用于治疗癌症的溶瘤腺病毒的制作方法

专利名称：用于治疗癌症的溶瘤腺病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，更具体来说涉及肿瘤学领域、特别是病毒疗法领域。
背景技术：
当前的癌症治疗主要是基于化疗、放疗和手术。尽管早期阶段的癌症治愈率提高，但大多数癌症晚期病例不能治愈，因为它们不能通过手术根除，或者因为施用的放疗或化疗剂量受到它们在正常细胞中的毒性的限制。为了缓和这种形势，已经开发了设法增加肿瘤治疗的效力和选择性的生物技术策略。其中，基因疗法和病毒疗法以对抗癌症的治疗意图使用病毒。在基因疗法中，对病毒进行修饰以阻止其复制并用作治疗性遗传物质的介质或载体。相反，病毒疗法使用在肿瘤细胞中选择性复制和繁殖的病毒。在病毒疗法中，肿瘤细胞因病毒在其内部复制所引起的细胞病变效应而不是被治疗性基因的效应而死亡。在肿瘤细胞中的优先复制被称为亲瘤性(oncotropism)，肿瘤的溶胞被称为溶瘤作用 (oncolysis)。在严格意义上，在肿瘤中选择性复制的病毒被称为溶瘤的，尽管在广义上溶瘤这个词可用于能够溶解肿瘤细胞的任何具有复制能力的病毒，即使没有选择性。在本说明书中，术语溶瘤以这两种意义使用。癌症的病毒疗法早于基因疗法。使用病毒治愈肿瘤的第一次观察可以追溯到上世纪初。在1912年，De I^ce在将狂犬病病毒接种到宫颈癌中之后，获得了肿瘤消退。从那时起，已经将许多类型的病毒注射到肿瘤中用于它们的治疗。存在着表现出天然亲瘤性的病毒，例如自主性细小病毒、水疱性口膜炎病毒和呼肠弧病毒。其他病毒可以被遗传操作以在肿瘤中选择性复制。例如，通过消除核糖核苷酸还原酶基因这种在活跃增殖的细胞例如肿瘤细胞中非必需的酶活性，已将单纯性疱疹病毒(HSV)变成亲瘤性的。然而，由于其低致病性和感染肿瘤细胞的高能力，腺病毒已成为在癌症的病毒疗法和基因疗法中更经常使用的病毒。已经鉴定到51种腺病毒的人类血清型，并将其分类成从A至F的6个不同组。属于C组的人类腺病毒5型(Ac^)是由二十面体蛋白质衣壳包装了 36千碱基的线性DNA所形成的病毒。在成年人中，Ad5感染通常是无症状的，在儿童中，它引起普通感冒和结膜炎。一般来说，Ad5感染上皮细胞，在自然感染过程中是支气管上皮的细胞。它利用纤维、即从衣壳的12个顶点如天线般伸出的病毒蛋白与参与细胞间黏附的被称为柯萨奇-腺病毒受体(CAR)的细胞蛋白的相互作用而进入细胞。当病毒DNA到达核内部，它开始病毒早期基因(El至E4)的有序转录。表达的第一个病毒基因是早期区IA(ElA)的基因。ElA 与细胞蛋白Rb结合以释放E2F，后者激活其他病毒基因例如E2、E3和E4以及激活细胞周期的细胞基因的转录。另一方面，ElB与p53结合以激活细胞周期并阻止被感染细胞的凋亡。 E2编码参与病毒复制的蛋白；E3编码抑制抗病毒免疫应答的蛋白；E4编码参与病毒RNA运输的蛋白。早期基因的表达导致病毒DNA的复制，并且一旦DNA复制，主要晚期启动子被激活并驱动信使RNA转录，在差异剪接后产生编码形成衣壳的结构蛋白的所有RNA。关于溶瘤腺病毒的设计，需要考虑两个重要方面选择性和效力。为了获得对肿瘤细胞的选择性，使用了三种策略消除在正常细胞中复制所需但在肿瘤细胞中不需要的病毒功能；使用肿瘤选择性启动子控制启动复制的病毒基因；以及对参与宿主细胞感染的病毒衣壳蛋白进行修饰。使用这些遗传修饰，已获得相当高水平的选择性，其中在肿瘤细胞中的复制效率比在正常细胞中的复制效率高出10000倍左右。对于溶瘤效力来说，也已描述了用于增加它的几种遗传修饰。这些修饰包括a)增加病毒释放，例如通过消除E1B19K、过表达E3-11.6K(ADP)或将E3/19K蛋白定位在胞质膜中；以及b)将治疗性基因插入到溶瘤腺病毒的基因组中以产生“武装的溶瘤腺病毒”。在这种情况下，治疗性基因必须通过活化具有旁观者效应的前体药物(也就是说，它们杀死未感染的邻近细胞)、活化针对肿瘤的免疫系统、诱导凋亡、抑制血管发生或消除细胞外基质等，来介导未感染的肿瘤细胞的死亡。 在这些情况下，治疗性基因的表达方式和时间对于治疗方法的最终结果是至关重要的。在最近十年中，已将不同溶瘤腺病毒给药于患有头颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌和肝细胞癌等的患者。这些腺病毒在临床试验中的安全性情况是非常有希望的。检测到的不良作用例如流感样症状和转氨酶水平升高有良好的耐受性，即使是在高剂量病毒全身性给药后(可参见D. Ko等，“在转录上受调控的溶瘤腺病毒的开发(Development of transcriptionally regulated oncolytic adenoviruses)，，，Oncogene 2005，vol· 24， pp. 7763-74 ；以及Τ. Reid等，“癌症患者中的腺病毒血管内药剂来自临床试验的经验 (adenoviral Intravascular agents in cancer patients lessons from clinical trials)”，Cancer Gene Therapy 2002，vol. 9，pp. 979-86)。尽管重组腺病毒的给药引起肿瘤生长的部分抑制，但没有实现肿瘤的完全根除，并且在短时期后肿瘤重新快速生长。发生这些结果可能是因为被注射的腺病毒仅分布在一小部分肿瘤中，从而产生有限的抗肿瘤反应，而未感染细胞继续快速生长。在最近的工作中，观察到溶瘤腺病毒在人类异体移植肿瘤中的复制持续到全身给药后100天，尽管这种复制没有转变成肿瘤的完全根除(可参见H. Sauthoff等，“野生型腺病毒在人类异体移植肿瘤局部注射后的肿瘤内扩散受限病毒在晚其月时间点留存并全身扩散(Intratumoural spread of wild-type adenovirus is limited to after local injection of human xenograft tumours :virus persists and spreads systemically at late time points)，，，Human Gene Therapy 2003, vol. 14, PP. 425-33)。这种低的抗肿瘤效率部分是因为肿瘤中的结缔组织和细胞外基质(ECM)阻止了腺病毒在肿瘤内的扩散。溶瘤腺病毒这种在肿瘤团块中有效扩散的困难性对于其他抗肿瘤药物例如阿霉素、紫杉醇、长春新碱或氨甲蝶呤来说也有描述。许多研究证实了 ECM在肿瘤细胞对化疗药物的抗性中的作用(可参见BP Toole等，“透明质烷癌细胞化疗抗性和恶性的组成型调
(Hyaluronan -.a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy in cancer cells)Seminars in Cancer BioIory 2008, vol. 18，pp. 244-50)。肿瘤和基质细胞产生并组装胶原蛋白、蛋白聚糖和其他分子构成的基质，其使大分子向肿瘤内的运输变得困难。透明质酸(HA)是参与肿瘤细胞对治疗性药物的抗性的ECM的主要组分之一。HA 在各种各样的恶性组织中过表达，并且在许多情况下HA的水平是肿瘤发展的预后因子。HA 与受体CD44和RHAMM的相互作用增加了肿瘤存活和浸润。此外，HA能够通过诱导细胞黏附和迁移并抵御免疫系统来促进肿瘤转移。另一方面，抑制透明质酸与肿瘤细胞之间的相互作用逆转了对许多药物的抗性。不同研究指出，在患有黑素瘤、卡波斯肉瘤、头颈肿瘤和结肠癌的肝转移肿瘤的患者中，透明质酸酶(降解HA的酶)增加了不同化疗的活性。透明质酸酶的作用机制仍然未知，但是一般来说它被归因于降低细胞黏附屏障、降低间质压力和提高抗肿瘤药物在肿瘤中的穿透性，而不是归因于它对与细胞存活相关的信号传导途径的抑制效应。最近，已经描述利用肿瘤内注射进行透明质酸酶和溶瘤腺病毒共同给药降低了肿瘤发展(可参见S. Ganesh等，“透明质酸酶和溶瘤腺病毒的肿瘤内共同给药在转移肿瘤模 M中ii^li了^) ；力(Intratumoural coadministration of hyaluronidase enzyme and oncolytic adenoviruses enhances virus potency in mestastasic tumour models)”， Clin Cancer Res 2008，vol. 14，pp. 3933-41)。在这些研究中，溶瘤腺病毒在四次肿瘤内注射中给药，透明质酸酶在整个治疗期间每隔一日肿瘤内给药。这种给药方案对患者不太适用，因为大多数肿瘤做不到进行肿瘤内注射。患有散发疾病(转移肿瘤)的患者不能从 Ganesh和合作者提出的治疗中获益。尽管到目前为止所做的努力，但仍需要发现在癌症治疗中有效的新的治疗方法。发明概述本发明人发现，复制并在其基因组中含有透明质酸酶基因的腺病毒在肿瘤团块中被更加有效地分配。溶瘤腺病毒表达透明质酸酶引起作为肿瘤的细胞外基质的一部分的透明质酸降解。透明质酸的降解在肿瘤中产生较低的间质压力和肿瘤对腺病毒扩散的较小阻力，因此提高了病毒在肿瘤团块内的细胞到细胞扩散。这种更好的扩散被转变成溶瘤效果的增加。本发明人发现，静脉内注射本发明的溶瘤腺病毒获得了肿瘤体积的消退。因此，本发明的溶瘤腺病毒可用于癌症的治疗。此外，透明质酸酶基因的表达既不影响病毒复制也不影响溶瘤腺病毒的细胞毒性。正如前面提到的，已描述了溶瘤腺病毒和可溶性透明质酸酶的肿瘤内共同给药增加了溶瘤腺病毒的抗肿瘤效能。然而，在本发明之前，尚未将透明质酸酶基因导入任何溶瘤腺病毒中用于治疗癌症。正如在实施例中所述，本发明的溶瘤腺病毒的体内肿瘤内给药，相对于未插入透明质酸酶的腺病毒对照提高了抗肿瘤效果(参见图7)。值得注意的是，当本发明的溶瘤腺病毒静脉内注射时(参见图8和图9)，与Ganesh等的文稿的图2中所示结果相比，使用本发明的腺病毒观察到了高得多的肿瘤生长抑制。这表明本发明的治疗更加有效。使用本发明的溶瘤腺病毒(IC0WR17)注射的小鼠肿瘤与用腺病毒对照IC0WR15注射的肿瘤相比， 显示出非常大范围的坏死区域，区域具有较少活细胞以及许多大的病毒复制中心。此外，使用本发明的腺病毒，给药剂量较小在Ganesh等(同上)中，给药四次 IxIOici个病毒粒子的肿瘤内注射，而在本发明中，给药单次^clO9个病毒粒子的静脉内剂量。这意味着剂量降低20倍以及单次给药的优势。在他们的方法中，Ganesh等在整个实验中，每隔一日肿瘤内给药透明质酸酶。此外，也在治疗开始时肿瘤内给药腺病毒。病毒和透明质酸酶的这种肿瘤内给药几乎不适用于临床，因为大多数肿瘤做不到进行肿瘤内给药。据推测，透明质酸酶和腺病毒的可溶性共同给药不能通过全身途径来进行，因为这两种组分一起到达生物体中散在的肿瘤细胞的可能性低。本发明允许在病毒复制发生的位点和时刻表达透明质酸酶。透明质酸酶的这种表达改进了病毒在肿瘤团块中的分布并增加其抗肿瘤效力。将调整过的对动物无毒并具有极大治疗效能的剂量进行给药是可行的。在本发明中，溶瘤腺病毒到达靶肿瘤细胞。一旦进入后，病毒复制，表达其衣壳蛋白，并且在同时表达腺病毒基因组中编码的透明质酸酶。该透明质酸酶已被修饰成释放到细胞周围的细胞外介质中。在细胞外介质中，透明质酸酶破坏基质并协助已经复制的腺病毒感染邻近的肿瘤细胞。因此，本发明的一个方面涉及包含在其基因组中插入的编码透明质酸酶的序列的溶瘤腺病毒。当在本文中使用时，术语“溶瘤腺病毒”是指在肿瘤细胞中能够复制或者有复制能力的腺病毒。在本说明书中，溶瘤腺病毒和复制型腺病毒是同义词。它们与非复制型腺病毒不同，因为后者不能在靶细胞中复制。非复制型腺病毒是在基因疗法中用作针对靶细胞的基因的载体的腺病毒，因为目的是在完整细胞内表达治疗性基因而不是裂解细胞。相反， 溶瘤腺病毒的治疗作用是基于复制和裂解靶细胞、特别是待消除的肿瘤细胞的能力。本发明的另一方面涉及包含治疗有效量的溶瘤腺病毒与可药用载体或赋形剂在一起的药物组合物。本发明的另一方面涉及本发明的溶瘤腺病毒作为药物的应用。本发明的另一方面涉及本发明的溶瘤腺病毒用于在哺乳动物包括人类中治疗癌症或癌症的恶变前形式。本发明的另一方面涉及溶瘤腺病毒的应用，其用于制造在哺乳动物包括人类中治疗癌症或癌症的恶变前形式的药物。治疗是基于这些溶瘤腺病毒在肿瘤中的复制。或者， 本发明的这一方面可以设计成用于在哺乳动物包括人类中治疗癌症或癌症的恶变前形式的方法，其包含向所述哺乳动物给药有效量的溶瘤腺病毒。本发明的另一方面涉及能够与腺病毒基因组重组以构建本发明的溶瘤腺病毒的穿梭载体。这种载体包含腺病毒的反向的、末端重复的序列(“反向末端重复序列”，ITR)、 促进透明质酸酶编码序列的表达的序列、编码该酶的序列以及聚腺苷化序列。在具体实施方案中，本发明的溶瘤腺病毒是人类腺病毒，意味着其感染人类。具体来说，人类腺病毒选自人类腺病毒血清型1-51及其衍生物。“衍生物”是指来自腺病毒的两种或多种不同血清型、例如腺病毒血清型5与腺病毒血清型3的纤维的重组腺病毒杂合体。 在本发明的具体实施方案中，人类溶瘤腺病毒来自于血清型5。透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族。在人类中，存在编码具有不同性质和位置的透明质酸酶的6个基因。同工型Hyall和Hyal2存在于大多数组织中。Hyall是人类血浆中的优势形式。Hyal3存在于骨髓和睾丸中，但是其功能还没有被良好地表征。透明质酸酶PH20在睾丸中高表达，并参与卵母细胞被精子受精的过程。透明质酸酶PH20锚定于精子的胞质膜和内部顶体膜，并赋予精子穿透卵丘的细胞外基质(富含透明质酸)以到达卵母细胞的透明带的能力。在顶体反应期间，锚定于精子膜上的透明质酸酶部分受到酶的加工，产生从顶体膜释放的可溶形式的蛋白。此外，透明质酸酶已被鉴定为是蛇、蜘蛛、蝎子和黄蜂毒素的扩散因子。在具体实施方案中，透明质酸酶是哺乳动物睾丸透明质酸酶，更具体是人类睾丸透明质酸酶。人类睾丸透明质酸酶(GenBank GeneID :6677)也被称为SPAMl或精子黏附分子1和PH-20。膜蛋白PH20是哺乳动物透明质酸酶家族中唯一在中性pH下具有活性的酶。编码它的基因产生两种转录变体变体1，较长，其编码蛋白的同工型KGenBank登记号NP_003108. 2)，以及变体2，其使用3’编码区处与变体1不同的剪接信号，产生具有较短 C-端的同工型2 (GenBank登记号NP_694859. 1)。在本发明的具体实施方案中，该酶序列缺失了对应于羧基端膜结合结构域的序列，以产生可溶性酶(参见图幻。该羧基端结构域的缺失导致透明质酸酶分泌到细胞外介质。因此，获得了表达在中性PH下具有酶活性的分泌性透明质酸酶的溶瘤腺病毒。在具体实施方案中，插入到腺病毒基因组中的序列是编码SEQ ID NO :1的序列。在更具体实施方案中，插入的序列是SEQ ID NO :2ο在另一个实施方案中，酶序列被插入在溶瘤腺病毒中腺病毒纤维的核苷酸序列之后。在另一个具体实施方案中，酶的表达受到在动物细胞中有活性的启动子的控制。 具体来说，启动子选自细胞巨细胞病毒启动子、腺病毒主要晚期启动子、SV40启动子、单纯性疱疹病毒胸苷激酶启动子、RSV启动子、EFl α启动子、β -肌动蛋白启动子、人类IL-2启动子、人类IL-4启动子、IFN启动子、E2F启动子和人类GM-CSF启动子。控制酶表达的启动子可以是腺病毒的天然启动子，正如腺病毒主要晚期启动子的情况(参见图l(a)，MLP，“主要晚期启动子”)。启动子也可以紧挨编码酶的序列插入。在优选实施方案中，启动子是腺病毒主要晚期启动子。本发明的复制型腺病毒可以在其基因组序列中具有使其在肿瘤细胞中选择性复制的修饰。在具体实施方案中，这通过插入组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子来实现。 该启动子控制Ela、Elb、E2和E4中的一个或多个基因的表达。具体来说，启动子选自E2F 启动子、端粒酶hTERT启动子、酪氨酸酶启动子、前列腺特异性抗原(PSA)启动子、甲胎蛋白启动子、C0X-2启动子，以及由几种转录因子结合位点例如缺氧诱导因子(HIF-I) ,Ets转录因子、肿瘤细胞毒性因子(tcf)、E2F转录因子或Spl转录因子的结合位点形成的人工启动子。优选，启动子控制Ela的表达。在肿瘤中获得选择性复制的另一种修饰是对阻断视网膜母细胞瘤(RB)途径的 ElA功能的消除。与pRB直接相互作用的其他病毒基因例如E4和E4orf6/7，是可以被消除以在肿瘤中获得选择性复制的候选物。如实施例中所示，溶瘤腺病毒IC0WR17的特征在于同时包含透明质酸酶基因、影响Ela与pRB的相互作用的Δ 24缺失、在Ela的内源启动子中插入4个E2F1结合位点和1个Spl结合位点以控制Ela的表达，以及最后在腺病毒纤维中插入RGD肽以增加病毒的染性。IC0WR17是本发明的优选实施方案。用于在肿瘤中获得选择性复制的另一种描述过的修饰是消除编码病毒相关 RNA(VA-RNA)的腺病毒基因。这些RNA阻断干扰素的抗病毒活性，并且当缺失时，腺病毒变得对干扰素引起的抑制敏感。因为肿瘤细胞的特征在于截断干扰素途径，因此这样的腺病毒在肿瘤中以正常水平复制。因此，在另一个具体实施方案中，使用选自腺病毒的Ela、Elb、 E4和VA-RNA的一个或多个基因中的突变来获得在肿瘤中的选择性复制。优选，突变在Ela 中。这两种在肿瘤中获得选择性复制的策略彼此不排斥。在本发明的另一个实施方案中，腺病毒在其衣壳上具有修饰以增加其侵染性或将其导向肿瘤细胞中存在的受体。在优选实施方案中，对腺病毒衣壳蛋白进行遗传修饰，以包含增加侵染性或将病毒导向肿瘤细胞中的受体的配体。将腺病毒靶向肿瘤，也可以使用一侧结合病毒而另一侧结合肿瘤受体的双功能配体来实现。另一方面，为了增加腺病毒在血液中的持久性并因此增加到达散在肿瘤结节的可能性，可以将衣壳用聚合物例如聚乙二醇覆盖。在优选实施方案中，溶瘤腺病毒具有通过用RGDK结构域代替腺病毒纤维中的KKTK 硫酸乙酰肝素结合结构域进行修饰、以增加其侵染性或将其更好地导向靶细胞的衣壳。在实施例中解释了具有这些特性的腺病毒IC0WR17RGDK的构建。在另一个具体实施方案中，腺病毒包含对透明质酸酶编码序列的蛋白翻译进行优化的序列。在另一个具体实施方案中，腺病毒包含促进透明质酸酶编码序列的表达的序列。 更具体来说，该序列选自允许加工RNA的剪接序列、IRES序列(“内部核糖体进入位点”) 和小核糖核酸病毒的2A序列。在另一个具体实施方案中，溶瘤腺病毒包含插入在其基因组中的、在癌症基因疗法领域中常用于增加溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的细胞毒性的其他基因。它们中的一些是胸苷激酶基因、胞苷脱氨酶基因、促凋亡基因、免疫刺激基因、肿瘤抑制基因或药物前体活化基因。腺病毒基因组中的这些修饰彼此不排斥。有几种操作腺病毒基因组的方法。构建遗传修饰的腺病毒的方法在使用腺病毒的基因疗法和病毒疗法领域中是明确建立的。更常用的方法是基于首先在含有待修饰的腺病毒区域的质粒中构建所需遗传修饰，随后在细菌中用含有病毒基因组其余部分的质粒进行同源重组。将含有本发明的透明质酸酶目的基因的腺病毒，在基因疗法和病毒疗法领域中常用的细胞系例如HEK-293和A549细胞系中进行繁殖和扩增。繁殖的优选方法是对允许腺病毒复制的细胞系进行感染。肺腺癌细胞系A549是具有这样特性的细胞系的实例。繁殖以例如下列方式进行将A549细胞接种在塑料的细胞培养板上，并使用每个细胞100个病毒粒子进行感染。两天后，作为反映病毒生产的细胞病变效应，观察细胞成簇和变圆。将细胞收获在试管中。以IOOOg离心5分钟后，将细胞沉淀冻融三次以破碎细胞。将得到的细胞提取物以IOOOg离心5分钟，并将带有病毒的上清液负载到氯化铯梯度上，并以35000g 离心1小时。将从梯度获得的病毒带负载到另一个氯化铯梯度上，并再次以35000g离心16 小时。收获病毒带并对PBS-10%甘油进行透析。将透析过的病毒分成等份并保存在-80°C。 病毒粒子数量和空斑形成单位的定量按照标准方案来进行。含有5%甘油的磷酸盐缓冲盐水(PBQ是用于储存腺病毒的标准制剂。然而，已经描述了提高病毒稳定性的新制剂。为了其在癌症治疗中的使用，含有透明质酸酶基因的腺病毒的纯化方法与对癌症的病毒疗法和基因疗法中使用的其他腺病毒和腺病毒载体所描述的纯化方法相同。本发明的溶瘤腺病毒可以给药于哺乳动物、优选为人类。给药溶瘤腺病毒的目的是治疗包括但不限于黑素瘤、胰腺癌、结肠癌和肺癌。此外，考虑到了在肿瘤的恶变前期给药溶瘤腺病毒。应该理解，溶瘤腺病毒以可药用形式给药。本技术领域的专业人员可以使用标准程序确保适合的剂量。应该理解，剂量必须是在被治疗患者中产生肿瘤减小的溶瘤腺病毒的有效量。病毒可以直接给药到肿瘤中、肿瘤所处的体腔中、肿瘤的血管系统中、肿瘤周围， 或全身性静脉内注射到患者中。优选，给药是全身性的。
使用本发明中描述的病毒治疗癌症的方案与使用腺病毒的病毒疗法和使用腺病毒的基因疗法领域中所使用的程序相同。在基因疗法领域中使用非溶瘤和溶瘤腺病毒有大量经验。有许多出版物描述了在培养物中、动物模型中以及对患者的临床试验中治疗肿瘤细胞。对于体外培养物中的细胞治疗来说，向培养基加入通过上述任何制剂纯化的腺病毒以获得肿瘤细胞的感染。为了治疗动物模型或患者中的肿瘤，腺病毒可以通过注射到肿瘤中或肿瘤所处的体腔中进行局部区域性给药，或通过注射到血流中进行全身给药。本发明的溶瘤腺病毒可以单独或在与可药用载体或赋形剂的组合物中给药。本技术领域的专业人员将会根据具体给药方式调整组合物。组合物可以包含溶瘤腺病毒作为唯一抗肿瘤剂，或者与另一种治疗剂例如化疗药物或带有插入的治疗性基因的载体相组合。 此外，溶瘤腺病毒疗法也可以与放疗相组合。除非另有指明，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的普通专业人员所通常理解的意义相同。与本文中所述的相似或等效的方法和材料，可用于本发明的实践中。在整个说明书和权利要求书中，单词“包含”及其变化形式不打算排除其他技术特点、添加齐U、组分或步骤。对于本技术领域的专业人员来说，本发明的其他目的、优点和特点在细查说明书后将变得明显，或者可以通过本发明的实践来学到。提供了下面的具体实施方案和图作为说明，它们不打算对本发明进行限制。附图描述

图1(a)显示了以含有并表达透明质酸酶基因PH20为特征的溶瘤腺病毒的结构。 腺病毒AdwtRGD-PH20含有插入到腺病毒纤维基因之后的蛋白PH20的基因。通过将腺病毒的剪接受体IIIa(SA)插入到蛋白PH20基因之前，蛋白PH20基因的表达受到腺病毒主要晚期启动子(MLP)的调控。由于在翻译起始序列之前引入kozak序列(k)，该基因的蛋白质翻译被优化。腺病毒IC0WR15和IC0WR17是肿瘤选择性复制的腺病毒。它们的特征在于在 Ela的内源启动子中含有4个E2F结合位点和1个Spl结合位点。这两种病毒还存在其中插入了 RGD-4C肽的修饰形式的病毒纤维，以及其中多肽链的121-1 位氨基酸被缺失(ΔΜ 突变)的突变形式的ElA蛋白。此外，IC0WR17含有如AdwtRGD-PH20腺病毒中所插入的透明质酸酶PH20基因。(b)显示了插入在腺病毒Ad Δ MR⑶中代替419至422位核苷酸序列的序列。实行这种插入以插入4个E2F-1因子结合位点和1个Spl因子结合位点。标为 "nt 385-419”和“nt 422-461 ”的下划线序列对应于Ad Δ MRGD的野生型。(c)就IC0VIR15 和AdwtRGD基因组而言，显示了插入到IC0VIR17和AdwtRGD-PH20基因组中的完整盒(SEQ ID NO 4)。标出了剪接受体IIIa、k0Zak和聚腺苷化(polyA)序列。蛋白PH20的编码序列的跨度从kozak直至聚腺苷化序列。图1与实施例3相关。图2显示了 PH20蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)以及根据Kyte-Doolittle算法的亲水性图。PH20蛋白是存在于精子的质膜和顶体膜中的膜蛋白。(a)该氨基酸序列显示了负责蛋白在膜中的锚定的疏水性序列(下划线序列)。在本发明中，由病毒所表达的 PH20蛋白显示出缺失疏水性尾部。切割点标示在圆圈内。借助于该缺失，PH20蛋白被分泌到细胞外介质。(b)根据Kyte-Doolittle进行的PH20蛋白的末端100个氨基酸的亲水性图。箭头指示了疏水性消除的起点。图3证明了含有透明质酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒表达显示出透明质酸酶活性的可溶蛋白。凝胶显示，用表达透明质酸酶PH20的病毒的上清液温育的透明质酸样品已被消化，产生不同大小的寡糖。用对照腺病毒(AdwtR⑶和IC0MR15)的上清液温育的样品显示出未被消化的透明质酸。图3对应于实施例4。图4证明了透明质酸酶PH20基因的插入和表达不干扰肿瘤选择性复制的腺病毒的复制。将来自于细胞系A549(a)和SKMeU8(b)的细胞用溶瘤腺病毒IC0WR15和 IC0VIR17 (与IC0WR15的差别在于含有PH20基因)感染，并在不同时间(Y-轴，为感染后的小时)测量细胞提取物中的病毒量(总病毒，X-轴，TU/ml)。图显示出对于这两种病毒来说，病毒生产的动力学是一致的，证明了透明质酸酶PH20基因在腺病毒IC0WR17中的插入和表达不影响病毒复制。图4对应于实施例5。图5显示了包含并表达透明质酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒的体外溶瘤效能。在表达大量透明质酸的两个肿瘤细胞系SKMeU8(a)和PC3 (b)中，在体外对表达透明质酸酶PH20的腺病毒(IC0MR17)的溶瘤活性与不含透明质酸酶PH20基因的类似溶瘤病毒 (IC0VIR15)的活性进行比较。病毒诱导的细胞病变效应(CPE)被测量为受感染的细胞单层中蛋白质水平的降低(使用BCA方法测量)。将细胞以10000个细胞/孔接种在96孔板中。第二天，将细胞用病毒的连续稀释液感染。将被感染的细胞温育5天，用PBS清洗，并测量孔中残留的蛋白的量。结果显示，在体外，透明质酸酶PH20的表达不提高腺病毒的溶瘤活性，因为两种病毒的细胞毒性曲线相同。将％细胞存活对TU/细胞进行作图。图5对应于实施例5。图6证实了表达透明质酸酶PH20的溶瘤腺病毒的体内抗肿瘤活性。将人类黑素瘤细胞(SKMel28)接种在Balb/c无胸腺小鼠的各胁处。在肿瘤达到150mm3的平均尺寸后， 用PBS或IxlO8转导单位的AdwtRGD-PH20对它们进行注射(10个肿瘤/组)。(a)图显示了每组中相对于第0日的平均肿瘤生长(％ )随给药后时间(天)的变化。结果证明了表达透明质酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒与对照组(PBQ相比具有统计学显著的更高抗肿瘤活性，P < 0. 00001。100%的用AdwtRGD-PH20注射的肿瘤在注射后第27日体积消退10% 至50%，与之相反，在用PBS注射的组中消退为0%。(b)在实验结束时，通过免疫组织化学分析了用PBS或AdwtRGD-PH20注射的肿瘤中透明质酸的量。图像显示出用AdwtRGD-PH20 注射的肿瘤与对照肿瘤相比具有较低的透明质酸量。图6对应于实施例6. 1。图7显示出透明质酸酶PH20的表达提高了溶瘤腺病毒在肿瘤内给药后的抗肿瘤效果。将人类黑素瘤细胞(SKMel28)接种在Balb/c无胸腺小鼠的每侧背胁处。在肿瘤达到130mm3的平均体积后，用PBS或IxlO8转导单位的IC0VIR15或IC0VIR17对它们进行单剂注射(10个肿瘤/组)。(a)图显示了相对于第0日的平均肿瘤生长(％ )随给药后时间(天)的变化。表达透明质酸酶PH20的溶瘤腺病毒(IC0MR17)与不表达该透明质酸酶的对照腺病毒(ICOWRM)相比，显示出更好的抗肿瘤效果。(b)在处理42天后，将小鼠处死，收获肿瘤并称重。表格显示了在实验结束时肿瘤体积、肿瘤生长百分数和肿瘤重量的汇总。用IC0VIR17注射的肿瘤与用IC0VIR15注射的肿瘤(*p < 0. 05)和用PBS注射的肿瘤 (#P < 0. 05)相比显示出明显更低的肿瘤重量。与病毒能够无困难地穿过细胞单层扩散的体外情况下获得的结果不同，体内结果证明了在细胞外基质抗拒病毒扩散的肿瘤内部，透明质酸酶PH20的表达增加了溶瘤腺病毒的抗肿瘤效能。图7对应于实施例6. 2。图8显示出透明质酸酶PH20的表达提高了溶瘤腺病毒在全身给药后的抗肿瘤效果。将人类黑素瘤细胞(SKMel28)接种在Balb/c无胸腺小鼠的每侧背胁处。在肿瘤达到平均 IOOmm3 后，用 PBS 或 ^dOici 个 IC0VIR15 或 IC0VIR17(装备有 PH20 的 IC0VIRsl5)物理粒子对小鼠进行静脉内注射(8-10个肿瘤/组)。(a)图显示了每组中相对于第0日的平均肿瘤生长(％)随给药后时间(天)的变化。结果证实，透明质酸酶PH20的表达引起腺病毒的溶瘤效能的增加，因为由IC0WR17诱导的肿瘤生长的抑制明显高于对照组(IC0WR15) 所诱导的抑制Zp < 0.00001。(b)图像显示了在实验结束(第48日)时提取的肿瘤内腺病毒IC0MR15和IC0MR17的分布。用溶瘤腺病毒IC0MR17注射的小鼠的肿瘤与用腺病毒对照IC0WR15注射的肿瘤相比，显示出非常大范围的坏死区域(粗箭头)、有活细胞的区域(ν)数量减少以及许多大的病毒复制中心(用细箭头标出的具有绿色荧光的区域)。图 8对应于实施例6. 3。图9证实了表达透明质酸酶PH20的腺病毒的抗肿瘤全身活性的增加不限于一种肿瘤类型。(a)图显示了每组中胰腺肿瘤NP-18相对于第0日的平均生长(％)随给药后时间(天)的变化。#，指从第14至第30日与用PBS处理的肿瘤相比有显著性(ρ彡0，02)； &，从第14至第30日与用PBS处理的肿瘤相比有显著性(p ( 0，05) Λ从第12至第30日与用IC0VIR-15处理的肿瘤相比有显著性(ρ彡0，02)。(b)图像显示了在第30日时腺病毒 IC0VIR15和IC0VIR17在肿瘤NP-18中的分布。*，与用IC0VIR15处理的肿瘤相比ρ彡0. 01。 “ % P. a”指阳性区域的％。图9对应于实施例6. 4。图10(a)显示了溶瘤腺病毒IC0VIR17和IC0VIR17RGDK的结构。(b)显示了 IC0VIR17RGDK中修饰形式的纤维的氨基酸序列。下划线的序列对应于与人类腺病毒5型纤维的野生型形式不同的氨基酸91RGDK94。图10对应于实施例8。图11显示了两种腺病毒(IC0MR17和IC0MR17RGDK)在两个肿瘤细胞系中的溶瘤活性，所述细胞系一种是肺腺癌AM9(a)，另一种是胰腺腺癌NP-18(b)。％细胞存活对 TU/细胞。图11对应于实施例9。
实施例实施例1、溶瘤腺病毒的构建构建了两个含有透明质酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒腺病毒AdwtRGD-PH20和 IC0VIR17。通过使用A549细胞系基因组作为模板对不同外显子进行PCR扩增，然后使用含有 MfeI限制性位点的特异性侧翼引物将这些外显子相连，获得了透明质酸酶PH20的cDNA。 将得到的片段用MfeI消化，并通过连接到穿梭质粒pNKFiberRGD(其含有用RGD修饰的腺病毒纤维的序列)中进行克隆，以产生质粒pNKFiberPH20。克隆在质粒pNKFiberPH20中的对应于PH20的cDNA在SEQ ID NO :2中。SEQ ID NO 2显示了编码PH20蛋白(同工型， GenBank登记号为NP_694859. 1)的核苷酸，从起始密码子(ATG)至1467位。来自该GenBank 序列的1468至1527区域的核苷酸序列编码蛋白的疏水尾区，所述尾区将蛋白锚定到膜上。 该序列已经被缺失，它没有显示在SEQ ID NO :2中。在1468位核苷酸之后添加了翻译终止密码子TAA。实施例2、AdwtRGD_PH20腺病毒的构建为了产生腺病毒AdwtRGD-PH20，在酵母中使用同源重组将质粒pVK50cau的腺病毒纤维基因(其含有Ad5的完整序列，在纤维中具有Swa I限制性位点)，用从Notl/Kpnl消化的质粒pNKFiberPH20获得的、后面跟有透明质酸酶PH20基因的纤维基因代替。通过用I^c I消化质粒pAdwtRGD-PH20并转染到HEK293细胞中，产生了腺病毒 AdwtRGD-PH20，其特征为在主要晚期启动子的控制下表达透明质酸酶PH20基因，并且在腺病毒纤维中含有三肽R⑶。以前描述过的腺病毒AdwtRGD的特征在于在腺病毒纤维中含有三肽RGD (参见M. Majem等，“将ElA控制在用肌强直性营养不良基因座隔离物隔离的E2F-1启动子下降低了溶瘤腺病毒Ad-DeltaMR⑶的毒性(Control of ElA under an E2F—1 promoter insulated with the myotonic dystrophy locus insulator reduces the toxicity of oncolytic adenovirus Ad-Delta24RGD)", Cancer Gene Therapy 2006, vol. 13，pp. 696-705)。通过用Pac I消化质粒pVK503然后转染293细胞构建了 AdwtRGD， 所述质粒PVK503含有Ad5的完整基因组并具有用RGD修饰的纤维(参见I. Dmitriev等， “具有遗传修饰纤维的不依赖于腺病毒接收的载体通过利用柯萨奇病毒和腺病毒的细胞进入机制显示出增大的趋向性(An adenovirus receiving-independent vector with genetically modified fibres demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus cell entry mechanism)”，J. Virol. 1998, vol. 72, pp.9706-13)。实施例3、腺病毒IC0VIR17的构津为了产生该腺病毒，使用了腺病毒质粒pIC0MR17。为了产生该质粒，将来自于质粒pIC0MR15的腺病毒纤维基因在酵母中用从Spel/PacI消化的质粒pAdwtRGD-PH20获得的后面跟有透明质酸酶PH20基因的纤维基因通过同源重组代替。腺病毒IC0MR15源自于腺病毒AdAMRGD，后者的特征在于在Ela蛋白编码序列中含有Δ 24缺失。这个缺失影响了 Ela与pRB的相互作用。Ad Δ MR⑶还在腺病毒纤维中具有插入的肽RGD，以增加病毒的侵染性。这两种修饰描述在K. Suzuki等，“具有增加的侵染性的条件复制性腺病毒显示出提高的溶瘤效能(Conditionally implicative adenovirus with enhanced infectivity shows improved oncolytic potency)”， Clin Cancer Res 2001, vol. 7, pp. 120-6。从Ad Δ MRGD，将四个E2F-1结合位点和一个Spl结合位点插入到内源Ela启动子中，以控制Ela的表达。通过这种方式获得了 IC0MR15。这种插入通过将基因组的419-422位序列用具有4个E2F-1结合位点和一个Spl结合位点的序列代替来进行，使得最终序列为SEQ ID NO :3和图1(b)中所显示的序列。为了执行这一步骤，通过定向诱变在pEndK/Spe质粒的ElA启动子中产生了一个BsiW I限制性位点(参见J. E. Carette 等，“表达短发夹RNA的条件复制性腺病毒使癌细胞中靶基因的表达沉默(Conditionally replicating adenoviruses expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in cancer cells)，，，Cancer Res 2004, vol. 64, pp. 2663-7)。通过将 BsiffI 切割质粒 pEndK/Spe 与彼此杂交的引物 SplF(5‘ -GTACGTCGACCACAAACCCCGCCCAGCG TCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3‘ SEQ ID NO 5)和SplR(5‘ -GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGAC GCTGGGCGGGGTTTGTGGTCGAC-3‘ SEQ ID NO :6)进行连接，将Spl结合位点导入到该质粒的 Bsiff I 位点内。使用彼此杂交的结合引物 E2FF2 (5 ‘ -GTACGTCGGCGGCTCGTGGCTCTTTCGCGGC AAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTGGTTCGAA-3' SEQ ID NO :7)和E2FR2(5‘ -GTACTTCGAACCACTT TTACGCGCCAAATCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCACGAGCCGCCGAC-3' SEQ ID NO :8)来导入 E2F 结合位点，以产生质粒pEndK415SplE2F2。接下来，通过在酵母中同源重组，导入含有质粒在酵母中复制所必需的元件(着丝粒、自主复制区ARS和选择性标志物URA3)的序列CAU，以产生质粒pEndK415SplE2F2CAU。最后，在酵母中，在用KpnI消化的质粒pEndK415SplE2F2CAU与腺病毒Ad Δ MRGD的腺病毒基因组之间进行同源重组，以构建pIC0MR15Cau。通过将I^acl 消化的pIC0VIR15cau转染到HEK293细胞中，获得了 IC0VIR15。通过用I^cI消化质粒pIC0MR17并转染到HEK293细胞中，产生了含有与 IC0VIR15相同的修饰并加上在腺病毒纤维基因后插入透明质酸酶基因的IC0WR17病毒。 AdwtRGD-PH20和IC0MR17基因组的正确结构通过用Hind III进行限制性酶切来验证。此夕卜，使用特异性引物对PH20基因区域进行测序。插入到IC0VIR17和AdwtRGD_PH20基因组中的完整盒与IC0VIR15和AdwtRGD基因组的比较显示在图1 (c)和SEQ ID NO :4中。PH20蛋白编码序列落于kozak序列与聚腺苷化序列之间。_仿丨丨4、iM寸铺綱碰IS PH20書艤胃汰肺綱碰隨性白· 溶蛋白为了证实含有透明质酸酶PH20基因的腺病毒表达具有透明质酸酶活性的可溶蛋白，使用可以感染80%以上的感染复数(20M.0. I)将A549细胞系的培养物用病毒 AdwtRGD, AdwtRGD-PH20、IC0VIR15或IC0VIR17感染。感染后M小时，将感染培养基用新鲜培养基替换。然后，在又一个M小时后，收获新鲜培养基(或上清液)，并按照制造商的说明书，在Amicon Extreme柱(Millipore，Billerica，the USA)中过滤对其进行浓缩。将浓缩的上清液与透明质酸溶液(1. 5mg/ml)在含有0. IM NaCl和0. 05% BSA的磷酸盐缓冲液(pH = 6)中，在37°C温育过夜。通过在15%聚丙烯酰胺凝胶中电泳来分析消化的透明质酸(参见M. Ikegami-Kawai等，“通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对透明质烷寡糖进行微量分析及其在透明质酸酶活性测定中的应用(Microanalysis of hyaluronan oligosaccharides by polyacrylamide gel electrophoresis and its application to assay of hyaluronidase activity)，，，Analytical biochemistry 2002, vol. 311, PP. 157-65)。将透明质酸消化的寡糖产物用30分钟内固定在爱茜蓝溶液中的凝胶基质中。 最后，将寡糖用硝酸银染色。结果显示在图3中。结果证实，用含有透明质酸酶PH20基因的腺病毒(AdwtRGD-PH20和IC0MR17)感染的细胞的上清液，含有能够将透明质酸(高分子量多糖)消化成5至50个以上二糖重复单元的寡糖的可溶性蛋白。实施例5、表达透明质酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒对病毒复制和体外细胞毒性没有介导效应为了证实透明质酸酶PH20基因的插入不影响病毒复制，将A549和SKMeH8肿瘤细胞系用溶瘤腺病毒IC0MR15或IC0MR17感染。在感染后4小时，将感染培养基用新鲜培养基替换。在感染后不同时间收获总细胞提取物，并将它们冻融三次以释放病毒。细胞提取物中的病毒量通过HEK293感染和抗六邻体抗体染色来测定(参见M. Maiem同上)。结果显示在图4中。透明质酸酶PH20基因的插入不影响腺病毒IC0WR17的复制，因为该病毒显示出与腺病毒对照相同的复制。为了证实透明质酸酶PH20表达对溶瘤腺病毒体外细胞毒性的影响，将来自PC3 和SKMel-观肿瘤细胞系的细胞用病毒IC0MR15或IC0MR17的连续稀释液感染。在感染后5和6天，分别用分光光度计评估蛋白的量作为细胞存活的指示。结果显示在图5中。IC0WR17在这两种肿瘤细胞系中的裂解活性与IC0WR15的活性相同，表明透明质酸酶 PH20表达在体外不提供任何溶瘤优势。種· 6 铺綱碰IS PH20胃剛雜隱髓捕力碰砠6. 1.使用移植了 SKMel-观肿瘤的Balb/c种系无胸腺小鼠进行了体内实验。将总共切106个SKMel-观细胞系的肿瘤细胞皮下注射到小鼠的各胁中。21天后，将具有肿瘤的小鼠(肿瘤体积为150mm3)分配到不同实验组中(每组η = 10)。对照组的肿瘤组接受盐水缓冲液(20 μ 1)的单次肿瘤内注射。用AdwtRGD-PH20处理的组的小鼠接受每个肿瘤 IxlO8个该病毒转导单位(相当于&109个病毒粒子或vp)的肿瘤内注射(20μ1)。每两天或三天使用卡尺测量肿瘤，并按照下述公式计算肿瘤体积V (mm3) =A(mm)X B2 (mm2) χ ρ/6, 其中A是较长或纵向长度，B是横截面长度。图6显示了相对于治疗开始时(第0日)的肿瘤生长百分数。结果显示为平均值士S. E。结果之间差异的统计学显著性使用不匹配数据的非参数Marm-Whitney检验来计算。使用方差分析来比较生长曲线。如果ρ <0.05，结果被认为是显著的。用腺病毒AdwtRGD-PH20治疗肿瘤在100%的被治疗肿瘤中产生了肿瘤消退。从注射后第一天起，与对照组相比肿瘤生长的％明显较小。在实验结束时进行的肿瘤分析显示，在用AdwtRGD-PH20注射的肿瘤的细胞外基质中存在的透明质酸量减少。6.2.在另一个实验中，治疗通过肿瘤内注射IC0MR15或IC0MR17来执行。将人类黑素瘤细胞系SKMel-28的肿瘤植入到无胸腺小鼠Balb/C nu/nu中，并在建立后用PBS 或病毒IC0MR15或IC0MR17的IxlO8个转导单位(相当于hlO9个病毒粒子或vp)对它们进行肿瘤内治疗。结果显示在图7中。用IC0WR17治疗显示出溶瘤活性，导致与对照组 (PBS)明显不同的肿瘤生长抑制，ρ <0.05。在实验结束时，切下肿瘤并称重。图7的表显示了实验结束时肿瘤体积、肿瘤生长百分数和肿瘤重量的平均值。用IC0WR17注射的肿瘤的重量明显低于对照组PBS (#p < 0. 05)和IC0VIR15(*p < 0. 05)中的肿瘤重量。6.3.在另一个实验中，治疗通过全身性注射IC0MR15或IC0MR17来进行。将人类黑素瘤细胞系SKMel-28的肿瘤植入到无胸腺小鼠Balb/C nu/nu中，并在建立后用PBS 或病毒IC0MR15或IC0MR17的^cIOiq个物理粒子通过尾静脉注射对动物进行治疗。结果显示在图8中。用IC0MR17治疗显示出溶瘤活性，导致肿瘤生长抑制与对照组PBS(#p < 0. 0001)和IC0MR15rP < 0. 00001)明显不同。在实验结束时，切下肿瘤并冷冻在OCT 中。将来自OCT中冷冻的肿瘤的不同部分用抗α-六邻体抗体(腺病毒衣壳蛋白)处理并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚复染。IC0WR17的抗肿瘤活性与腺病毒在肿瘤内水平的复制相关，这种复制在注射后48日获得的肿瘤中进行评估。用IC0WR17治疗的肿瘤与用 IC0MR15注射的肿瘤相比显示出大的坏死面积、更好的病毒分布和较少的活细胞区域。6.4.在另一个实验中，治疗通过在植入来自人类胰腺腺癌细胞系ΝΡ-18的肿瘤的 Balb/C nu/nu无胸腺小鼠中全身性注射IC0MR15或IC0MR17来进行。在肿瘤建立并达到 60mm3的平均体积后，用病毒IC0VIR15或IC0VIR17的PBS或^101°个物理粒子通过尾静脉对动物进行治疗(10个肿瘤/组)。结果显示在图9中，其中证实了表达透明质酸酶PH20 的腺病毒的抗肿瘤活性增加不限于单一肿瘤类型。图9(a)证实了与PBS组和病毒对照组(IC0VIR15)相比，透明质酸酶PH20的表达也导致腺病毒溶瘤效能的增加。#，表示从第14至第30日与用PBS处理的肿瘤相比有显著性(p ( 0. 02) ；&，表示从第14至第30日与用PBS处理的肿瘤相比有显著性(p ( 0. 05)。*，表示从第12至第30日与用IC0MR15处理的肿瘤相比有显著性(p ^ 0. 02)。在第30日时，将肿瘤切下并冷冻在OCT中，随后用α -六邻体抗体处理并用DAPI复染。为了定量IC0VIR-17的肿瘤内复制水平，通过抗六邻体染色分析了每个肿瘤的5 个活的区域(每个组7/10只动物)，并通过计算机图像分析(ImageJ软件)计算了阳性面积百分数。该分析的结果显示在图9(b)中，其中指出，用IC0WR17处理的ΝΡ-18肿瘤与用 IC0VIR15处理的肿瘤相比显示出明显更大的腺病毒染色面积Γ，显著，ρ^Ο. 01)。棚列7、胃汰诱日月碰__爐_艤白_里学骱兄为了证实透明质酸酶基因的插入基本上不改变溶瘤腺病毒静脉内给药后诱导的毒性模式，使用了叙利亚仓鼠(金仓鼠(Mesocricetus auratus))，因为它是允许人类腺病毒复制的动物模型。仓鼠构成允许人类腺病毒复制的动物模型。使用了雌性、有免疫能力的5周龄动物(5-6只动物/组)。它们在第0日通过头静脉静脉内接受300 μ 1 PBS中的单剂IC0VIR15或IC0VIR17的虹IO11个νρ。对照组用相同体积的PBS注射。给药后5天， 将动物处死，并通过心脏穿刺从每只动物获得全血和血清，以测量肝毒性参数(AST和ALT 酶)，并通过流式细胞术(血像)计数不同的血细胞群体。同时，获取动物的肝脏并固定在 4%多聚甲醛中用于苏木精/曙红染色。肝毒性研究的结果表明这两种病毒都在该模型中诱导一定程度的肝炎症，伴有 AST和ALT转氨酶水平升高。然而，在用IC0WR15或IC0WR17处理的动物之间没有观察到差异。在血液学水平上，与对照动物相比，两种病毒引起中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞群体的升高以及血小板计数降低，但是在IC0WR15与IC0WR17之间仍然没有差异。实施例8、病毒IC0VIR17RGDK的构建为了产生这种腺病毒，使用了腺病毒质粒PIC0WR17RGDK。在该质粒中，野生型腺病毒5的纤维基因已经被其硫酸乙酰肝素结合结构域修饰过的形式代替(多肽序列的氨基酸91KKTK94被91RGDK94代替)。通过在酵母中进行pIC0VIR17的NdeI部分消化产物与EcoRI消化的pBMttKKT质粒(其含有腺病毒纤维的修饰形式，如N. Bayo 等，“用R⑶代替5型腺病毒纤维轴硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合结构域以提高肿瘤侵染性禾口革巴向性(Replacement of adenovirus type 5fibre shaft heparan sulphate proteoglycan-binding domain with RGD for improved tumour infectivity and tarRetinR)，，，Human Gene Therapy 2009，vol. 20，ppl214_21 中所述)之间的同源重组,构建了 pIC0VIR17RGDK 质粒。图10显示了在IC0MR17RGDK情形下修饰91RGDK94的位置以及该腺病毒中纤维蛋白的完整序列。腺病毒 IC0VIR17 含有其中肽 RGD-4C (Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Ph e-Cys :CDCRGDCFC，SEQ ID NO :10)已插入到蛋白的魁结构域的HI-环中(在腺病毒衣壳中非保守进化并且非常暴露的高变环)的腺病毒纤维基因形式。IC0WR17RGDK与IC0WR17完全类似，除了纤维基因中之外，因为IC0WR17RGDK纤维与野生型人类腺病毒5型的差异仅在于将蛋白的轴结构域中的氨基酸91KKTK94用高亲和性整合蛋白结合肽91RGDK94代替(SEQ ID NO 9)。实施例9、具有衣壳修饰的腺病毒IC0VIR17RGDK的溶瘤效果如图11中所示，IC0WR17RGDK中存在的衣壳修饰不改变含有并表达透明质酸酶 PH20基因的溶瘤腺病毒的体外细胞毒性。在两种肿瘤细胞系、即源自于肺腺癌的AM9(图11(a))和源自于胰腺癌的NP-18(图11(b))中，对表达透明质酸酶PH20的两种腺病毒 (IC0MR17和IC0VR17RGDK)的溶瘤活性进行了比较。病毒诱导的细胞病变效应被测定为被感染的细胞单层中蛋白量的降低(BCA方法)。将两种肿瘤细胞系的细胞以10000个细胞/ 孔接种到96孔板中。第二天，将细胞用病毒的连续稀释液感染。将感染的细胞温育6天， 用PBS清洗，并测量孔中留存的蛋白的量。结果显示，在体外，衣壳修饰不显著改变腺病毒的溶瘤活性。棚列10、胃汰诱日月碰_剛·醜_白杯觸_学骱兄为了在表达透明质酸酶的溶瘤腺病毒背景中评估RGDK修饰的影响，使用了不带有肿瘤的有免疫能力的Balb/C小鼠。使用5周龄雄性小鼠(7只动物/组)。它们在第0 日通过尾静脉静脉内接受150 μ 1 PBS中的单剂IC0VIR17或IC0VIR17RGDK的^cIOiq个νρ。 在给药后第7日O只动物/组)和第12日(5只动物/组)，将动物处死并通过心脏穿刺从每只动物获得全血和血清，通过流式细胞术(血像)计数不同的血细胞群体，并测量肝毒性参数(AST和ALT酶)。该研究的结果显示两种病毒在第7日都增加了酶的水平。然而， 这些水平在第12日返回正常值。在IC0WR17和IC0WR17RGDK组之间没有观察到显著差异，尽管在用IC0VIR17RGDK注射的动物组中与IC0MR17组相比观察到较低的肝毒性趋势 (略低的AST和ALT水平)。对于给药后第12天时动物的血液学情况来说，除了用IC0MR17 处理的动物与PBS和IC0WR17RGDK动物组相比淋巴细胞数量较低之外，在白细胞和血小板计数中没有观察到显著差异。
权利要求
1.一种溶瘤腺病毒，其包含插入在其基因组中的编码透明质酸酶的序列。
2.权利要求1的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒是人类腺病毒。
3.权利要求2的溶瘤腺病毒，其中人类腺病毒选自人类腺病毒血清型1至51及其衍生物。
4.权利要求3的溶瘤腺病毒，其中人类腺病毒来自于血清型5。
5.权利要求1-4任一项的溶瘤腺病毒，其中透明质酸酶是哺乳动物睾丸透明质酸酶。
6.权利要求5的溶瘤腺病毒，其中透明质酸酶是人类睾丸透明质酸酶。
7.权利要求1-6任一项的溶瘤腺病毒，其中所述酶的序列缺失膜结合结构域序列，产生可溶性酶。
8.权利要求1-7任一项的溶瘤腺病毒，其中所述酶的序列被插入到溶瘤腺病毒中腺病毒纤维的核苷酸序列之后。
9.权利要求1-8任一项的溶瘤腺病毒，其中所述酶的表达受在动物细胞中有活性的启动子控制。
10.权利要求9的溶瘤腺病毒，其中启动子选自细胞巨细胞病毒启动子、腺病毒主要晚期启动子、SV40启动子、单纯性疱疹病毒胸苷激酶启动子、RSV启动子、EFl α启动子、β -肌动蛋白启动子、人类IL-2启动子、人类IL-4启动子、IFN启动子、E2F启动子和人类GM-CSF 启动子。
11.权利要求1-10任一项的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含组织特异性或肿瘤特异性启动子，其中所述启动子控制Ela、Elb、E2和E4中的一个或多个基因的表达，以实现在肿瘤中选择性复制。
12.权利要求11的溶瘤腺病毒，其中启动子选自E2F启动子、端粒酶hTERT启动子、酪氨酸酶启动子、前列腺特异性抗原启动子、甲胎蛋白启动子和C0X-2启动子。
13.权利要求1-12任一项的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒在选自Ela、Elb、E4和 VA-RNA的一个或多个基因中具有突变，以实现在肿瘤中选择性复制。
14.权利要求1-13任一项的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒在衣壳中具有修饰，以增加其侵染性或靶向肿瘤细胞中存在的受体。
15.权利要求14的溶瘤腺病毒，其中衣壳的修饰是用RGDK结构域替换腺病毒纤维中存在的KKTK硫酸乙酰肝素结合结构域。
16.权利要求1-15任一项的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含对编码透明质酸酶的序列的蛋白翻译进行优化的序列。
17.权利要求1-16任一项的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含促进编码透明质酸酶的序列的表达的序列。
18.权利要求17的溶瘤腺病毒，其中促进表达的序列选自允许RNA加工的剪接受体序列、IRES序列和小核糖核酸病毒2A序列。
19.权利要求1-18任一项的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含插入到其基因组中的一个或多个基因。
20.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-19任一项中所限定的溶瘤腺病毒，以及可药用载体或赋形剂。
21.权利要求1-19任一项中所限定的溶瘤腺病毒在制造用于治疗哺乳动物包括人类的癌症或癌症的恶变前阶段的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及溶瘤腺病毒，其包含插入在其基因组中的编码透明质酸酶的序列。这种腺病毒在肿瘤团块中传播更加有效，因此溶瘤效果提高。静脉内注射本发明的溶瘤腺病毒，获得了肿瘤体积的消退。因此，本发明的溶瘤腺病毒可用于癌症或癌症的恶变前阶段的治疗。
文档编号C12N15/861GK102548584SQ201080028895
公开日2012年7月4日 申请日期2010年5月5日 优先权日2009年5月6日
发明者索尼娅·葛丹卡里奥, 莱蒙·阿莱马尼伯纳斯特里, 马内尔·马里亚·卡斯卡洛皮奎拉斯 申请人:加泰罗尼亚肿瘤研究所, 贝尔韦什生物医学研究学会