专利名称：用于卵母细胞的收集及成熟的方法
技术领域：
本发明一般涉及卵母细胞的收集和成熟的方法。特别是，本发明涉及使用改进的收集和成熟培养基的体外方法，该方法能促进卵母细胞在受精前成熟。
背景技术：
在哺乳动物中，未成熟的卵子(卵母细胞)在卵巢内卵泡中生长和发育。未成熟卵母细胞代谢性连接于体颗粒细胞，后者环绕卵母细胞并滋养卵母细胞发育直至排卵。从本质上讲，卵母细胞的成熟取决于其与其同伴体颗粒细胞的关联，体颗粒细胞不仅支持卵母细胞的生长和发育，而且调控减数分裂的进行。在排卵前发展期间卵母细胞的细胞质和核成熟是密切相关但可差异区分的过程， 对于成功受精、胚胎发育、并且可能还对于胚胎植入的能力至关重要，最终影响妊娠结果。在细胞质发育期间，卵母细胞的直径实质上从约15 μ m增加至100 μ m，相当于体积上增加300倍。在此阶段卵母细胞在转录和翻译上均非常活跃。例如，成熟小鼠卵母细胞含有比平均体细胞约200倍多的RNA和约50-60倍多的蛋白质。卵母细胞中的mRNA含量也高，与体细胞中大约2-3%的含量相比，为约15-20%。卵母细胞的核成熟发生在促性腺激素黄体生成素激增之后，并且包含核膜溶解、 染色体浓缩、之后的染色体在赤道板的定位、及纺锤体中微管的组织。在西方国家，现在相当比例的儿童使用辅助生殖技术、包括使用体外受精(IVF) 出生。IVF—般采取以下形式刺激妇女卵巢以产生多个生长卵泡，从这些正准备排卵的生长的大卵泡中收集卵子，体外用精子接触收集的卵子并将产生的胚胎引入至子宫。卵母细胞的体外成熟(IVM)是IVF的辅助疗法，其大大降低了治疗期间投药促性腺激素的需求。 IVM包含从接受低水平促性腺激素或甚至无促性腺激素的患者体内小一些的卵泡中取出卵子。用于获取卵子的过程需要修改的病人管理系统和卵子收取步骤。在标准IVF步骤中所用的大剂量促性腺激素能够导致卵巢过度刺激综合征 (OHSS)的状况，该病征发生于进行IVF周期的约5%的妇女。OHSS通常是温和和自我限制的。在某些情况下，需要紧急医疗救护。在病情严重时，病征能具有潜在的生命危险，需住院治疗、静脉输液、止痛及其他药物治疗。在极少数情况下，可能会发生自腿部血块的肺栓塞或严重脱水的并发症。具有多囊卵巢综合征病征的妇女需要IVM优先于IVF，以避免施用促性腺激素或任意其他卵巢卵泡刺激剂所导致的卵巢过度刺激。IVM也适用于在不孕症治疗期间优先最小化卵泡刺激的妇女。IVM对于患者也更为方便，因为它需要较少的药物施用，通常可由患者自身完成。IVM也有成本优势，因为药物使用的成本被最小化。然而，在实现妊娠和活产方面，IVM相对于IVF的效率降低。尽管近来已有一些对于患者管理的改善，在实验室技术中进展极少。动物胚胎的体外生产(IVP)有许多目的，如家畜和驯化品种的遗传改良、稀有品种的遗传拯救、以及用于操作(如自性精子生产性胚胎、或以体细胞核转移克隆)的平台技术。在体外生产胚胎中的一个重要技术是卵母细胞的体外成熟(IVM)。IVP具有替代当今传统技术，如多发排卵和胚胎移植(MOET)的潜力，其(类似于人类临床应用)需要促性腺激素处理。然而，采用IVP用于育种和其他用途已经为生产可移植阶段胚胎的低效率、此种胚胎胚胎移植之后的不良结果及冻融(储存)此种胚胎之后的不良结果所防碍。因此，培养卵母细胞的新方法和新培养基将是重要的。特别是，用于收集和成熟卵母细胞以改善辅助生殖技术的新方法和新培养基将是特别合乎需要的。在本说明中，任意现有技术的参考不是(且不应被理解为)对于此现有技术形成任意国家内普遍共识的一部分的认可或任何形式的暗示。
发明内容
本发明起源于卵母细胞体外培养基及其组分的研究，该培养基及组分增进了一旦从卵巢收获的卵母细胞的成熟。一方面，本发明提供以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎的一种方法，该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中，自受试者卵巢中收集卵母细胞；(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中，培养卵母细胞，及(c)以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎。另一方面，本发明提供卵母细胞体外成熟的一种方法，该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中，自受试者卵巢收集卵母细胞 ’及(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中，培养卵母细胞。在另一方面，本发明提供一种卵母细胞成熟培养基，该培养基包括(a) 一个磷酸二酯酶抑制剂；及(b)用于诱导卵母细胞成熟的一种配体，其中，在卵母细胞成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。在另一方面，本发明提供包括下列组分的组合产物(a)包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度试剂的卵母细胞收集培养基 ’及(b)包括第二个磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的卵母细胞成
熟培养基；其中，在卵母细胞成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。在另一方面，本发明提供一种诱导卵母细胞成熟的方法，该方法包括在包括磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的成熟培养基中培养卵母细胞，其中成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞，因此使卵母细胞成熟。在另一方面，本发明提供诱导处于减数分裂阻滞状态卵母细胞成熟的一种方法， 该方法包括以足量浓度的配体接触卵母细胞以克服减数分裂阻滞。发明一般说明在此说明书(包括权利要求)中使用术语“包括(comprise) ”、“包括 (comprises) ”、“包括(comprised) ”或“包括(comprising)，，时，它们将被解释为指定所说明的特征、整体、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、整体、步骤、组分或其群组的存在。如此说明书中所使用的，单数形式“一个”包括复数方面，除非上下文明显另有规定。在表达数值范围时，应清楚地理解此范围涵盖范围上限和下限、及在此限制内的所有数值。本发明涉及一种卵母细胞体外收集和成熟的改进方法。已有确切报道，当把收集的卵母细胞放置于包括磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞和/或卵母细胞相关卵丘细胞中细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中、然后在也包括磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中培养卵母细胞时，显著改善了自多种群(包括人类和牛种群)卵巢中收获的卵母细胞的成熟。关于辅助生殖技术，改进的方法允许卵母细胞受精被推迟直至卵母细胞的成熟更接近于在生殖周期中天然发生的情况(与在已知培养基中收集的卵母细胞的成熟相比)。因此，在本发明第一个方面，提供了一种以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎的方法，该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中，自受试者卵巢收集卵母细胞；(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中，培养卵母细胞，及(c)以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎。此外，本发明第二个方面提供一个卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞的细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中，自受试者卵巢收集卵母细胞；(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中，培养卵母细胞。如上面所讨论的，辅助生殖技术的成功很大程度上取决于受精前卵母细胞的成熟。自卵巢收获的卵母细胞当放在培养中时一般进行减数分裂的自发恢复，即进展至核成熟。此核成熟可能经常发生在卵母细胞进行完全细胞质成熟之前。这被认为最终影响受精成功及可能的随后胚胎着床和发育。在这方面，应理解术语“卵母细胞”包括单独的卵母细胞或与一个或多个其他细胞相关联的卵母细胞，如作为卵丘卵母复合体的部分的卵母细胞。因此，根据本发明的第一和第二方面所述的方法使用用于自受试者卵巢收集卵母细胞的培养基，在此也被称作“卵母细胞收集培养基”、“收集培养基”或其变体，其包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞中细胞内cAMP浓度的试剂。此外，根据本发明的第一和第二方面所述的方法使用用于随后培养和成熟收集的卵母细胞的培养基，在此也被称作“卵母细胞成熟培养基”、“成熟培养基”或其变体，其包括第二个磷酸二酯酶抑制剂。如上文所述，收集和成熟培养基都含有磷酸二酯酶抑制剂。在收集和成熟培养基中磷酸二酯酶抑制剂的存在，以及在收集培养基中增加卵母细胞细胞内cAMP的试剂的进一步存在，提供了防止收获卵母细胞发生减数分裂自发恢复的优势。因此，各自的培养基促进了核成熟前的卵母细胞的细胞质成熟和随后的受精过程开始。应理解“磷酸二酯酶抑制剂”意指直接或间接阻断或抑制磷酸二酯酶(PDE)的试齐U，而其作用导致通过3'-磷酸二酯键水解断裂的环核苷酸靶标(例如，CAMP和cGMP)的失活，导致特定环核苷酸的被动积累。抑制剂能够是对于所有磷酸二酯酶同型非选择性的， 或是对于特定同型具选择性的。“磷酸二酯酶同型”指代负责代谢或降解细胞内第二信使(cAMP和cGMP)的同工酶或同型家族。特定的同型能够具有高选择性的细胞内和亚细胞定位。磷酸二酯酶同型的例子包括PDE3和PDE4。能够被用于本发明方法的PDE抑制剂包括PDE的任意非毒性抑制剂，无论性质上是选择性或非选择性。PDE抑制剂可能是蛋白质、抗体、适体、反义核酸、反义寡核苷酸、 siRNAs、多肽、肽、小分子、药物、多糖、糖蛋白和脂类的形式。例如，合适的PDE抑制剂包括， 但不限于，异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、环己喹酰胺、茶碱、AH-21-132、0rg-30029 (Organon)、 0rg-20241 (Organon)、Org-9731 (Organon)、扎达维林、长春西汀、EHNA(MEP-I)、米利酮、 氰胍佐旦、敏喘宁、SK+F 96231、托拉芬群(Byk Gulden)、和非拉司特(Wyeth-Ayerst Pharmaceuticals)。其他PDE抑制剂在本领域内也是已知的。在收集培养基中的PDE抑制剂(“第一个PDE抑制剂”)可以与成熟培养基中的 PDE抑制剂(“第二个PDE抑制剂”)相同或不同。在一实施方案中，收集培养基中的PDE抑制剂是IBMX。在另一实施方案中，成熟培养基中的PDE抑制剂是环己喹酰胺。在一特定实施方案中，收集培养基中的PDE抑制剂是IBMX并且成熟培养基中的 PDE抑制剂是环己喹酰胺。如上面所述，收集培养基还包含增加收集的卵母细胞中细胞内cAMP浓度或水平和/或增加卵母细胞相关卵丘细胞中cAMP浓度或水平的试剂。该试剂可能直接或间接在卵母细胞中和/或在卵母细胞相关卵丘细胞中通过增加cAMP合成或生产、或降低其降解、 或两者来发挥作用。用于测定cAMP合成、生产或降解水平的方法为本领域所已知。在一实施方案中，cAMP合成或生产相对于未处理卵母细胞可能增加了至少10%、 20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70 %,80 %,90 % UOO %,2 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、或 100 倍。类似地，在另一实施方案中，cAMP降解相对于未处理卵母细胞可能降低了至少10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100。增加细胞内cAMP浓度或水平的试剂可能是蛋白质、抗体、适体、反义核酸、反义寡核苷酸、siRNAs、多肽、肽、小分子、药物、多糖、糖蛋白和脂类的形式。例如，增加cAMP合成或生产的试剂包括腺苷酸环化酶的激活剂，如毛喉素。降低cAMP降解的调节剂的例子包括磷酸二酯酶抑制剂如茶碱。在一实施方案中，增加细胞内cAMP浓度或水平的试剂是一个或多个毛喉素、侵入性腺苷酸环化酶和前列腺素E2。根据本发明第一和第二方面所述的方法可能还包括暴露卵母细胞于诱导卵母细胞核成熟的配体的步骤。在一实施方案中，配体的浓度足以克服cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。包括的该配体可能作为卵母细胞成熟培养基组分，或可能是卵母细胞与之相接触的分开的组分或分开的培养基的部分。在后面的情况下，可以在根据本发明第一和第二方面所述方法的步骤(b)之后加入该配体。该配体可能是蛋白质、抗体、适体、反义核酸、反义寡核苷酸、siRNAs、多肽、肽、 小分子、药物、多糖、糖蛋白和脂类的形式。例如，该配体可能包括，但不限于，卵泡刺激素 (FSH)、表皮生长因子(EGF)(包括EGF样肽双调蛋白和上皮调节蛋白)或其功能性同型。可以设想在本发明方法中可能使用一个或多个配体。在一实施方案中，该配体是FSH。在一实施方案中，FSH的浓度大于10mIU/ml。例如，FSH浓度可能在10_200mIU/ml 之间的范围内。在又一个实施方案中，该配体是EGF。在一实施方案中，EGF浓度大于lng/ml。本发明的第一方面涵盖“辅助生殖技术”。本说明书中通篇使用的术语“辅助生殖技术”应理解为意指在人类和动物内包含分离卵母细胞和/或分离精子的任意受精技术，包括使用体外培养的卵母细胞或胚胎的技术(例如卵母细胞体外成熟)、体外受精(IVF ；抽取卵母细胞、在实验室受精及移植胚胎至受体)、配子输卵管内移植(GIFT ；放置卵母细胞和精子入输卵管)、合子输卵管内转移(ZIFT ；放置受精卵入输卵管)、输卵管胚胎移植(ΤΕΤ ； 放置分裂胚胎入输卵管)、腹膜卵母细胞和精子转移(POST ；放置卵母细胞和精子入盆腔)、 胞浆内精子注射(ICSI)、睾丸精子提取(TESE)及显微外科附睾精子抽吸术(MESA)；或用于在人和/或动物内生产胚胎的任意其他体外技术，如核转移、孤雌生殖激活和全能细胞的使用。在一实施方案中，辅助生殖技术用于生产人类胚胎。在另一实施方案中，辅助生殖技术用于生产牛胚胎。在根据本发明第一和第二方面所述的方法中，首先从受试者卵巢中收获或收集卵母细胞。卵母细胞收集能够根据本领域长久已知的标准技术进行。例如，见Textbook of Assisted Reproduction Laboratory and Clinical Perspectives(2003)Editors Gardner, D. K. , Weissman, A. , Howies, C. M.，Shoham，Z. Martin Dunits Ltd，伦敦，英国；禾口 Gordon, I. (2003)Laboratory Production of Cattle Embryos 第二片反 GABI Publishing, 牛津郡，英国。多数卵母细胞收集技术包含使用经阴道超声将吸针插入到卵巢卵泡。通过管路将吸针连接于材料收集阱，而依次收集阱被连接于吸力源(如手动操作注射器或机电式真空源)。通常从多个卵泡分离卵母细胞。照这样，收获的卵母细胞就其发育潜力而言代表着异源群。在本发明方法的一实施方案中，辅助生殖技术包括IVF。IVF涉及卵母细胞的体外受精，其中卵母细胞分离自受试者并在液体培养基中孵育以允许卵母细胞的受精。如上面所显示，对于自合适的雌性收集卵母细胞和卵母细胞体外受精的方法为本领域众所周知。可以设想卵母细胞的受精最好发生在卵母细胞收集步骤之后的大于M小时、但不晚于60小时，以便于卵母细胞成熟度在足够的阶段而最大化IVF方法中随后步骤的成功率。通常，在35_39°C、在收集培养基中保持卵母细胞15-120分钟。然后通常在带有合适气体混合物的37-39°C孵箱中、在成熟培养基中孵育卵母细胞20-60小时。合适的气体混合物的例子包括，但不限于，包括CO2 (体积的1-10% )、以空气或以维持生物活性的比例的 O2和队混合物平衡的气体混合物。然后在成熟培养基中保持卵母细胞成熟16到60小时，通常成熟M-50小时，而在某些情况下成熟观-44小时。将领会的是，成熟时间可能在物种间有所不同。通常，成熟时间将是在这些系统中到达减数分裂阶段中期II的时间，而照这样成熟时间通常将为到达减数分裂中期II阶段中间时间的12小时前至18小时后。合适的时间将为到达减数分裂阶段中期II的3小时前至6小时后。例如，在牛的系统中，不含特异抑制减数分裂进行至中期II的化合物的情况下，IVM时间一般是在18至M小时的范围内。在人的系统中，IVM时间将一般大于30小时，并且大多数通常在30-50小时之间。在一实施方案中，人的IVM时间等于或大于36小时，例如在36_48小时间。在一特定实施方案中，人的IVM时间等于或大于40小时，例如在40-48小时间。在一特定实施方案中，人的IVM时间等于或大于48小时，例如在48_50小时间。在本说明书中全篇使用的术语“受试者”应理解为包括任意雌性受试者(包括人类女性或雌性哺乳动物)。合适的哺乳动物的例子包括灵长类、牲畜(如，马、牛、绵羊、猪或山羊)、伴侣动物(如狗或猫)、实验室试验动物(如小鼠、大鼠、豚鼠)或任意具兽医或经济意义的动物。在一实施方案中，受试者是瘤牛属(Bos indicus)奶牛。在另一实施方案中，受试者是金牛属(Bos Taurus)奶牛。在本发明的这些及其他方面，卵母细胞可能是(例如)部分卵泡、部分卵丘卵母细胞复合体(COC)的卵母细胞或可能是剥光卵母细胞。在本发明方法的一实施方案中，受试者是人类女性，卵母细胞是人的卵母细胞，并且胚胎是人类胚胎。在本发明方法的另一实施方案中，受试者是奶牛，卵母细胞是牛卵母细胞，并且胚胎是牛的胚胎。应领会磷酸二酯酶抑制剂、增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂及诱导卵母细胞核成熟的配体可能用作卵母细胞培养基(包括卵母细胞成熟培养基)的补充物。因此，在本发明第三方面提供了一种卵母细胞培养基，包括(a) 一种磷酸二酯酶抑制剂；及(b) 一种用于诱导卵母细胞核成熟的配体。在一实施方案中，卵母细胞培养基是卵母细胞成熟培养基。在本发明的第四方面提供一种卵母细胞成熟培养基，包括(a) 一种磷酸二酯酶抑制剂；及(b) 一种用于诱导卵母细胞核成熟的配体。其中卵母细胞成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。在某些实施方案中，根据本发明第三或第四方面所述的成熟培养基中的磷酸二酯酶抑制剂可能是如上文所述。在一特定实施方案中，该磷酸二酯酶抑制剂可能是环己喹酰胺。在某些实施方案中，根据本发明第三或第四方面所述的配体可能是如上文所述。 在特定实施方案中，该配体可能是FSH或EGF。每种配体的浓度可能是如上文所述。在本发明第三和第四方面的某些实施方案中，卵母细胞成熟培养基是人类卵母细胞成熟培养基或牛的卵母细胞成熟培养基。在第五方面，本发明提供一种组合产物，包括下列组分(a)包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞的细胞内cAMP浓度试剂的卵母细胞收集培养基；及(b)包括第二个磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的卵母细胞成
熟培养基；其中卵母细胞成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。在本发明这个方面的一实施方案中，试剂增加了卵母细胞细胞内cAMP生产。例如，该试剂可能是毛喉素。在另一实施方案中，该试剂降低了卵母细胞细胞内cAMP降解。在某些实施方案中，成熟培养基中的配体是FSH或EGF。FSH浓度通常大于IOmIU/ ml，而EGF浓度通常大于lng/ml。在本发明第五方面的某些实施方案中，第一个磷酸二酯酶抑制剂和第二个磷酸二酯酶抑制剂不同。例如，第一个磷酸二酯酶抑制剂可能是IBMX而第二个磷酸二酯酶抑制剂可能是环己喹酰胺。在某些实施方案中，第一个磷酸二酯酶抑制剂和第二个磷酸二酯酶抑制剂相同。在某些实施方案中，可能根据本发明方法的任意一个使用本发明的卵母细胞收集和成熟培养基或其组合产物。例如，它们可用于人类或牛的卵母细胞的收集和成熟。本发明的卵母细胞收集培养基还可能被用于冲洗、洗涤和在从受试者卵巢收获卵母细胞期间维持卵母细胞。卵母细胞收集培养基可能包括NaCl、KCl、Mg2SO4, KH2PO4, Ca (乳酸盐)、NaHC03、氨基酸及衍生物、蛋白质(如血清白蛋白)、葡萄糖、丙酮酸和抗生素的一个或多个。如上文所述，该培养基包括一种PDE抑制剂和一种增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂。在某些实施方案中，卵母细胞收集培养基中的PDE抑制剂是IBMX。在一实施方案中，IBMX浓度是在5-5000 μ M之间的范围内。通常浓度在50-1000 μ M之间范围内。在某些实施方案中，增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂是毛喉素。在一实施方案中，毛喉素浓度是在1-2000 μ M之间的范围内。通常浓度在10-200 μ M之间范围内。本发明的卵母细胞成熟培养基使得收集的卵母细胞成熟至受精前的物理阶段，其模拟了在体内生殖周期的排卵期期间由卵巢释放的卵母细胞的成熟度。可能希望应用此培养基的状况的一个例子出现在因为受试者不耐受此激素而需要在体外以卵母细胞成熟激素处理自受试者收集的卵母细胞的时候。本发明涵盖，在收集卵母细胞后、保持卵母细胞于成熟培养基中至少M小时但不超过60小时的一段时期以促进受精前发育。卵母细胞成熟培养基可能包括NaCl、KCl、Mg2SO4, KH2PO4, Ca (乳酸盐)、NaHC03、氨基酸及衍生物、蛋白质(如血清白蛋白)、葡萄糖、丙酮酸和抗生素的一个或多个，并且包括一种PDE抑制剂。成熟培养基还可能包括用于诱导卵母细胞核成熟的一种配体，其中培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。然而，如上所述，应理解卵母细胞成熟培养基不需要包含配体，该配体可能是分开的组分或分开的培养基部分。PDE抑制剂和配体可能如上文所述。在一实施方案中，成熟培养基中的PDE抑制剂是环己喹酰胺。通常，以自 0. 01-100 μ M的范围内的浓度使用环己喹酰胺而通常是在0. 01-50 μ M的范围内。例如，在牛的系统中，合适浓度在10-30 μ M之间，而在人的系统中在0. 1-1. 0 μ M之间。在又一特定实施方案中，诱导卵母细胞核成熟的配体是FSH和/或EGF而FSH和 EGF的浓度分别大于10mIU/ml和lng/ml，而分别小于500mIU和50ng/ml，并优选分别大于 50mIU 和 5ng/ml 而分别小于 200mIU 和 20ng/ml。本发明的卵母细胞收集和成熟培养基的组分及其组合产物可以在合适的(优选无菌的)容器(例如安瓿、瓶、或小瓶)内以多用途或以单位形式分开包装。可以在装填后密封容器。组分可能是分离的形式、或者纯化或半纯化形式，并且可能包含用于稳定性和/ 或组分的使用的另外的添加物。包装多种组分的方法为本领域已知。本发明的收集和成熟培养基及其组合产物不仅适用于人类，而且适用于培养来自其他哺乳动物的卵母细胞和胚胎。因此，本发明不仅可应用在人类辅助生殖技术，而且可用在非人类哺乳动物的辅助生殖技术，及生产非人类哺乳动物胚胎的其他技术，如孤雌生殖激活、体细胞核移植的用途和全能干细胞的用途。在本发明的第六方面，提供一种诱导卵母细胞成熟的方法，该方法包括在包括磷酸二酯酶(PDE)抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的成熟培养基中培养卵母细胞，其中成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞，因而使卵母细胞成熟。根据本发明这个方面，PDE抑制剂和配体及其浓度可能如上文所述。在本发明这个方面的一实施方案中，磷酸二酯酶抑制剂是环己喹酰胺。在某些实施方案中，配体是FSH 或EGF。通常，FSH浓度大于10mIU/ml而EGF浓度大于lng/ml。在第七方面，本发明提供一种诱导处于减数分裂阻滞状态的卵母细胞成熟的方法，该方法包括用足以克服减数分裂阻滞的浓度的配体接触卵母细胞。本发明这个方面的一实施方案中，减数分裂阻滞是cAMP诱导的。根据本发明这个方面的配体及其浓度可能如上文所述。在某些实施方案中，该配体是FSH或EGF。通常，FSH 浓度大于10mIU/ml而EGF浓度大于lng/ml。在本发明第二、第六和第七方面的一实施方案中，方法是辅助生殖技术的一部分。 例如，辅助生殖技术包括体外受精。将参考下列体现了上述本发明一般原则的实验性实施例。然而，应理解下列说明不限制上面说明的一般性。因而，本发明涵盖明显作为在此提供的教导结果的任意及全部变动。
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图1显示在预IVM期无(A)或有(B) IBMX (500 μ Μ)的情况下增加剂量的毛喉素对于预IVM期结束时总COCs (带有完整卵丘外衣(cumulus vestments)的卵母细胞)WcAMP 含量的影响。图2阐明在以增加浓度的毛喉素和IBMX孵育时预IVM期持续时间对于COCcAMP 的影响。图3显示预IVM期持续时间对于收集并孵育具有完整卵丘外衣(COCs)的并在分析前剥光的(DO)那些)卵母细胞内cAMP含量的影响。图4显示在一定时间内的各种预先体外成熟(预IVM)阶段处理对于两种不同类型卵母细胞cAMP含量的影响(A)收集并分析的带有其完整卵丘外衣的(COCs)卵母细胞； 及(B)作为COCs收集但在分析前剥光其卵丘外衣的卵母细胞(DO)。图5显示在各种预先体外成熟(预IVM)和IVM阶段培养基中孵育卵丘-卵母细胞复合体之后对于自发卵母细胞成熟(GV/GVBD)的影响。图6是系列图表，显示对于在各种预IVM和IVM阶段培养基中培养的卵丘-卵母细胞复合体的生发泡(GV)构象的影响。图7显示在各种预IVM和IVM阶段培养基中孵育卵母细胞之后对于卵母细胞-卵丘细胞间隙连接通讯的影响。图8是图表，显示卵泡刺激素(FSH)对于诱导暴露于各种预IVM和IVM阶段培养基的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的减数分裂成熟的影响。图9显示暴露于各种预IVM和IVM阶段培养基的卵母细胞细胞内cAMP浓度。图10显示表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂对于在3型PDE抑制剂存在时卵泡刺激素(FSH)诱导的卵母细胞成熟的影响。图11阐明在预IVM阶段IBMX和增加剂量的毛喉素对于在20 μ M环己喹酰胺存在时在IVM阶段卵母细胞成熟时的卵母细胞发育能力的影响。图12显示两张图，总结在各种预IVM和IVM阶段培养基中存在的cAMP调节剂的存在对于卵母细胞发育能力(即切割并发育至胚泡阶段)的影响。图13显示在各种预IVM和IVM阶段培养基中存在的cAMP调节剂的存在对于胚泡细胞数目的影响。图14显示在以马绒毛膜促性腺激素(eCG)诱导卵泡生长后以及人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导的卵母细胞成熟之后小鼠卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中体内cAMP浓度的比较(A)与在卵母细胞体外成熟(IVM)前的预IVM阶段体外培养的COCs中cAMP浓度比较O小时，包括COC收集和选择)(B)。图15显示在3型PDE抑制剂(环己喹酰胺；1 μ M(A)或0. 1 μ M(B))存在时、增加剂量的FSH诱导卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的减数分裂成熟的效应。图16显示在预IVM和IVM期间cAMP调节剂对于其所需完成卵母细胞减数分裂成熟的时间的影响。图17显示在培养18和22小时后在诱导IVM或自发IVM中成熟的小鼠COCs的减数分裂成熟。图18显示两张图，阐明(在自发或诱导IVM中进行18或22小时IVM的)体外成熟小鼠卵母细胞对于以(第2天)切割率(A)和(第5天)胚泡率(B)测定的卵母细胞发育能力的影响。图19包括图，显示自发IVM与诱导IVM相比对于小鼠胚泡质量的影响。图20显示在预IVM和IVM期间使用不同cAMP调节剂对于小鼠卵母细胞发育能力的影响。图21显示体内以诱导IVM或以自发IVM成熟的小鼠卵母细胞的发育能力。图22提供的图显示在以源自以诱导IVM或以自发IVM体内成熟的卵母细胞的胚胎移植的小鼠中，诱导IVM对于妊娠结果(A-C)和胎儿发育(D-E)的影响。图23是说明，总结诱导IVM与传统IVF(体内成熟卵母细胞)和标准自发IVM相比的关键概念以及这三种方法在生成胎儿中的相对效率。
具体实施例方式实施例1在卵母细胞的收集和成熟培养基中的cAMP调节剂对于牛卵母细胞成熟动力学的影响卵母细胞质量对于胚胎发育起重要作用。例如，发明者已显示体内成熟卵母细胞导致比体外成熟的卵母细胞更高的胚泡百分数。不幸的是，目前体外成熟技术还不完善。在体内，卵母细胞发育能力是在卵泡的生长和发育期间逐渐获得的。然而，发明者已显示了自卵泡收回的卵母细胞能够自发克服减数分裂阻滞，因而在细胞质完成成熟前进展到中期II。尽管在从卵泡分离后未成熟卵母细胞能恢复减数分裂，细胞质成熟滞后于核成熟。发明者推测，允许未成熟卵母细胞有更多的时间以完成细胞质成熟将改善体外卵母细胞发育能力。一个可能的改善卵母细胞发育能力的策略是体外保持其减数分裂阻滞一段延长时期、而不是使其恢复减数分裂。不希望为理论所约束，发明者假定此延迟给予卵母细胞进行细胞质修改(如mRNA和蛋白质的储存、形态的变化、超结构重构)的时间，并且可能增强将被用于下游辅助生殖应用的未成熟卵母细胞起始群落的同步化。在这方面，发明者测试了在收集和处理(成熟)培养基中包括cAMP调节剂对于卵母细胞成熟动力学(如牛卵母细胞的细胞内cAMP水平、卵母-卵丘细胞间隙连接通讯、核成熟及胚胎发育)的影响。材料和方法除非另作说明，所以化学品和试剂购自Sigma(圣路易斯市，密苏里州，美国)。卵母细胞收集和选择-预体外成熟(预IVM)阶段自本地屠宰场收集牛卵巢并在温盐水(30_35°C )中转运至实验室。汇集并随机使用在一天内收集的所有卵巢。选择(直径在2至8mm的)卵泡腔用于通过18号针头和 IOml注射器吸取。吸取带有其完整卵丘外衣的卵母细胞(COCs)。在分析前剥去一个亚群的COCs的卵丘外衣(DO)。进行2个小时的吸取和随后选择步骤(预IVM期)，在此，在不同培养基(称为“预IVM期培养基”或“预IVM培养基”)中处理卵母细胞(COCs和DOs)。这些包括在卵泡液中或在两类收集培养基中处理卵母细胞。用于卵母细胞吸取和选择的收集培养基包括 (1)添加有50 μ g/ml庆大霉素和0. 2mg/ml无脂肪酸牛血清白蛋白(FAF-BSA ；ICPbio Ltd, 奥克兰，新西兰)的牛卵母细胞收集培养基(称为“牛VitroMat”( "Bovine VitroMat”)， Cook Australia,Eight Mile Plains，昆士兰，澳大利亚)；或( 添加有两种cAMP调节剂 (即腺苷酸环化酶激活剂，毛喉素(100 μ M)和非特异性PDE抑制剂，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX) (500 μ M))的同一培养基。c AMP调节剂的毫摩尔储存浓缩物被贮存在-2 0°C，溶解于无水二甲基亚砜 (DMSO)。对于每次实验，新鲜稀释包含调节剂的溶液。在预IVM期结束时，在解剖显微镜下选择具有大于5个细胞层的紧凑卵丘外衣及均勻着色胞浆的完整卵母细胞。在体外成熟(IVM)之前，在各自的预IVM期培养基中洗涤 COCs两次，然后在IVM培养基(见下面)中洗涤两次。卵母细胞体外成熟(IVM)阶段用于IVM阶段的基本卵母细胞成熟培养基(也称为“ IVM培养基”或“ IVM阶段培养基”)是牛的成熟培养基(名为Bovine VitroMat, Cook Australia)，一种配方成接近于复制牛卵泡液中的离子组合物的培养基。凡有指明，从储存于-20°C、溶解于DMSO的毫摩尔储存液中，将3型PDE特异性抑制剂环己喹酰胺(20 μ M ；Biomol Plymouth Meeting,宾夕法尼亚州)或表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂AG1478 (Alexis Biochemicals，圣地亚哥，加利福尼亚州)加入到IVM培养基中。所有IVM处理辅以0. lIU/ml的卵泡刺激素 (FSH) (Puregon, Organon,奥斯，荷兰)。在覆盖矿物油的预平衡的300 μ 1液滴中培养COCs 并在39°C和5% CO2的加湿空气中孵育。体外受精和胚胎培养在IVM 之后 24 或 30 小时，用 Bovine Vitroffash (Cook Australia)洗涤 COCs 两次并转移至包含添加青霉胺(0. 2mM ；Sigma)、亚牛磺酸(0. ImM ；Sigma)和肝素Qmg/ml ； Sigma)的体外受精(IVF)培养基(Bovine VitroFert, Cook Australia)的授精平板中。 来自证明有生育力的单个公牛的冷冻精液被用于人工授精。简单讲，将解冻精液在不连续 Percoll 梯度(45% 90% ) (Amersham Bioscience)上铺层并以 700g 离心 20-25 分钟。 移去上清并以500 μ 1 Bovine Vitroffash洗涤精子沉淀并以200g再离心5分钟。精子以 IVF培养基(Bovine VitroFert)重悬，然后以终浓度IxlO6个精子/ml加入至受精培养基液滴(Bovine VitroFert，添加有0. OlmM肝素、0. 2mM青霉胺和0. ImM亚牛磺酸)中。在 39°C>6% CO2的潮湿空气中，以10 μ 1 IVF培养基每COC的密度授精给COCs M小时。在授精后23-Μ小时以轻柔吹吸移去COCs，并且将五个推测的受精卵转移至20 μ 1预平衡Cook Bovine VitroCleave 培养基(Cook Australia)液滴中并在 38. 5°C、在 7% O2,6% CO2、平衡 N2中、在矿物油之下培养五天(第一至第五天)。在第五天，转移5-6组中的胚胎至20 μ 1预平衡Bovine VitroBlast (Cook Australia)液滴中，在38. 5°C、以矿物油覆盖并培养至第八天° 在第 8 天，根据 Stingfellow 禾P Seidel, 1998,Manual of the International Embryo Transfer Society. In. (IETS :萨伏伊，伊利诺斯州，美国)中所示的定义评估胚胎的质量， 而且评估是由经验丰富的牛胚胎学家独立进行并盲评。胚泡差异染色在37°C将胚泡置于0. 5%链霉蛋白酶以去除卵，然后在％ig/ml磷酸盐缓冲液中的聚乙烯醇(PVA) (PBS/PVA)中简单洗涤。然后在4°C、在IOmM PBS/PVA中的三硝基苯磺酸中孵育无卵胚泡10分钟。随后以0. lmg/ml抗二硝基酚-牛血清蛋白抗体(Molecular Probes，尤金，俄勒网州，美国)在37°C孵育胚泡10分钟，并随后在37°C、置于含碘化丙啶的豚鼠血清中5分钟。洗涤并在37°C下、在10μ g/ml碘化丙啶中孵育胚泡20分钟(以染色滋养外胚层)，然后在4°C、以100%乙醇中的双苯酰亚胺(Hoechst 33342 ； Sigma-Aldrich)孵育过夜(以染色内细胞群(ICM)和滋养外胚层)。然后将胚泡整体固定在显微镜玻片上PBS中的80%甘油液滴内，并且用指甲油密封盖玻片。然后在配置有紫外滤光片和附带数码相机的400χ荧光显微镜(Olympus，东京，日本)下检查胚泡，以确定总体和间隔细胞数，其中内细胞群(ICM)核显示蓝色而滋养外胚层(TE)核染为粉色。测定细胞内cAMP用之前描述和验证的放射性免疫分析法(Reddoch等，1986，Endocrinology 119 879-886)测定COCs和剥光卵母细胞(DOs)(即那些作为COCs培养但其卵丘外衣在分析前被剥去的卵母细胞)的环AMP量。结束时间点后，在VitroCollect (Cook Australia)中洗涤6-10个COCs和21-24个DOs，转移至0.5ml乙醇(100% )并在_20°C储存。在cAMP测定前，涡旋样品30秒并随后在4°C、以3000g离心15分钟。简单讲，上清收集、蒸发、重悬于分析缓冲液(50mM乙酸钠，pH 5.5)并通过加入2 1 ν/ν的三乙胺(AJAX Chemicals，悉尼，澳大利亚)和无水醋酸(BDH Laboratory Supplies，普尔，英国)乙酰化。在适当稀释后一式两份测定cAMP。向样品中加入125I-标记的cAMP (特异活性为2175Ci/mM)和cAMP 抗体(如上述Reddoch等所制备的)并在4°C放过夜。第二天，加入Iml冷100%乙醇并以 3000g离心样品。移去上清并干燥沉淀，并以、计数器进行计数。双份已知浓度样本被用于产生标准曲线0-1024 fmol cAMP)。卵母细胞核形态评估在孵育结束时，剥光COCs并在4%多聚甲醛的PBS(pH 7.4)中固定卵母细胞 30分钟。然后在0. 柠檬酸钠的0. Triton X-100中渗透卵母细胞1小时，然后转移至0.001%4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(核物质的荧光染料)中15分钟。在 PBS+0. 03% BSA中漂洗卵母细胞，固定于玻片上并用400x Olympus荧光显微镜评价核状态。基于已知技术(Chohan 和 Hunter，2003，Anim. R印rod. Sci. 76 :43-51)对生发泡(GV) 和随后的减数分裂发育阶段进行了评估。简单讲，牛卵母细胞的GV染色质分为GV I-核仁和核膜周围的浓缩丝状染色质；GV II-围绕核仁的丝状染色质；GV III-丝状染色质团块分布在细胞核内和核仁消失；GV IV-染色质凝聚成厚块；早期终变期-染色质开始凝聚成一个团块；终变期-染色质已凝聚成一个团块；中期I-四分体在纺锤体上对齐；及中期 II-中期染色质以及一个小的含染色质极体明显可见。卵母-卵丘细胞间隙连接通讯分析如之前所述(Thomas等，2004，In “Biol. R印rod. ”，1142-1149 页)，以钙黄绿素转移至卵母细胞的定量荧光显微镜来测定卵丘-卵母细胞间隙连接通讯(GJC)。在2小时预IVM期后或在预IVM期后面是另外3小时IVM(有或无20 μ M环己喹酰胺)之后测定 GJC0在四个重复试验每个的每个处理组中使用平均数10-12个的卵母细胞。培养之后， 转移 COCs 至在添加有聚乙烯醇(PVA ;0. ;3mg/ml)的无 BSA Bovine VitroCollect (Cook Australia)中新鲜制备的1 μ M钙黄绿素-AM(3' ,6' -二(0-乙酰基)_2' ,7' -二 [N，
16N- 二(羧甲基)氨基甲基]-荧光素，四乙酰氧基甲基酯；C-3100 ；分子探针；尤金，俄勒冈州，美国)溶液。COCs与染料一起培养15分钟，并随后以在无钙黄绿素-AM的Bovine VitroCollect (Cook Australia)中三次洗涤去除未进入染料，并且孵育另外25分钟以使得从卵丘细胞转移至卵母细胞。在荧光显微光度计之前，用剧烈吸打完全剥去卵母细胞的卵丘细胞，以便于只有经由间隙连接转运后限制在剥光卵母细胞内的染料能被测定。在30 分钟剥光时，用荧光光度计-倒置显微镜(Leica，韦茨拉尔，德国)测定卵母细胞中的卵母细胞内钙黄绿素荧光发射。统计学分析使用 Windows 的 Prism 5. 00 GraphPad (GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行统计学分析。以ANOVA后接Dunnett' s或Bonferroni，s多重比较 post-hoc检验评估统计学意义，以鉴定平均值间的个体差异。所有数值以其对应的平均数标准误差(SEM)来显示。结果预IVM期间的牛COCs和Dos的cAMP含量图1至4显示了经一段时间的不同预体外成熟(预IVM)阶段处理对于COCs和卵母细胞cAMP含量的影响。如图IA中所示，在2小时预IVM之后，毛喉素以剂量依赖性方式显著提高了 COCs内cAMP水平(P<0.05)。与卵泡液对照相比，只有最高浓度毛喉素 (100 μ M)给出了类似值。然而，无论0.4μΜ或是2μΜ毛喉素均不显示任何的cAMP水平提高，其与对照处理(不含cAMP调节剂的收集培养基)无显著差异。与IBMX结合时，增加浓度的毛喉素以剂量依赖性方式诱导cAMP(在无IBMX而只有毛喉素的情况下所观察到水平之上的)20倍增长(图1B)。因而，只有毛喉素或IBMX维持但不提高实质上高于对照的 cAMP水平。图2中实验的目的在于检查当以IBMX和增加剂量的毛喉素(10-100 μ M)孵育 COCs时预IVM持续时间对于COC cAMP水平的影响。如图2中所示，在除对照组(无cAMP调节剂的收集培养基)的所有处理组中，在预IVM期间维持了 COC cAMP水平。当在单独收集培养基中孵育COCs时，30分钟之后cAMP水平自14到4fmol/C0C显著下降(P < 0. 05)，并且继续随时间显著下降(0. 4fmol/C0C)长达孵育2小时。以IBMX或毛喉素单独处理COCs 维持了 cAMP水平2小时。然而，当IBMX和增加剂量的毛喉素存在的情况下孵育COCs时，显示cAMP水平高达20倍的戏剧性诱导，并且此cAMP水平增高明显与孵育时间无关。当IBMX 和50或100 μ M毛喉素存在的情况下孵育COCs时显示了最高cAMP水平(大约165fmol/ C0C)。除对照组(无cAMP调节剂)以夕卜，COC中增加cAMP并无时间效应。图3中实验的目的在于检查卵母细胞(在预IVM后剥光的COCs)中的cAMP水平及在延长预IVM阶段的孵化时间、在cAMP调节剂存在时这些水平如何变化。如图3所示， 在孵育30分钟后，与对照(0. 5fmol/卵母细胞，P < 0. 05)相比，当COCs在IBMX和10,50 或100 μ M毛喉素存在的情况下孵育时，cAMP水平明显更高(12fmol/卵母细胞)。2小时后，与对照相比(0. Ifmol/卵母细胞，P < 0. 05)，cAMP水平进一步显著增高达到34fmol/ 卵母细胞。看起来，增加预IVM阶段的孵育时间，逐渐导致了在IBMX和高浓度毛喉素存在下卵母细胞内cAMP的大幅增加。图4显示了一段时间的不同预体外成熟(预IVM)阶段处理对于完整COCs和卵母细胞内cAMP含量的影响(A)收集并分析的具有其完整卵丘外衣的卵母细胞(COC)；和(B) 作为COCs收集但分析前剥去其卵丘外衣的卵母细胞(DO)。在纯卵泡液、收集培养基或添加有cAMP调节剂(毛喉素和IBMX)的收集培养基中收集并选择两种类型卵母细胞。数值表示为每个卵母细胞或复合体的平均cAMP浓度士三个重复的SEM，每个处理重复使用6-10 个COCs或21- 个DOs。在带不同字母(A、a、B、b或c)的同一图/卵母细胞类型内的平均值显示不同处理或结束时间点之间的显著不同cAMP量(双向AN0VA，P < 0. 05)。如图4A中所见，在5分钟预IVM期之后，在cAMP调节剂存在时收集的COCs中的 cAMP水平是对照组(即无cAMP调节剂或纯卵泡液)的9倍高(P < 0. 0001)。在预IVM期间(30分钟)和结束时O小时)调整cAMP水平的增加。卵泡液维持了 COCs中的cAMP水平30分钟；然而，在预IVM期结束时水平下降(20士3至10士3fmol/C0C) (P < 0. 05)。对于那些无cAMP调节剂时收集的COCs，在自卵泡中分离卵母细胞之后不久(30分钟时长)， cAMP 水平急剧下降(从 15士4 至 2士 lfmol/COC) (P < 0. 05)。剥光卵母细胞(DOs)被用于评价环绕卵丘细胞对于卵母细胞内cAMP水平的影响 (图4B)。在自卵泡分离后5分钟，所有处理中的卵母细胞内cAMP水平大约是0.9士0. 1。 在预IVM期培养基中进行30分钟后，以cAMP调节剂处理的卵母细胞中的cAMP水平明显高于对照组，而且随孵育时间增加(16士0.1)直至预IVM期结束O小时)。在整个预IVM期间卵泡液维持了卵母细胞内cAMP水平，而对于无cAMP调节剂时收集的卵母细胞，在30分钟内细胞内cAMP水平显著下降并且继续下降直至预IVM期结束(0. 3 士0. 2) (P < 0. 05)。在预IVM阶段的cAMP调节剂和3型PDE抑制对于自发卵母细胞成熟(GV/GVBD) 的影响图5显示了在不同预体外成熟(预IVM)和IVM期培养基中孵育卵丘-卵母复合体后对于自发卵母细胞成熟(GV/GVBD)的影响。如上文所述，在预IVM期培养基中孵育牛C0Cs2小时，然后在有FSH和有或无环己喹酰胺(20 μ M)的情况下培养7小时。然后固定卵母细胞并评估减数分裂进展并分类为 GV(生发泡完整-仍在减数分裂阻滞中)或GVBD (生发泡破裂-减数分裂恢复)。在四个重复试验的每一处理组和时间点中使用平均数45个卵母细胞。每列上存在的字母(a或b) 表明以ANOVA分析后接Bonferrormi，s post hoc检验所确定的平均值之间的统计学差异， P < 0. 05。如图5中所见，与对照(IVM中环己喹酰胺(_))相比，在IVM期间培养基中包括 FSH和环己喹酰胺在所有预IVM处理中显著降低了 GVBD率。然而，在培养基中无环己喹酰胺时，除了在预IVM期间在包括cAMP调节剂的收集培养基中加工的那些卵母细胞以外(其具有明显的GVBD延迟(P <0.05))，多数卵母细胞开始GVBD。这些结果导致发明者调查在预IVM期结束和IVM期间的GV构象变化(见下面)。在预IVM阶段的cAMP调节剂和3型PDE抑制对于卵母细胞生发泡构象的影响图6显示了对于在不同预IVM和IVM期培养基中培养的卵丘-卵母细胞复合体生发泡(GV)构象的影响。暴露卵母细胞于包括纯卵泡液、收集培养基或添加有cAMP调节剂 (毛喉素与IBMX)的收集培养基㈧的预IVM期培养基，然后在有(C，E)或无(B，D) 3型 PDE抑制剂环己喹酰胺(20 μ M)、加卵泡刺激素的情况下延长培养。然后固定卵母细胞并评估在第2、5和9小时的GV构象。在四个重复试验的每个处理组和时间点使用平均数40个卵母细胞。如图6A中所见，在预IVM期结束时O小时)，在卵泡液中培养的(61% 士5)或在添加有cAMP调节剂的收集培养基中培养的(67% 士5) (P < 0. 05)多数卵母细胞在GV II 阶段。然而，在单独收集培养基中加工的卵母细胞具有降低的GV II百分数(P <0.05)并且已经进展至 GVIII (66% 士5) (P < 0. 001)。5小时O小时预IVM和3小时IVM+环己喹酰胺)后，收集的卵母细胞已经在IVM 孵育之前被阻滞在其指定的GV阶段(图6C)。与图6B相比，这表明了在IVM的最先几小时内培养基中有FSH和环己喹酰胺的孵育与培养在只有FSH(IVM-环己喹酰胺)的COCs相比， 防止了 COCs进展至其GV构象。如图6B中所见，在纯卵泡液中加工的卵母细胞进展至GV 111(58% 士8)，而多数在无cAMP调节剂培养基中加工的卵母细胞是在GV 111(41% 士 10) 或在GV IV (52% 士 12) (P < 0. 05)。令人吃惊的是，即使在IVM期间培养基中无环己喹酰胺，在以cAMP调节剂加工时COCs仍能被阻滞在GVII (55% 士3)(图6B，右列)。如图6E、右列中所见，在卵母细胞培养9小时后O小时预IVM和7小时IVM+ 环己喹酰胺)，在包括cAMP调节剂培养基中加工的COCs进展至成熟，多数COCs在GV 11(44 士 3% )或在GV 111(42 士 3%)。这与在纯卵泡液中所选择的卵母细胞相比，其多数卵母细胞是在GV III (63士6)，而与在缺少cAMP调节剂的收集培养基中加工的卵母细胞相比，其卵母细胞已进展至GVIV (51% 士 10) (P < 0.05)(图6E，分别为左栏和中间栏)。9小时后并在单独FSH存在时(IVM-环己喹酰胺)，以cAMP调节剂处理的多数卵母细胞已进展至GV III阶段(58% 士4)(图6D，右栏)，而在纯卵泡液中加工的多数卵母细胞进行至终变期(40% 士4)和M I (38% 士4)(图6D，左栏)。相反地，以缺少cAMP调节剂的收集培养基加工的那些卵母细胞，23% 士6是在终变期阶段而57% 士5已进展至M I阶段(P < 0. 05) (图6D，中栏)。在预IVM和IVM期间的cAMP调节剂对于卵母-卵丘细胞间隙连接通讯的效应在预IVM阶段结束时和5小时卵母细胞培养O小时预IVM和3小时IVM士环己喹酰胺)结束时进行卵母-卵丘间隙连接通讯(GJC)分析。如图7的1至3列所见，在预 IVM阶段O小时)结束时，卵母细胞和卵丘细胞之间的间隙连接通讯水平从约1000(在添加有cAMP调节剂的收集培养基中吹吸和加工卵母细胞时)的荧光强度显著降低至约 400和600(分别在卵泡液或不加cAMP调节剂的收集培养基中吹吸和加工卵母细胞时)(P < 0. 05)。而且，当COCs是在纯卵泡液或不含cAMP调节剂的收集培养基中收集时，在3小时IVM培养(预IVM期之后)后间隙连接通讯水平大大降低。例外是预IVM期间在添加有 cAMP调节剂的收集培养基中加工的COCs，无论在IVM期间有或没有环己喹酰胺(P < 0. 05) (图7，4-9列)。在培养基中包括FSH(及有或没有环己喹酰胺)对维持卵母细胞和其周围卵丘细胞之间的间隙连接通讯水平没有影响。在图7每一列之上存在的字母(a、b、g、h或χ)表明以ANOVA分析后接 Bonferronni' s post hoc检验所确定的平均值之间的统计学差异。预IVM期中的cAMP调节剂和3型PDE抑制对于卵母细胞减数分裂进展至MII阶段的影响图8显示卵泡刺激素(FSH)对于诱导暴露于不同预IVM和IVM期培养基的卵
19丘-卵母复合体(COCs)减数分裂成熟的影响。如上所示，在卵泡液、收集培养基或添加有 100 μ M毛喉素(FSK)和500 μ M IBMX的收集培养基中吹吸和选择卵母细胞2小时。然后在无FSH㈧或有FSH(B)的2种培养基(+/_环己喹酰胺)中培养COCs。然后在20、对和观小时固定卵母细胞并评估减数分裂进展。四个重复试验的每个处理组和时间点中使用平均数45个卵母细胞。如图8A中所见，无FSH时，环己喹酰胺处理延迟了在M小时IVM时卵母细胞减数分裂进展至M II阶段，无论在预IVM培养基中有或没有cAMP调节剂。然而，在预IVM阶段当卵母细胞是在添加有cAMP调节剂的收集培养基中加工时，在IVM 20小时时，83% 士7卵母细胞是在M I阶段，与之相比，当卵母细胞是在缺少cAMP调节剂的收集培养基中加工时， 36% 士 4卵母细胞是在M I阶段(图8A，分别为第9和第3列)。如图8B中所见，有FSH时，环己喹酰胺在延迟卵母细胞进展到M II阶段的抑制效应为IVM培养基中存在的FSH所压制。例如，在有环己喹酰胺而无FSH时检测到GV阶段卵母细胞(图8A)，而在IVM培养基中有FSH的时候检测不到此类卵母细胞。有趣的是，在20 小时的IVM+环己喹酰胺处理后，当在预IVM期间卵母细胞在添加有cAMP调节剂的收集培养基中加工时、72% 士 5的卵母细胞处于M I阶段(图8B，第9列)，与之相比，当卵母细胞在单独收集培养基中加工时、21% 士4的卵母细胞处于MI阶段(图8B，第3列)。在预IVM和IVM阶段后卵母细胞中的细胞内cAMP浓度图9显示了暴露于不同预IVM和IVM期培养基的卵母细胞细胞内cAMP浓度。首先在分析前剥去了卵母细胞的卵丘外衣(DOs)，而随后收集并在三种不同预IVM期培养基 (卵泡液、单独收集培养基和添加有100 μ M毛喉素(FSK)和500 μ M IBMX的收集培养基) 中操作，然后在有或没有3型PDE抑制剂环己喹酰胺QO μ Μ)的情况下延长培养M小时。 数据代表了每DO的平均cAMP水平士四次重复的SEM。在M个DO上进行每个测定。每一列上面存在的字母(a、b、c或d)表明以ANOVA分析后接Durmett’ s post hoc检验所确定的平均值间的统计学差异。如图9所见，在培养M小时后，当预IVM期间在添加有cAMP调节剂的收集培养基中收集并加工卵母细胞时，(与纯卵泡液或缺少cAMP调节剂的收集培养基中所培养的那些相反)，如果环己喹酰胺也存在于培养基中，DOs中的cAMP细胞内浓度显著保持更高(达到 15 倍)(P < 0. 05)。在3型PDE抑制剂(环己喹酰胺)存在时表皮生长因子受体激酶抑制剂对于FSH 诱导的卵母细胞成熟的影响如图10所示，环己喹酰胺对于卵母细胞减数分裂进展的抑制效应为培养基中添加FSH所压制。因此有兴趣检查是否表皮生长因子受体(EGFR)的抗血清会抑制FSH诱导的成熟(减数分裂诱导)，例如通过检查EGFR激酶抑制剂AG1478是否能影响此成熟模式。在这方面，图10显示，有FSH(IOOmIU)、PDE抑制剂环己喹酰胺(20 μ Μ)和增加剂量的EGFR抑制剂AG1478存在时，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂对于卵泡刺激素(FSH) 诱导的卵母细胞成熟的影响。在M小时时，随后固定卵母细胞并评估减数分裂进展。三个重复实验的每个处理组和时间点中使用平均数40个卵母细胞。在每一列或数据点上面存在的字母(a、b或c)表明以ANOVA分析后接Durmett’ s post hoc检验所确定的平均值之间的统计学差异。
如图10所见，在IVM培养基中加入增加剂量的AG1478显著降低了成熟百分数(从 > 80%到大约5% ) (P < 0. 05)，因而完全抑制了诱导反应。这表明在FSH诱导的卵母细胞成熟中需要EGF信号。在预IVM和IVM阶段期间cAMP调节剂对于切割并发育至胚泡阶段的影响如表1中所示，当卵母细胞在含FSH的标准IVM培养基中成熟M小时时，在预IVM 阶段的收集培养基中包括cAMP调节剂与无调节剂相比，改善了切割率(分别为89士2. 0% 禾口 78士2%，P < 0. 05)，并改善了胚泡发育(32士3%禾Π 洸士3%，P < 0. 05)。表 1
预IVM处理卵母细胞数切割率％^ ^t^ Wffi
泡％
卵泡液18689.5 ±1.4a38.5 ± 5.7a
收集培养基20577.8±3.6b26.5±4.0b
收集培养基aab
^20088.5 ± 1.9a32.0 ±2. Iab
+cAMP调节剂注释a’b在同一列内的带不同上标的数值代表统计学显著性差异(P < 0. 05)。数值表示为(平均值士 SEM)。如之前图8中所示，在预IVM阶段以cAMP调节剂预处理卵母细胞、并在IVM培养基中包括环己喹酰胺，在结合存在FSH时延迟了卵母细胞中M II起始发生4小时。因此，在卵泡液、收集培养基或添加有100 μ M毛喉素(FSK)和500 μ M IBMX的收集培养基中吸取和选择卵丘-卵母细胞复合体(COCs) 2小时。然后通过在环己喹酰胺(20 μ Μ)存在的情况下加入FSH使COCs成熟M或30小时。然后在体外受精后评估卵母细胞的发育能力并以第8 天的切割率和胚泡率评估胚胎发育。四个重复实验的每个处理组中使用平均数45个卵母细胞。在每一列上面存在的字母(a、b、χ、y或ζ)表明以ANOVA分析后接Bonferronni ’ s post hoc检验所确定的平均值之间的统计学差异。表2提供了关于胚泡形成百分数的此研结果。表权利要求
1.一种以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎的方法，该方法包括a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度试剂的收集培养基中自受试者卵巢收集卵母细胞；b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中培养卵母细胞；及c)以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该试剂增加了卵母细胞细胞内cAMP生产。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该试剂是毛喉素。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该试剂降低了卵母细胞细胞内cAMP降解。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中该方法还包括暴露卵母细胞于诱导卵母细胞成熟的配体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中配体浓度克服了cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中该配体是卵泡刺激素(FSH)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中FSH浓度大于10mIU/ml。
9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其中该配体是表皮生长因子(EGF)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中EGF浓度大于lng/ml。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂和第二个磷酸二酯酶抑制剂不同。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂是IBMX。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中第二个磷酸二酯酶抑制剂是环己喹酰胺。
14.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂和第二个磷酸二酯酶抑制剂相同。
15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中辅助生殖技术包括体外受精。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中胚胎是人类胚胎。
17.根据权利要求16所述的方法，其中体外受精发生在卵母细胞收集后大于M小时。
18.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中胚胎是牛胚胎。
19.一种体外成熟卵母细胞的方法，该方法包括a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度试剂的收集培养基中自受试者卵巢收集卵母细胞；b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中培养卵母细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中该试剂增加了卵母细胞细胞内cAMP生产。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中该试剂是毛喉素。
22.根据权利要求19所述的方法，其中该试剂降低了卵母细胞细胞内cAMP降解。
23.根据权利要求19至22的任一项所述的方法，其中该方法还包括暴露卵母细胞于诱导卵母细胞成熟的配体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中配体浓度克服了cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。
25.根据权利要求23或权利要求M所述的方法，其中该配体是卵泡刺激素(FSH)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中FSH浓度大于10mIU/ml。
27.根据权利要求23或权利要求M所述的方法，其中该配体是表皮生长因子(EGF)。
28.根据权利要求27所述的方法，其中EGF浓度大于lng/ml。
29.根据权利要求19至观任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂和第二个磷酸二酯酶抑制剂不同。
30.根据权利要求19至四任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂是IBMX。
31.根据权利要求19至30任一项所述的方法，其中第二个磷酸二酯酶抑制剂是环己喹酰胺。
32.根据权利要求19至观任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂和第二个磷酸二酯酶抑制剂相同。
33.一种卵母细胞成熟培养基，该培养基包括a)一种磷酸二酯酶抑制剂，及b)一种用于诱导卵母细胞成熟的配体，其中在卵母细胞成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。
34.根据权利要求33所述的卵母细胞成熟培养基，其中该磷酸二酯酶抑制剂是环己喹酰胺。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的卵母细胞成熟培养基，其中该配体是FSH。
36.根据权利要求35所述的卵母细胞成熟培养基，其中FSH浓度大于10mIU/ml。
37.根据权利要求33或权利要求34所述的卵母细胞成熟培养基，其中该配体是EGF。
38.根据权利要求37所述的卵母细胞成熟培养基，其中EGF浓度大于lng/ml。
39.根据权利要求33至38任一项所述的卵母细胞成熟培养基，其中该培养基是人卵母细胞成熟培养基。
40.根据权利要求33至38任一项所述的卵母细胞成熟培养基，其中该培养基是牛卵母细胞成熟培养基。
41.一种组合产物，包括下列组分a)包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度试剂的卵母细胞收集培养基 ’及b)包括第二个磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的卵母细胞成熟培养基；其中卵母细胞成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。
42.根据权利要求41所述的组合产物，其中收集培养基和成熟培养基是用于人卵母细胞的收集和成熟。
43.根据权利要求41所述的组合产物，其中收集培养基和成熟培养基是用于牛卵母细胞的收集和成熟。
44.一种诱导卵母细胞成熟的方法，该方法包括在包括磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的成熟培养基中培养卵母细胞，其中成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞，从而成熟卵母细胞。
45.一种诱导处于减数分裂阻滞状态的卵母细胞成熟的方法，该方法包括用足以克服减数分裂阻滞浓度的配体接触卵母细胞。
46.根据权利要求19至32、44和45任一项所述的方法，其中该方法是辅助生殖技术的部分。
47.根据权利要求46所述的方法，其中辅助生殖技术包括体外受精。
全文摘要
本发明涉及一种以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎的方法。该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中自受试者卵巢收集卵母细胞；(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中培养卵母细胞；及(c)以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎。本发明还涉及诱导卵母细胞成熟的方法。例如描述了一种包括上面步骤(a)和(b)的卵母细胞体外成熟的方法。本发明还涉及一种包括磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的卵母细胞成熟培养基。还描述了一种包括上面提到的卵母细胞收集和成熟培养基的组合产物。
文档编号C12N5/02GK102482644SQ201080030583
公开日2012年5月30日 申请日期2010年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者F·阿布兹, J·汤普森, R·B·吉克瑞斯特 申请人:阿德莱德研究和创新私人有限公司