7中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽的底面以及壁面的厚度为1微米至100微米且由金属或硅形成，所述金属包括铝、镍、镁、钛、钼、金、银、铜。
9.如权利要求1 8中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中， 所述凹部的底面的形状为平底状、半球状、三棱锥状或球状。
10.如权利要求1 9中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，在所述凹部的每一个中预先内置有反应所需的干燥状态的试剂，该试剂与试样溶液接触时溶出并进行反应。
11.如权利要求1 10中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽还具有用于使对于来自该反应槽内的所述试样的光学信号的测定变得容易的孔或光学窗。
12.如权利要求1 11中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽设置为相对于所述热交换槽能够装卸。
13.如权利要求12记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽相对于所述热交换槽的装卸方式为以下方式中任一方式(a)方式，在所述反应槽的外周设置筒状的框，在所述热交换槽上设置筒状的反应槽支座，并且，在所述反应槽的所述框的外表面和所述热交换槽的反应槽支座的内表面上设置有螺纹牙，通过沿着该螺纹牙的旋转运动，将所述反应槽能够装卸地安装在所述热交换槽上；(b)方式，将所述反应槽的外周的所述筒状的框以及所述热交换槽的所述筒状的反应槽支座分别设置成锥状，将所述反应槽能够装卸地压接在所述反应槽支座上；(c)方式，将所述反应槽固定在载玻片状的反应槽框内，在所述热交换槽的反应槽支座上设置有导轨，将所述载玻片状的反应槽框沿着该导轨能够装卸地进行安装；以及(d)方式，将所述载玻片状的反应槽框插入具有铰链的滑动支座，通过基于该铰链机构的旋转动作，将所述载玻片状的所述反应槽框能够装卸地安装在所述热交换槽的所述反应槽支座上。
14.如权利要求12或13记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有在特定状态下将所述反应槽从所述热交换槽卸下的机构，该特定状态是指，既能够维持使所述液体回流的状态，又能够不使所述液体向所述液体回流型反应控制装置的外部漏出的状态。
15.如权利要求1 14中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体储存箱具有热源控制系统，所述热源控制系统具有热源、温度计、液体搅拌系统，该液体搅拌系统对该液体储存箱内的液体连续地或以占空比在10%以上进行搅拌，能够将该液体储存箱内的该液体的温度分布抑制在5°C以内。
16.如权利要求1 15中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有对所述切换阀的动作进行控制的切换阀控制机构。
17.如权利要求1 16中任一项记载的液体回流型反应控制系统，其中，所述切换阀能够将所述多个液体储存箱中的任意的液体储存箱的液体导入所述热交换槽，并能够使所述热交换槽中的所述液体返回到原来的液体储存箱。
18.如权利要求16或17记载的液体回流型反应控制装置，其中，控制所述切换阀，使得在通过控制所述切换阀来置换所述热交换槽内的所述液体时， 使所述热交换槽内部的所述液体导入至保持与所述液体的温度最接近的温度的液体储存箱。
19.如权利要求1 18中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有辅助温度控制机构，该辅助温度控制机构包括绝热材料、加热器以及冷却机构， 用于抑制用于将所述切换阀与所述液体储存箱相连接的所述流道内部的所述液体的温度的变动。
20.如权利要求1 19中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，在所述切换阀内还具有抑制温度变化的机构，不管用于将所述切换阀与所述液体储存箱相连接的所述流道内部的所述液体是否导入至所述热交换槽，通过与来自所述液体储存箱的所述液体连续置换，来抑制温度的变化。
21.如权利要求1 20中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述切换阀由在剖面为圆形或多边形的中空结构内滑动的活塞构成，通过该活塞的位置来控制与所述反应槽相接触的液体的温度。
22.如权利要求21记载的液体回流型反应控制装置，其中， 在所述切换阀中，(a)对与该活塞相连接的活塞杆施加机械外力，(b)使用自身为磁性体的活塞或在内部安装有磁性体的活塞，借助该活塞与在所述切换阀外部配置的含有电磁线圈的磁场发生机构之间的相互作用，或者(c)在活塞两端产生因循环的所述液体流动而引起的压力差， 来使所述活塞滑动。
23.如权利要求1 20中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中， 在所述切换阀中，旋转体插入至所述热交换槽并能够旋转，该旋转体为圆柱状、圆盘状或圆锥状，在外表面上形成有多个槽，所述槽成为从所述液体储存箱送出的液体的流道，并且，所述旋转体上还形成有能够分别与各所述槽以流体连通的方式相连接的隧道状的流道， 所述隧道状的流道的端部分别发挥所述切换阀的入口或出口的功能， 通过使所述旋转体旋转，来使导入至所述入口的不同的温度的液体在流过所述槽部分时与反应槽外部相接触。
24.如权利要求1 23中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，作为循环的所述液体，使用热容量大且粘性低的液体。
25.如权利要求1 24中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中， 作为循环的所述液体，使用沸点比水的沸点高的液体。
26.如权利要求1 25中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中， 作为循环的所述液体，使用凝固点比水的凝固点低的液体。
27.如权利要求1记载的液体回流型反应控制装置，其中， 还具有试样蒸发防止机构，该试样蒸发防止机构包括构件，其密封并覆盖所述反应槽的所述凹部侧的表面，并且至少一部分光学上透明，以便能够以光学的方式对该凹部中的试样溶液进行观察；加热机构，其对所述构件的所述光学上透明的部分进行加热。
28.如权利要求27记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述构件与所述反应槽的所述凹部侧的表面之间的距离在3mm以下。
29.如权利要求27记载的液体回流型反应控制装置，其中，通过所述加热机构加热的所述构件的所述光学上透明的部分的温度在80°C至110°C 的范围内。
全文摘要
本发明提供了一种液体回流型反应控制装置，具有反应槽，其具有用于放入试样的一个或多个凹部，热交换槽，其与所述反应槽相接触设置，以便向所述反应槽传递热量，并且，该热交换槽具有分别用于导入以及排出规定的温度的液体的入口以及出口，多个液体储存箱，具有能够控制温度的热源，所述热源用于将所述多个液体储存箱中的液体分别保持在规定的温度，管状的流道，其将所述热交换槽的所述入口以及所述出口与所述液体储存箱相连接，泵，其设置在所述管状的流道上，用于使所述液体在所述热交换槽与所述液体储存箱之间循环，切换阀，其设置在所述管状的流道上，用于控制所循环的所述液体的流动，通过以规定的时间间隔切换来自所述多个液体储存箱的规定的温度的所述液体向所述热交换槽流入，由此将所述反应槽的温度控制在所希望的温度；所述试样的量在每个凹部为数μL以下，所循环的所述液体的总容积在每个液体储存箱为数十mL以上。
文档编号C12M1/00GK102439130SQ20108002250
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者安田贤二, 寺薗英之, 竹井弘之 申请人:国立大学法人东京医科齿科大学, 财团法人神奈川科学技术研究院